3 Ergebnisse und Diskussion
3.1.1 Die A-Untereinheit (NqrA) der Na⁺-transportierenden NADH:Chinon-
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, gab es Hinweise, dass die katalytische Chinonbindestelle an der NqrB-Untereinheit der Na+-NQR liegen könnte[31]. Jedoch gab es zu Beginn dieser Arbeit auch praktische Hinweise aus Kollaborationsforschungsgruppen, dass die NqrA-Untereinheit in der Chinonbindung involviert sein könnte. Mit Hilfe eines 3-Azido-Chinon-Derivat wurde die Bindung an die NqrA durch photochemische Markierung gezeigt[79]. Um diese Ergebnisse mit der isolierten NqrA-Untereinheit zu unterstützen, wurde diese Untereinheit einzeln exprimiert und gereinigt.
Expression und Reinigung
NqrA konnte erfolgreich in V. cholerae in der Gruppe von Prof. Steuber (Hohenheim) exprimiert werden[24]. Das dabei genutzte Arabinose-induzierbare pNA1-Plasmid konnte auch in Verbindung mit E. coli BL21(DE3) verwendet werden, wodurch die Handhabung im Vergleich zu V. cholerae deutlich erleichtert wurde und größere Ausbeuten des Proteins zu erwarten waren. Das Protokoll zur Expression und Reinigung der NqrA basierte auf dem Protokoll der Na+-NQR-Reinigung[23]. Da NqrA im Gegensatz zur Na+-NQR ein hydrophiles lösliches Protein ist, wird es lediglich aus dem Zelllysat und nicht aus Membranen isoliert.
Arabinose-induzierbare Genexpression stellt jedoch ein Problem dar, wenn markierte Proteine hergestellt werden sollen. Da Arabinose von E. coli verdaut werden kann, führt es bei Verwendung der unmarkierten Arabinose zum unerwünschten Einbau von 12C- und 1 H-Isotopen in das Protein. Aus diesem Grund wurde das NqrA-Gen aus dem pNA1-Vektor in einen pETDuet1-Vektor der Firma Trenzyme (Konstanz) umkloniert. IPTG, das für das Induzieren von pET-Vektoren verwendet wird, kann im Gegensatz zur Arabinose von E. coli nicht verstoffwechselt werden, was die gleichmäßige Markierung des Proteins garantiert. Eine weitere Optimierung erfolgte durch die Verwendung eines speziellen E.
coli-tuner(DE3)-Stamms (Novagen), der eine passive Diffusion von IPTG in die Zelle ermöglicht und somit eine gleichmäßigere Induktion in der Kultur gewährleistet (siehe 2.1 für Details).
Das Expressionssystem bestehend aus E. coli-tuner(DE3) und pETDuet1-Vektor mit dem NqrA-Gen konnte erfolgreich für die Überexpression von NqrA verwendet werden. So ist auf einem SDS-PAGE-Gel der E. coli-Zellproben eine mit der Zeit zunehmende NqrA-Expression (Abb. 3.1.1) zu sehen. Dabei erreicht die Expressionsrate von NqrA nach 3-4 Stunden ihr Maximum. Aus diesem Grund und um NqrA möglichst vor der Aggregation und dem Abbau zu schützen, wurde die Expression nach 3-4 Stunden abgebrochen und die Zellen wurden aus dem Medium isoliert. Weiterhin wurde bei der Expression eine auf 30 °C reduzierte Temperatur eingestellt, um das Protein weiter zu schützen. Aus 1 L LB-Medium wurden in der Regel ca.
5 g Zellen nach der Expression erhalten.
Das pETDuet1-Konstrukt codiert einen N-terminalen His6-Tag, der mit dem NqrA-Gen über eine Thrombin-Schnittstelle verbunden ist (Sequenz im Anhang 6.1):
His6-Tag-Thrombin-Schnittstelle-NqrA
Nach der Expression erfolgte mit Hilfe des His-Tags und Verwendung von Ni2+ -Affinitätschromatographie die NqrA-Isolation aus dem Zelllysat. Das gebundene Protein wurde mit Imidazol von der Säule eluiert. Die dabei genutzte Imidazolkonzentration hat sich als kritisch herausgestellt. Bei zu hohen Imidazolkonzentrationen (> 250-300 mM) aggregierte NqrA zum größten Teil (Abb. 3.1.2). Die Kontaktzeit mit Imidazol wurde deshalb auf das Abbildung 3.1.1: SDS-PAGE-Gel von E. coli-tuner(DE3)-Zellen mit der überexprimierten NqrA. Die Dauer der Expression ist oben angegeben, 0 Stunden bedeutet, dass die Zellen vor dem Induzieren entnommen wurden. M: Proteinstandardmarker.
Zeit nach der Induktion, h
0 1 2 3 5 17
M 4
NqrA
97 66 45
31
21.5 MW (kDa)
14.4
Minimum verkürzt. Direkt nach Elution von der HisTrap-Säule wurde NqrA dialysiert oder weiter mit Größenausschlusschromatographie gereinigt.
Wie man anhand des SDS-PAGE-Gels sehen kann (Abb. 3.1.3), war NqrA schon nach der Affinitätschromatographie relativ rein. Jedoch, wie schon die ersten Versuche mit NqrA-Reinigung zeigten, wird das Protein vermutlich durch etliche E. coli-Proteasen abgebaut. Das geschieht erst beim Zellaufschluss und nicht bei der Expression selbst. Dies ist daran zu erkennen, dass die Abbaubande im SDS-PAGE-Gel erst nach dem Aufschluss erscheint (vergleiche Abb. 3.1.1 und 3.1.3). Bei dem gereinigten Protein änderte sich außerdem die
Menge an Abbauprodukt nicht mehr, was zusätzlich die Hypothese zum Proteasenverdau unterstützt. Um den Abbau von NqrA zu vermeiden, erfolgten der Aufschluss und die Reinigung möglichst stets gekühlt auf Eis. Der Aufschluss wurde unter Zugabe von
Abbildung 3.1.2: Größenausschlusschromatogramm der NqrA, die mit 500 mM Imidazol von der HisTrap-Säule eluiert wurde. Der größte Teil der NqrA findet sich wegen der von Imidazol hervorgerufenen Aggregation im Ausschlussvolumen.
Abbildung 3.1.3: SDS-PAGE-Gel des NqrA-Eluats von der HisTrap-Säule. M:
Proteinstandardmarker.
Proteaseinhibitoren (Roche) durchgeführt. Trotz aller Maßnahmen erschien die Abbaubande bei jeder Reinigung, der Anteil änderte sich von Reinigung zu Reinigung geschätzt aus den SDS-PAGE-Gelen im Bereich von 10 bis 40 %.
Anschließend zu der Affinitätschromatographie wurde Größenausschlusschromatographie durchgeführt, um Aggregate der NqrA vom NqrA-Monomer zu trennen. Ein typisches Elutionsprofil von der Superdex 200 16/600-Säule ist in Abb. 3.1.4 gezeigt. Wie auf dem SDS-PAGE-Gel zu sehen ist, besteht das Eluat vorwiegend aus der NqrA, die offenbar mehrere verschiedene Oligomere und Aggregate bildet.
Abbildung 3.1.4: A: Ein typisches Größenausschlusschromatogramm der NqrA. B: SDS-PAGE-Gel der entsprechenden Fraktionen vom Chromatogramm oben. M: Proteinstandardmarker.
NqrA-Aggregate NqrA-Monomer
40 60 80 100 120
0 20 40 60 80
Absorptionbei280nm [mAu]
Elutionsvolumen [mL]
1 2 3 4
1 2 3 M 4 5
NqrA 97
66 45 31 21.5 MW (kDa)
14.4 A
B
5
Trotz des Abbauprodukts der NqrA konnte mit dem Expressionssystem bestehend aus pETDuet1 und E. coli-tuner(DE3)-Stamm eine gute Ausbeute von NqrA erreicht werden. So wurden nach der Superdex 200-Säule aus 1 L LB-Medium ungefähr 25 mg Protein erhalten.
NqrA-377
Das NqrA-Abbauprodukt wurde mittels Massenspektrometrie in der Kooperationsgruppe von Dr. Fritz in Freiburg analysiert[80]. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass es sich um zwei C-terminale Abbauprodukte handelt, die 370 bzw. 377 Aminosäuren enthalten, wobei Volllängen-NqrA aus 465 Aminosäuren besteht. Da diese Abbauprodukte keine weiteren Veränderungen mehr zeigten und als Endprodukte der Spaltung erschienen, wurde entschieden, solche verkürzte NqrA-Konstrukte zusätzlich zur kompletten NqrA zu untersuchen. Mit Hilfe der Proteinstrukturvorhersage mit dem Phyre2-Algorithmus wurde für die Weiterarbeit ein Konstrukt mit 377 Aminosäuren ausgewählt (Sequenz im Anhang 6.1), weil es strukturell stabiler schien. Die verkürzte NqrA wird in dieser Arbeit als NqrA-377 bezeichnet. Zum einen versprach das verkürzte Konstrukt eine deutlich bessere Beständigkeit gegen Proteasenverdau und zum anderen sollte ein ca. 10 kDa kleineres Molekulargewicht strukturelle NMR-Studien vereinfachen.
Das Konstrukt für NqrA-377 wurde von GenScript in Form eines pET15b-Vektors gefertigt, der wie auch pETDuet1 ein pET-Expressionssystem ist. Die Expression in LB-Medium wurde im Rahmen der Bachelorarbeit von Tobias Dölle durchgeführt. Im Vergleich mit der vollständigen NqrA zeigte die NqrA-377 wie erwartet eine sehr gute Stabilität gegen Proteasen (Abb. 3.1.5).
Abbildung 3.1.5: SDS-PAGE-Gel des NqrA-377-Eluats von der HisTrap-Säule. –IPTG: E. coli-Zellen vor dem Induzieren; M: Proteinstandardmarker; +IPTG: E. coli-Zellen nach dem Induzieren. (SDS-PAGE-Gel übernommen aus der Bachelorarbeit von Tobias Dölle, 2013)
-IPTG M +IPTG HisTrap-Elution
NqrA-377
118 66 43 29 20 MW (kDa) 212
14
Das Eluat von der HisTrap-Säule zeigte nur eine Bande auf dem SDS-PAGE-Gel. Weitere Größenausschlusschromatographie bestätigte auch, dass NqrA-377 weniger zur Aggregation neigt (Abb. 3.1.6). Dies könnte dadurch erklärt werden, dass der C-Terminus der NqrA laut Strukturvorhersage hauptsächlich aus hydrophoben α-Helices besteht. Die hydrophoben Bereiche könnten zu einer intermolekularen Wechselwirkung und schließlich zu Assoziation und Aggregation der Proteinmoleküle führen. Durch die Entfernung von hydrophoben Bereichen wurde also NqrA-377 als Monomer stabilisiert. Die Ausbeute der NqrA-377 war ähnlich der Ausbeute von NqrA und betrug ca. 25 mg aus 1 L LB-Medium.
Abbildung 3.1.6: A: Größenausschlusschromatogramm der NqrA-377. Es sind kaum NqrA-377-Aggregate vorhanden. B: SDS-PAGE-Gel vom Hauptpeak aus dem Chromatogramm. Es gibt kaum Abbauprodukte oder sonstige Verschmutzungen. (Das Chromatogramm und SDS-PAGE-Gel übernommen aus der Bachelorarbeit von Tobias Dölle, 2013)
NqrA-Strep
NqrA-377 zeigte sich deutlich robuster und stabiler als die vollständige NqrA, jedoch wurde die Abwesenheit von C-Terminus als Nachteil angesehen, besonders für die Bindungsstudien, bei denen die abwesende hydrophobe Domäne eine Rolle bei der Interaktion mit den hydrophoben Chinonen spielen könnte. Die vollständige NqrA konnte leider nicht komplett frei von Abbauprodukt hergestellt werden. Aus diesen Gründen wurde ein NqrA-Konstrukt mit zwei Affinitäts-Tags konzipiert (Sequenz im Anhang 6.1):
His6-Tag-Thrombin-Schnittstelle-NqrA-SSG-Strep-Tag
Neben dem His-Tag am N-Terminus enthält das Konstrukt einen Strep-Tag am C-Terminus.
Der Strep-Tag stellt eine Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-Aminosäuresequenz dar, die über
40 60 80 100 120
einen Ser-Ser-Gly-Linker mit der NqrA verbunden wird, um die Hydrophilie zu erhöhen und die Flexibilität zu verbessern. Der Strep-Tag hat eine spezifische Affinität zu StrepTactin – einem modifizierten Streptavidin[81]. StrepTactin ist auf der Säulenmatrix der StrepTrap-Säule immobilisiert und kann somit Proteine mit Strep-Tag spezifisch binden.
Expression und Reinigung der NqrA-Strep wurde im Rahmen eines Praktikums von Sebastian Brodkorb und später im Rahmen einer Bachelorarbeit von Tobias Dölle getestet. Die Isolierung der NqrA-Strep vom Abbauprodukt wurde durch einen zusätzlichen Reinigungsschritt nach der Gelfiltration mit der StrepTrap-Säule erreicht. Die Volllängen-NqrA wurde auf der Säule aufgefangen, wobei die Abbauprodukte, die keinen Strep-Tag enthalten, den Durchlauf der Säule bildeten. Es konnte die Volllängen-NqrA frei von Abbauprodukt erhalten werden. Die Ausbeute von Protein war jedoch sehr gering und betrug ca. 2 mg Protein aus 1 LB Medium. Des Weiteren hat sich während der Arbeit von Tobias Dölle und später bei der Masterarbeit von Johanna Ude herausgestellt, dass NqrA-Strep stark zur Aggregation neigt. Dies könnte an der zusätzlichen Destabilisierung am C-Terminus des Proteins liegen. In der vorliegenden Arbeit wurde NqrA-Strep nicht angewendet. Diese Ergebnisse sind hier lediglich für ein vollständiges Bild der Evolution von NqrA-Konstrukten dargestellt.
Isotopenmarkierte NqrA-Untereinheit
Für die NMR-Experimente wurde NqrA in unterschiedlichen isotopenmarkierten Formen in Minimalmedium exprimiert. Für die Markierung wurden die Vektoren pETDuet1 für NqrA und pET15b für NqrA-377 verwendet. Als einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquelle enthält das Minimalmedium-M9 Ammoniumchlorid und Glucose. Durch Kombination von diesen zwei Verbindungen in unterschiedlich markierten Formen können verschiedene Isotopenzusammensetzungen im Protein erhalten werden. Wie früher erwähnt wurde, ist die Verwendung des pNA1-Vektors für die Isotopenmarkierung nicht gut geeignet, da Arabinose als eine zusätzliche Quelle von Kohlenstoff dienen kann.
Zuerst wurde 15N-markierte NqrA für die Bindungsstudien mit Chinonen präpariert. Dafür wurde M9-Medium mit 15NH4Cl verwendet. Ansonsten wurde die Expression und Reinigung wie mit der unmarkierten NqrA durchgeführt. Nach der Größenausschlusschromatographie konnten 11 mg 15N-NqrA aus 1 L M9-Medium isoliert werden. Jedoch war die NqrA mit 50 kDa zu groß für NMR-Verhältnisse, um scharfe Signale zu beobachten (Abb. 3.1.7).
Weiter wurde parallel zur 15N-Markierung auch das Deuterieren von NqrA durchgeführt (siehe 2.2.3). Dazu wurde wieder das M9-Medium verwendet, jedoch wurde schweres Wasser (D2O) statt normalem Wasser (H2O) angesetzt, alle Quellen von 1H wurden möglichst vermieden oder minimiert. Die Expression wurde nach dem Protokoll von Marley et al.[41]
durchgeführt, indem die Zellen zuerst in unmarkiertem LB-Medium angezogen wurden und dann in D2O-M9-Medium übertragen wurden. Das Verhältnis zwischen dem Volumen von LB-Medium und dem Volumen von D2O-M9-Medium betrug 4:1, so dass eine hohe Dichte von Zellen in deuteriertem Medium und entsprechend eine optimale Ausnutzung von Glucose und anderen Nährstoffen erreicht werden konnte. Nach dem Übertragen der E. coli-Zellen in das D2O-M9-Medium wurde eine Stunde Adaptationszeit vor dem Induzieren eingeführt, damit die Zellen sich an die deuterierte Umgebung anpassen und den Stoffwechsel auf deuterierte Verbindungen umstellen konnten. Ein sofortiges Induzieren würde außerdem dazu führen, dass das exprimierte Protein zuerst unmarkiert produziert wird, weil der Zelleninhalt direkt nach dem Übertragen zum größten Teil noch selbst unmarkiert ist.
Abbildung 3.1.7: 1H-15N-TROSY-Spektrum von 370 µM 15N-markierter NqrA, pH 8.0. Spektrum wurde bei 300 K an einem 600 MHz Spektrometer aufgenommen.
10 9 8 7
130 125 120 115 110 105
δ(1H) [ppm]
δ(15N) [ppm]
Das Protokoll hat sich als gut geeignet für den E. coli BL21(DE3)-tuner-Stamm und die NqrA-Untereinheit herausgestellt, denn nach der Affinität- und Größenausschluss-chromatographie konnten ca. 6 mg 2H-15N-NqrA aus 0.25 L D2O-M9-Medium gewonnen werden. Laut Massenspektrometrie (Phast, Konstanz) lag der Deuterierungsgrad von 2H-15 N-NqrA bei ca. 95 %. Mit der großen Hilfe von Alexander Brosig konnte auch N-NqrA-377 genauso gut in 2H-15N-markierter sowie in 2H-13C-15N-markierter Form hergestellt werden. Es wurden jeweils ca. 7 mg von 2H-15N-NqrA-377 und 2H-13C-15N-NqrA-377 aus 0.5 L D2O-M9-Medium isoliert.
Das 1H-15N-TROSY-Spektrum (Abb. 3.1.8) der 2H-15N-NqrA zeigte einen großen Unterschied zum Spektrum von der protonierter 15N-NqrA (vgl. Abb. 3.1.7). Es sind viele neue Signale zu sehen und Qualität des Spektrums ist insgesamt deutlich besser, so dass viele einzelne Amid-Signale unterschieden werden können. Es wurde beobachtet, dass im 1H-15 N-TROSY-Spektrum im Laufe der Zeit neue Signale entstehen. Dies ist auf den Rücktausch von Deuteronen auf Protonen zurückzuführen, er offenbar im Kern des Proteins langsamer als an der Oberfläche stattfindet.
Abbildung 3.1.8: 1H-15N-TROSY-Spektrum von 200 µM 2H-15N-markierter NqrA, pH 8.0. Spektrum wurde bei 295 K an einem 600 MHz Spektrometer aufgenommen.
11 10 9 8 7 6
130 120 110
δ(15N) [ppm]
δ(1H) [ppm]
Stabilität
NqrA kann als ein relativ stabiles Protein klassifiziert werden. Bei 4 °C in 300 mM NaCl, 50 mM TRIS, pH 8.0, 5 % Glycerin konnte NqrA mehrere Wochen ohne sichtbare Veränderungen der Eigenschaften aufbewahrt werden. Dies konnte vor allem im Laufe der 1
H-15N-TROSY-Experimenten von isotopenmarkierten Proben demonstriert werden. NqrA-377 zeigte sich noch stabiler und konnte über einen Monat bei Raumtemperatur ohne Veränderungen in 1H-15N-TROSY-Spektren aufbewahrt werden.
Der theoretische isoelektrische Punkt (pI) liegt bei 6.5 für NqrA und NqrA-Strep. Der pI-Wert von NqrA-377 liegt bei 9.1. Diese pI-Werte wurden mit ExPASy ProtParam Tool von SIB Bioinformatics Resource Portal berechnet. Alle Reinigungs- und Aufbewahrungspuffer hatten pH 8.0 und damit waren weit genug von pI-Wert, so dass jeweils geladene und damit stabile und lösliche Spezies vorliegen sollten.