Das Enzym Na⁺-transportierende NADH:Chinon-Oxidoreduktase (Na⁺-NQR)

Die Na⁺-transportierende NADH:Chinon-Oxidoreduktase (Na⁺-NQR) ist ein besonderer Membranproteinkomplex und das erste Enzym in der Atmungskette von V. cholerae^[14,15] (Abb.

1.2). Na⁺-NQR oxidiert NADH aus dem Citratzyklus und gibt die Elektronen an Ubichinon weiter. Na⁺-NQR ist strukturell nicht verwandt mit dem Komplex I (H⁺-transportierende NADH:Chinon-Oxidoredukatse) auf dem Niveau der primären Struktur und im Gegensatz zu Komplex I ist die freigesetzte Redox-Energie an den Na⁺-Transport über die Membran, und nicht an den H⁺-Transport gekoppelt. Das reduzierte Chinon wird weiter vom bc1-Komplex oxidiert, der anschließend unter Beteiligung von Cytochrom c die Elektronen an cbb3 -Cytochrom-c-Oxidase weitergibt. Die cbb3-Cytochrom-c-Oxidase wird im letzten Schritt von Sauerstoff oxidiert, welcher dabei zu Wasser reduziert wird. Die bc1- und cbb3-Enzyme koppeln die Energie des Elektronentransfers an den H⁺-Transport über die Zellmembran. In der Summe leistet also die Atmungskette von V. cholerae den Transport von Na⁺ und H⁺ über die Membran und die entstehenden H⁺- und Na⁺-Gradienten werden dann weiter für die Energieversorgung der Zelle verwendet. Die Na⁺-NQR ist ein primäre Na⁺-Pumpe in V. cholerae, jedoch kann die Na⁺-Extrusion ebenfalls unter Verwendung des H⁺-Gradienten erreicht werden, wobei H⁺/Na⁺ -Antiporter eine aktive Rolle spielt^[13]. Dies wurde während der Studien mit V. cholerae-Stamm mit dem deletierten Na⁺-NQR-Gen (Δnqr) bestätigt, wobei die V. cholerae-Physiologie deutlich betroffen war, jedoch nicht der Na⁺-Transport^[16].

Die Na⁺-transportierende NADH:Chinon Oxidoreduktase (Na⁺-NQR) ist ein Membranproteinkomplex bestehend aus sechs einzelnen Polypeptiduntereinheiten und einer Reihe von Redox-Kofaktoren mit einem Gesamtmolekulargewicht von 215 kDa (Abb.

1.3A)^[19]. Die sechs Untereinheiten werden als NqrA-F bezeichnet und sind miteinander nicht kovalent verbunden. Die Na⁺-NQR ist ein integrales Membranprotein, das sich in der inneren Membran von V. cholerae befindet. Der Komplex kommt neben dem Vibrio cholerae-Bakterium außerdem in Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus und anderen halophilen Bakterien vor^[20-22].

Abbildung 1.3: A: Schema der Na⁺-NQR mit dem mutmaßlichen Elektronentransfer (rote Pfeile) ^[17,18]. Q: Ubichinon; RF: Riboflavin. B: Strukturformeln der Kofaktoren der Na⁺-NQR.

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6 Das Enzym Na⁺-transportierende NADH:Chinon-Oxidoreduktase (Na⁺-NQR) Zu Beginn dieser Arbeit war keine 3D-Struktur von Na⁺-NQR bekannt. Ende 2014 wurde jedoch eine Kristallstruktur mit einer Auflösung von 3.5 Å von Steuber et al. publiziert (PDB-Code: 4P6V)^[18]. Aus der 3D-Struktur der Na⁺-NQR wird ersichtlich, dass Transmembranteil des Komplexes mit den Untereinheiten NqrB, NqrD und NqrE dargestellt ist. NqrC- und NqrF-Untereinheiten sind hydrophil und sind mit der Membran durch eine einzelne Transmembranhelix verbunden. NqrA ist ebenfalls hydrophil, ist jedoch mit der Membran nicht assoziiert. NqrA und NqrF befinden sich an der zytoplasmatischen Seite der Na⁺-NQR, wobei NqrC an der periplasmatischen Seite lokalisiert ist. Laut der Na⁺-NQR-Struktur ist die NqrA tief in der NqrB-Untereinheit verankert^[18]. Es wurde jedoch beobachtet, dass die NqrA auch außer dem Na⁺-NQR-Komplex existieren kann^[23]. Später konnte NqrA separat in V. cholerae exprimiert werden^[24].

Wie es oben bereits erwähnt wurde, ist die Na⁺-NQR ein Teil der Atmungskette. Einerseits wird NADH in NAD⁺ oxidiert, anderseits wird Ubichinon in Ubichinol reduziert. Elektronen in Na⁺-NQR werden von NADH auf Chinon mit Hilfe von sechs bekannten Redox-Kofaktoren weitergegeben: zwei kovalent gebundene FMN in der NqrB und NqrC^[25-27], ein nicht kovalent gebundenes FAD und ein 2Fe-2S-Cluster in der NqrF^[20,28], ein nicht kovalent gebundenes Riboflavin in der NqrB^[24] und ein weiteres Fe-Zentrum, das 2014 von Steuber et al. entdeckt wurde^[18] (Abb. 1.3A und B). Der vermutete Elektronenweg nimmt seinen Anfang an der F-Untereinheit, die für die NADH-Bindung verantwortlich ist^[29]. Die Elektronen von NADH werden an FAD übertragen, von wo sie an den 2Fe-2S-Cluster weitergegeben werden. Darauf folgend werden Elektronen auf das Fe-Zentrum, das sich zwischen den D- und E-Untereinheiten befindet, übertragen^[18]. Danach werden die Elektronen vermutlich an das FMN der NqrC-Untereinheit und anschließend an das FMN der NqrB-Untereinheit transferiert^[17,30]. Es wurde gezeigt, dass eine weitere Elektronenübertragung zum Riboflavin erfolgt, das an der NqrB lokalisiert ist^[24]. Der finale Schritt im Elektronentransfer, Reduktion von Ubichinon, sowie die Bindungsstelle von Ubichinon waren zu Beginn dieser Arbeit unbekannt. Durch Studien mit Punktmutationen in der NqrB wurde postuliert, dass die katalytische Bindestelle für Chinone auf der NqrB-Untereinheit lokalisiert sein könnte oder zumindest, dass NqrB ein Teil des Reduktionsmoduls ist^[31]. Später wurde diese Hypothese von Juarez et al.

weiterentwickelt und gezeigt, dass Mutationen in Aminosäureresten Gly140 und Gly141 in der NqrB die Reduktion des Ubichinons fast komplett verhindern^[32]. Da Riboflavin sich auch auf NqrB befindet, ist es nahliegend, dass die Chinonbindestelle in der Nähe zum Riboflavin liegen könnte. Es gab auch die Annahme, dass Riboflavin direkt Ubichinon zum Ubichinol reduziert^[17].

Auch wenn viele Aspekte des Elektronentransfers in Na⁺-NQR bekannt sind, ist es nicht klar, wie die Redox-Energie an den Na⁺-Transport gekoppelt ist. Obwohl es zahlreiche Beispiele von aufgeklärten Mechanismen in anderen Atmungskomplexen gibt^[33-35], bleibt der fundamentale Mechanismus des Na⁺-Transports in Na⁺-NQR unbekannt. Die Mechanismen können sich stark unterscheiden, da die meisten Atmungskomplexe H⁺ transportieren und nicht Na⁺. Die Aufklärung dieses Mechanismus würde deshalb wichtige Informationen für das allgemeine Verständnis des Kationtransports in Organismen liefern^[30].