Chemical shift perturbation-Experimente

Mit der Resonanzzuordnung in der Hand konnten CSP-Experimente durchgeführt und ausgewertet werden. Dafür wurden ¹H-¹⁵N-TROSY-Spektren in Anwesenheit und Abwesenheit von Liganden aufgenommen. Damit der Einfluss vom Lösungsmittel ausgeschlossen werden konnte, wurden Liganden als Stammlösung in Chloroform behandelt.

Nach dem Verdampfen des Chloroforms im Stickstoffstrom wurden die Liganden mit ²H-¹⁵ N-NqrA-377 im Puffer vermischt.

Von größtem Interesse für die Bindungsstudien mit ²H-¹⁵N-NqrA-377 war natürlich Q1 als die nächste Verbindung zum natürlichen Substrat. Bei den CSP-Experimenten hat sich leider schnell herausgestellt, dass Q1 keine sichtbare Effekte in ¹H-¹⁵N-TROSY Spektrum hervorruft (Daten nicht angezeigt). Dasselbe Ergebnis wurde auch beim Versuch mit der Volllängen-²

H-15N-NqrA erhalten. Warum Q1 trotz deutlicher STD- und ILOE-Effekte keine CSPs hervorruft ist unklar.

Im Gegensatz dazu konnten beim CSP-Experiment mit 400 µM ²H-¹⁵N-NqrA-377 und 400 µM DBMIB wesentliche Änderungen im ¹H-¹⁵N-TROSY-Spektrum beobachten werden Abbildung 3.3.4: ¹H-¹⁵N-TROSY-Spektrum der ²H-¹³C-¹⁵N-NqrA-377 mit der Resonanzzuordnung, pH 7.0.

(Abb. 3.3.5). Es sind Verschiebungen der Signale und Änderung in der Intensität zu sehen.

Insgesamt wurden 15 Aminosäuren identifiziert, die von DBMIB beeinflusst wurden.

Die Lage der Aminosäurereste im Protein konnte anhand der Kristallstruktur von NqrA-377 abgebildet werden. Die Arbeitsgruppe von Prof. Fritz in Freiburg konnte NqrA-377 kristallisieren^[80] und mittels Röntgenstrukturanalyse die 3D-Struktur des Proteins aufklären (Vohl et al, nicht publiziert, PDB-Code: 4U9O und 4U9Q). Mit Hilfe der 3D-Struktur kann die mutmaßliche DBMIB-Bindestelle visualisiert werden (Abb. 3.3.6).

Die DBMIB-Bindestelle wurde ebenfalls mit der vor kurzem aufgeklärten Struktur der Na⁺ -NQR abgebildet (Abb. 3.3.7). In der Na⁺-NQR-Struktur liegt die NqrA-Untereinheit (blau) neben der NqrB-Untereinheit (olivgrün). Der Abstand zwischen der DBMIB-Bindestelle und dem Transmembranteil der Na⁺-NQR bzw. der NqrB-Untereinheit beträgt ca. 25 Å^[18].

Abbildung 3.3.5: ¹H-¹⁵N-TROSY-Spektren der 400 µM ²H-¹⁵N-NqrA-377 mit 400 µM DBMIB (rot) und ohne Zugabe von DBMIB (blau), pH 8.0. Aminosäurereste, die von DBMIB betroffen sind, wurden mit grüner Schrift im Spektrum angezeigt. In den zwei Ausschnitten sind Details vergrößert. Die Spektren wurden bei 295 K an einem 600 MHz Spektrometer aufgenommen.

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Abbildung 3.3.6: Kristallstruktur der NqrA-377 mit den markierten Aminosäureresten (rot), die in der mutmaßlichen DBMIB-Bindetasche liegen. (Kristallstruktur: Vohl et al, nicht publiziert, PDB-Code:

4U9O und 4U9Q)

Abbildung 3.3.7: Kristallstruktur der Na⁺-NQR mit den markierten Aminosäureresten (rot), die in der mutmaßlichen DBMIB-Bindetasche liegen. NqrA: blau, NqrB: olivgrün, NqrC: gelb, NqrD: grün, NqrE: türkis, NqrF: dunkelrot. (Kristallstruktur: Steuber et al.^[18], PDB-Code: 4P6V)

3.3.3 Zusammenfassung und Diskussion

Im vorigen Abschnitt wurde die Chinonbindung an den Na⁺-NQR-Komplex seitens Liganden untersucht, indem die Affinität, Stöchiometrie und Inhibition quantifiziert wurden. In diesem Anschnitt wurde die Chinonbindestelle seitens des Proteins charakterisiert.

Die verkürzte NqrA-Version, NqrA-377, die eine bessere Stabilität als die vollständige NqrA aufweist und mit 40 kDa auch bessere NMR-Eigenschaften als NqrA (51 kDa) besitzt, konnte in ²H-¹³C-¹⁵N-markierter Form und genügender Menge (~ 7 mg) hergestellt werden. Aus den 377 Aminosäureresten in NqrA-377 konnten 306 in ¹H-¹⁵N-TROSY bei pH 7.0 als Amidsignale erkannt werden. Die Tatsache, dass nur ca. 86 % der erwarteten Amide (Prolinreste sind nicht sichtbar) zu sehen sind, könnte an den Relaxationseigenschaften der unsichtbaren Bereiche liegen. Wenn die Relaxation zu schnell passiert, werden die NMR-Signale zu breit, bis sie nicht mehr zu erkennen sind. Ein anderer Grund könnte der Rücktausch von Deuterium und Wasserstoff bei den Amiden sein. Bei manchen Proteinen kann der Rücktausch mehrere Wochen bis Monate bei Raumtemperatur dauern. Wenn Amide bei den Experimenten deuteriert vorliegen, sind sie mit ¹H-¹⁵N-TROSY-Experiment unsichtbar.

Bei der Resonanzzuordnung der NqrA-377 wurden 45 % (171) der Aminosäuren in ¹H-¹⁵ N-TROSY-Spektrum identifiziert. Die relativ niedrige Zahl kommt durch den großen Überlapp der Signale in den 3D-Spektren und durch die vielen fehlenden Amidsignale zustande. Im Zuordnungsverfahren entstehen viele einzelne Fragmente durch die fehlenden Amidsignale.

Die kleineren Fragmente sind in der Regel schwer der Aminosäuresequenz zuzuordnen, da sie wenig bis gar keine sequenzielle Information enthalten.

Anhand der Resonanzzuordnung konnte die DBMIB-Bindetasche an der NqrA-377 identifiziert werden. Es wurden 15 Aminosäuren gefunden, die an der Bindung mit DBMIB beteiligt sind. Die meisten dieser Aminosäuren liegen kompakt in einem Bereich des Proteins, was eine unspezifische Wechselwirkung ausschließt. Wenige Aminosäuren, die außerhalb des Bereichs liegen, könnten z.B. auf eine kleine pH-Änderung zurückgeführt werden, eine hydrophobe Interaktion oder auch auf einen weitreichenden Effekt, der durch eine Konformationsänderung unter DBMIB-Bindung entsteht. Da früher in dieser Arbeit gezeigt wurde, dass DBMIB und Q1 in unmittelbarer Nähe zueinander binden, ist es nahliegend zu vermuten, dass Q1 und DBMIB sich die gleiche Bindetasche teilen. Die Anwesenheit der chemical shift perturbation-Effekte im Fall von DBMIB könnte auf die zwei schweren Brom-Atome in DBMIB zurückgeführt werden, die größere Wirkung auf NqrA-377 ausüben, als der Q1-Ligand.

66 Na⁺-Transport in lebenden V. cholerae-Zellen Die Lage und die Entfernung (ca. 25 Å) der Chinonbindestelle vom Transmembranteil der Na⁺-NQR in der Kristallstruktur von Steuber et al.^[18] würde bedeuten, dass das natürliche Substrat Q8 (ca. 40 Å) während der Bindung an die NqrA zum Teil in der Membran bzw.

Transmembranteil der Na⁺-NQR liegen soll. Die hydrophobe NqrB-Untereinheit würde gut für diese Rolle passen. Diese gleichzeitige Chinonbindung an die NqrA- und NqrB-Untereinheit könnte die Ergebnisse von den früheren Studien erklären, bei welchen eine Chinonbindung an die NqrB postuliert wurde^[31,32], sowie einen möglichen Mechanismus für den Elektronentransfer von Riboflavin auf der NqrB an das Ubichinon anbieten.