Analyse der Plasmaproben:

Parameter Analyseverfahren Messprinzip

pH-Wert ISE-Technologie Messung der elektrischen Potentialdifferenz

p CO₂ Elektode nach SEVERINGHAUS und BRADLEY

Messung der Veränderung des internen pH-Wertes

p O2 Elektrode nach CLARK Messung des Elektronenflusses HCO3

- Berechnung durch das Gerät log cHCO₃^-= pH + log(pCO₂ x 0,0307) - 6,105

t CO2 Berechnung durch das Gerät tCO2 = cHCO3

-+ (0,0307 x pCO2) BE Berechnung durch das Gerät BE=(1-0,014xcHb)((cHCO3

--24,8) +(1,43xcHb+7,7)(pH-7,4))

Na⁺ Halbzelle mit externem Sensor Messung der elektrischen Potentialdifferenz

K⁺ Halbzelle mit externem Sensor Messung der elektrischen Potentialdifferenz

Ca²⁺ Halbzelle mit externem Sensor Messung der elektrischen Potentialdifferenz

Ca²⁺ (pH 7,4) Geräteinterne Berechnung

Cl^- Halbzelle mit externem Sensor Messung der elektrischen Potentialdifferenz

Anionenlücke Geräteinterne Berechnung

Zur weiteren Auswertung wurden in dieser Untersuchung allerdings lediglich die folgenden Werte dieser Analysevariante herangezogen: pH-Wert, HCO3-, K⁺ und Ca²⁺ (pH 7,4)

3.6.4. Analyse der Plasmaproben:

Die gleich nach der Blutentnahme gewonnenen Plasmaproben wurden bis zur Analyse bei – 20°C eingefroren und wurden dann zur Durchführung der einzelnen Analysen aufgetaut und danach nochmals homogenisiert.

Aus diesen Proben wurden dann die folgenden Parameter analysiert:

Gesamtkonzentration an Calcium:

Die Bestimmung der Gesamtcalciumkonzentration erfolgte direkt aus dem Plasma mittels Atomabsorptionsspektroskopie (Unicam Solar 969, Fa. Unicam, Offenbach).

Bei diesem Analyseverfahren wird die Probe fein zerstäubt durch eine Acetylen-Luft-Flamme gesaugt, wodurch die Elemente, die in ihr enthalten sind, in einen atomaren Zustand überführt werden. Diese so entstandenen Atome absorbieren jeweils Strahlungsenergie einer charakteristischen Wellenlänge, die die Elektronen auf der äußeren Schale dieser Atome benötigen, um von ihrem Grundzustand in einen energetisch angeregten Zustand zu gelangen.

Durch diese energetische Absorption dieser Wellenlänge entsteht eine charakteristische Resonanzlinie. Im Atomabsorptionsspektrometer sind Hohlkathodenlampen vorhanden, die das zu analysierende Element enthalten und so das dazugehörige Linienspektrum emittieren.

Nachdem die Probe nun aus dem Strahlengang die entsprechende Strahlung absorbiert hat, wird mit einem Empfängersystem mit Sekundärverstärker die Extinktion gemessen. Der Wert der Extinktion ist proportional zur Menge des in der Probe enthaltenen Elementes.

Phosphor:

Die Menge an anorganischem Phosphat, welches in den Plasmaproben vorhanden war, wurde mit Hilfe eines UV-Testes (Nobi-Flow Phosphor-UV, Fa. Nobis Labordiagnostica GmbH, Endingen) gemessen und in mmol/l umgerechnet.

Diese Testvariante basiert auf einer Komplexbidung des Phosphates mit Ammoniummolybdat zu einem Ammoniummolybdat-Phosphor-Komplex in schwefelsaurer Lösung. Dieser Stoffkomplex absorbiert Strahlung im Wellenbereich des UV-Lichtes. Somit ist eine Extinktion zu messen, die in Verbindung mit einer Standardmessung zur Berechnung des Phosphatgehaltes in der zu analysierenden Probe dient.

Natrium:

Der Gehalt an Natrium in den Plasmaproben wurde ebenfalls wie bei der Analyse der Futterproben mit Hilfe eines Flammenphotometers (M 8D-Acetylen, Fa. Lange, Berlin) im Flammenemissionsverfahren nach SCHUHKNECHT und SCHINKEL (1963) analysiert.

Im Unterschied zu den Futterproben ging hier aber kein Veraschungsverfahren voraus, sondern der Gehalt an Natrium wurde direkt aus den Plasmaproben bestimmt.

Chlorid:

Zur Bestimmung des Chloridgehaltes wurden 5 ml der zu analysierenden Plasmaprobe abgemessen und in einen 50 ml fassenden Messzylinder eingefüllt, der dann bis zur Eichmarke mit destilliertem Wasser aufgefüllt wurde. Im Anschluss wurde diese Lösung eine Stunde lang geschüttelt. Es folgte eine Zentrifugation eines entsprechenden Aliquots, um

daran entsprechend die Messung durch zu führen. Die Bestimmung des Chloridgehaltes mit einem Chlorid-Analyser (Typ 925, Fa. Ciba Corning, Gießen) läuft nach dem Prinzip einer Fällungstitration ab. Dazu geben zwei Silberelektroden des Gerätes eine konstante Menge an Silberionen in die Probelösung ab, die sich mit den Chloridionen in der Lösung zu Silberchlorid verbinden. Wenn alle Chloridionen sich in einer solchen Verbindung befinden, endet die Titration. Anhand der Menge der abgegebenen Silberionen konnte so die Chloridmenge in der Lösung bestimmt werden.

Kreatiningehalt im Plasma:

Die Bestimmung des Kreatiningehaltes im Plasma wurde durch einen enzymatischen Farbtest (Zweipunkt-Kinetik) nach der PAP-Methode durchgeführt (THOMAS 1992).

Dazu mussten zunächst zwei Reagenzlösungen hergestellt werden.

Zur Herstellung der Reagenzlösung I wurde die Enzymmischung R2, die 20 U/ml Kreatinase, 5 U/ml Sarcosinoxidase, 1 U/ml Peroxidase, 10 U/ml Ascorbatoxidase und 10 µmol/l Kaliumhexacyanoferrat enthielt, in 50 ml einer Pufferlösung bestehend aus 150 mmol/l Phosphatpuffer (pH 7,9) und 1 mmol/l ADPS gelöst.

Zur Herstellung der Reagenzlösung II wurde die Enzymmischung R4 , die aus 0,2 mmol/l 4-Aminoantipyrin und 20 U/ml Kreatinase bestand, in 10 ml des Puffers, der auch zur Herstellung der Reagenzlösung I verwendet wurde, gelöst.

Die Messung der Extinktion wurde unter der Verwendung eines 546 nm Filters bei einer Messtemperatur von 25°C durchgeführt.

Zur Beschickung der Küvetten wurde folgendes Pipettierschema angewendet:

Leerwert Standard Analyse Standard - 50µl - Probe - - 50µl Reagenzlösung I 500µl 500µl 500µl

Den Inhalt der Küvetten wurde gut gemischen und 5 Minuten bei 25°C inkubiert.

Reagenzlösung II 100µl 100µl 100µl

Den Inhalt der Küvetten wurde erneut gut gemischt und nach genau 2 Minuten wurde der Wert für E1 ablesen und nach genau 2 weiteren Minuten konnte der Wert für E2 ermittelt werden.

Die Berechnung des Kreatiningehaltes im Serum erfolgte dann nach folgender Formel:

( E2 – E1)Analyse

c ( mg/ dl) = --- x 2 mg/dl ( E2 – E1)Standard

Parathormon:

Die Parathormonkonzentration im Plasma wurde mit einem Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) (Porcine Intact PTH ELISA Kit, Immutopics, Inc., San Clemente, Canada) ermittelt. Zur Durchführung dieser Analyse wurden jeweils 50 µl des Proben-materials bzw. der Standardlösung oder der Kontrolllösung in die entsprechenden Kavitäten der Microtiterplatte pipettiert und jeweils 50 µl der Arbeits-Anti-Körper-Lösung, die zu gleichen Anteilen aus Biotin-markierten porzinen Antikörpern und aus HRP-konjugierten porzinen Antikörpern bestand, dazugegeben. Danach wurde diese Platte mit einem Plattenverschliesser verschlossen und mit Alufolie abgedeckt. In diesem Zustand erfolgte dann für drei Stunden eine Inkubation bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Rotor bei 180-220 U/Min. Nachdem nun die Alufolie und der Plattenverschliesser entfernt worden waren, wurde aus jeder Kavität der Inhalt abgesaugt und fünfmal mit einer Waschlösung gewaschen und erneut ausgesaugt. Dann wurden 100 µl des ELISA-HRP-Substrates dazu pipettiert, die Mikrotiterplatte wurde erneut wie schon beschrieben verschlossen und nochmals für 30 Minuten unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurde der Plattenverschluss entfernt und in einem Mikrotiterablesegerät die Absorption bei einer Wellenlänge von 620 nm gemessen. Sofort danach wurde in jede Kavität 50µl einer ELISA-Stop-Lösung pepittiert und die Platte eine Minute bei der vorgegebenen Drehzahl auf den Rotor verbracht. Nach diesem Schritt wurde nochmals die Absorption allerdings bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Anhand der vorher erstellten Eichkurven aus den mitgelieferten Standards konnte dann aus beiden Absorptionsraten mit den dazugehörigen Eichkurven der Gehalt an PTH in der Probe bestimmt werden. Das Ergebnis wurde in pg/ml angegeben.

Absorption der Probe

Konzentration Probe = --- x Konzentration der Standardlsg.

Absorption der Standardlösung

Knochenspezifische alkalische Phosphatase (bAP):

Die Bestimmung der Konzentration der knochenspezifischen Phosphatase erfolgte mit einem Enzym-Immunassay (METRA^TM BAP EIA kit, Fa. QUIDEL CORPORATION, San Diego, USA). Diese Bestimmung des bAP-Gehaltes funktioniert nach dem Prinzip eines Immunassays, bei dem die in der zu analysierenden Probe enthaltenen bAP-Anteile an einen mit monoklonalen Anti-bAP-Antikörper beschichteten Mikrotiterstreifen gebunden werden.

Diese gebundenen bAP-Anteile konnten dann über ihre Enzymaktivität mit Hilfe eines p-Nitrophenylphosphat (pNPP)-Substrats bestimmt werden.

Zur Durchführung dieser Analyse wurden in die Vertiefung der mit von Mäusen stammenden monoklonalen Anti-bAP-IgG-Antikörper beschichteten Teststreifen 125 µl einer Testpuffer-substanz gegeben, die aus Magnesiumchlorid, Zinksulfat, Tensid und Natriumazid bestand.

Daraufhin wurden 20 µl der Standardlösung bzw. der zu untersuchenden Probensubstanz hinzu pipettiert, um dann für 3 Stunden bei + 20 – 28°C inkubiert zu werden. Im weiteren Verlauf wurden die Vertiefungen entleert und viermal mit einer einfach konzentrierten Waschpufferlösung gewaschen. Im nächsten Schritt wurden in die gewaschenen Vertiefungen 150 µl einer Substratlösung gegeben, die als Substrat das p-Nitrophenylphosphat enthielt.

Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 Minuten bei +20-28°C wurden 100 µl einer Stopplösung dazugegeben, die Natronlauge (NaOH) enthielt. Im Folgenden wurde nun die Absorbanz bei 405 nm bestimmt. Die Auswertung der jeweiligen Konzentrationen an bAP in den Plasmaproben erfolgte anhand einer Standardmesskurve, die vorher unter der Verwendung einer Standardlösung, welche dem Testkit beigefügt war, erstellt wurde. Die bAP-Konzentrationen im Plasma wurden in U/l angegeben.