Affinität der Bindung von Q 1 und HQNO an die NqrA-Untereinheit mittels

Zur Unterstützung und Vervollständigung der Ergebnisse, die mit STD-NMR und interligand NOEs erhalten wurden, wurden in diesem Teil der Arbeit die Affinität der Bindung von Q1 und HQNO zu NqrA-Untereinheit mittels SPR-Spektroskopie (Biacore) untersucht.

Dafür wurde NqrA auf einem CM5-Chip (GE Healthcare) immobilisiert, und Q1 und HQNO wurden als Analyten über den Chip gespült. Auf diese Weise können Q1 und HQNO chemisch unmodifiziert angewendet werden. Da die beiden Liganden aber kleine Moleküle sind (250 Da und 320 Da entsprechend) musste möglichst viel NqrA auf dem Chip immobilisiert werden, damit ein größtmögliches Signal detektiert wird. Jedoch, sogar mit 16 500 RU von immobilisierter NqrA wurde maximal ein Signal von 9-17 RU erhalten. Bei Q1 (250 Da) würde ein maximales theoretisches Signal 80 RU betragen. Das würde bedeuten, dass ca. 1/5 der NqrA auf dem Chip für die Bindung erreichbar war und zum Signal beigetragen hat.

Sensorgramme von beiden Liganden, Q1 und HQNO, zeigen eine eindeutige Bindung (Abb.

3.2.14, A und C). Für die Bestimmung der Affinität wurden Signale im Gleichgewichtzustand bei den Analytkonzentrationen von 100 nM bis 50 µM analysiert (Abb. 3.2.14, B und D).

Sensorgramme bei höheren Konzentrationen von Q1 bzw. HQNO erreichten kein Gleichgewicht, was auf eine unspezifische Wechselwirkung hindeutet. Bei hydrophoben

Abbildung 3.2.13: Interligand NOEs zwischen 200 µM Q1 und 400 µM HQNO in der Anwesenheit von 25 µM NqrA, pD 8.0. A: Einzelne Zeilen aus dem 2D NOESY-Spektrum. Das dem Diagonalsignal entsprechende Atom ist links oben angegeben und das Diagonalsignal ist im Spektrum mit einem Stern markiert. Das schwarze Spektrum kommt aus dem NOESY-Spektrum aufgenommen in der Anwesenheit von NqrA, das rote Spektrum entspricht dem Spektrum in der Abwesenheit von NqrA. ILOEs sind mit Pfeilen markiert. B: Selektive 1D NOESY-Spektren der gleichen Probe, die NOEs ausgehend von H-3 des HQNO (oben) und OCH3 des Q1 (unten) zeigen.

Bereiche von Interesse sind mit gestrichenen Rechtecken markiert. C: Ein mutmaßliches Schema der Anordnung von Q1 und HQNO aufgrund der ILOEs. Starke, mittlere und schwache ILOEs sind entsprechend als schwarz, grau und grau gestrichen angezeigt. Abbildung übernommen aus Nedielkov et al. ^[95].

Molekülen wie Q1 und HQNO ist das nicht unüblich. Eine kinetische Auswertung der Daten war nicht möglich, da der Effekt einer Re-Bindung von Q1 und HQNO bei dem hohen Immobilisierungsniveau der NqrA die Daten beeinträchtigt.

Wenn die Gleichgewichtsignale an ein one-site binding-Modell angepasst werden, werden eher schlechte Regressionskoeffizienten erhalten (R² = 0.90 für Q1 und R² = 0.74 für HQNO), was auf ein komplexeres Bindungsgeschehen, z.B. eine zusätzliche niedrigaffine Wechselwirkung aufweist. Es wurde deshalb entschieden, die Daten an ein two-site binding-Modell anpassen. Das binding-Modell lieferte sehr gute Regressionskoeffizienten: R² = 0.97 für Q1 und R² = 0.94 für HQNO. Laut der Anpassung hat die Wechselwirkung von Q1 mit NqrA eine hohe Affinität mit KD1 = 124 ± 13 nM und eine zusätzliche niedrigaffine Wechselwirkung mit KD2 = 36 ± 5 µM. HQNO hat einen KD1 = 100 ± 24 nM und einen KD2 = 32 ± 5 µM.

Abbildung 3.2.14: Interaktion des Q1 und HQNO mit NqrA mittels SPR-Spektroskopie. A und B:

Sensorgramme (A) und Gleichgewichtbindungssignale (B) des Q1. C und D: Sensorgramme (C) und Gleichgewichtbindungssignale (D) des HQNO. Für jedes Analyt wurde zwei Messreihen durchgeführt.

Gleichgewichtsignale (B und D) wurden mit einem two-site binding-Modell angepasst. Abbildung übernommen aus Casutt et al. ^[79].

0 200 400 600 800 1000

58 Interaktion der NqrA und der Na⁺-NQR mit Chinonen Die Beobachtung, dass die SPR-Daten deutlich besser an ein two-site binding-Modell angepasst werden, können unterstützt die mit STD-NMR und interligand NOEs erhaltenen Ergebnisse, indem eine weitere Chinonbindestelle vermutet wird.

3.2.5 Zusammenfassung und Diskussion

In diesem Teil der Arbeit wurde die Chinonbindestelle in der Na⁺-NQR lokalisiert und charakterisiert. So wurde es mit STD-NMR-Spektroskopie gezeigt, dass Q1 an die A-Untereinheit der Na⁺-NQR bindet, und somit die früheren Befunde der Arbeitsgruppe von Prof.

Steuber bestätigt. Die Bindung von Q1 wurde weiterhin mit SPR-Spektroskopie verifiziert, wobei zwei Affinitätskonstanten erhalten wurden: KD1 = 124 ± 13 nM und KD2 = 36 ± 5 µM.

Bei weiteren Studien mit zwei Na⁺-NQR-Inhibitoren HQNO und DBMIB wurde ein untypisches Verhalten für kompetitiven Inhibitoren entdeckt. So wurde bei den STD-NMR-Versuchen eine Steigerung der Q1-STD-Effekten in der Anwesenheit von HQNO oder DBMIB entdeckt. Dieses Verhalten zeigte eine Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration und führte zu einem EC50-Wert von 26.7 ± 2.6 für das NqrA-Q1-DBMIB-System und 28.5 ± 11.2 für das Na⁺-NQR-Q1-DBMIB-System. Die Ähnlichkeit der Werte für die isolierte NqrA und den holo-Na⁺-NQR-Komplex ist ein starkes Indiz für biologische Relevanz der entdeckten Interaktion.

Es wurde außerdem eine DBMIB-Inhibitionskonstante (KI(DBMIB) = 53.2 µM) unabhängig davon in der Gruppe von Prof. Steuber mit einem enzymatischen Assay bestimmt, die eine gute Übereinstimmung mit den erhaltenen EC50-Werten zeigt. Das Verhalten bei den STD-NMR-Experimenten wies auf eine nicht kompetitive Inhibition, die seinerseits zwei mögliche Mechanismen der Inhibition nahelegt: allosterische Inhibition mit zwei Chinonbindestellen oder eine erweiterte Chinonbindestelle, an die mehrere Chinonmoleküle binden können. Mit der Verwendung von Q1 und DBMIB/HQNO in der Anwesenheit von NqrA wurde es mit Hilfe von interligand NOEs gezeigt, dass es tatsächlich um eine große Chinonbindestelle geht, an die zwei Chinone gleichzeitig binden können und in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Gleiche Ergebnisse wurden auch mit der gesamten Na⁺-NQR erhalten, was wiederum die Relevanz der Befunde bestätigt.

Obwohl NqrA zwei Chinonbindestellen besitzt, deuten kinetischen Auswertungen der Chinonreduktion auf eine einzige katalytisch aktive Bindestelle^[95]. Die zweite Chinonbindestelle könnte dabei eine Wartestelle für das Ubichinon darstellen, von welcher das letztere an die katalytische Bindestelle weitergeleitet wird. Alternativ könnte die hochaffine Chinonbindestelle permanent von Ubichinon besetzt sein und als Kofaktor dienen, welcher Elektronen an die niedrigaffine katalytische Bindestelle weitergibt.

3.3 Charakterisierung der Chinonbindestelle an der