Cuvillier Verlag Göttingen
Internationaler wissenschaftlicher Fachverlag
Claudia Lütke-Besselmann-Growe
Epidemiologische Untersuchung zur Seroprävalenz von nicht-primaten Hepacivirus-Infektionen
bei Vollblütern
STIFTUNG TIERÄRZTLICHE HOCHSCHULE HANNOVER
Herausgegeben von
Karsten Feige, Peter Stadler,
Harald Sieme, Bernhard Ohnesorge
20
Cuvillier Verlag Göttingen
Internationaler wissenschaftlicher Fachverlag
Epidemiologische Untersuchung zur Seroprävalenz von nicht-primaten Hepacivirus-Infektionen
bei Vollblütern
Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar.
1. Aufl. - Göttingen : Cuvillier, 2016
Zugl.: Hannover (TiHo), Univ., Diss., 2016
© CUVILLIER VERLAG, Göttingen 2016 Nonnenstieg 8, 37075 Göttingen Telefon: 0551-54724-0
Telefax: 0551-54724-21 www.cuvillier.de
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1. Auflage, 2016
Gedruckt auf umweltfreundlichem, säurefreiem Papier aus nachhaltiger Forstwirtschaft.
ISBN 978-3-7369-9261-0 eISBN 978-3-7369-8261-1
Epidemiologische Untersuchung zur Seroprävalenz von nicht-primaten Hepacivirus-Infektionen
bei Vollblütern
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Claudia Lütke-Besselmann-Growe Oelde
Hannover 2016
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Karsten Feige 2. Gutachter: Prof. Dr. Paul Becher
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2016
Meinen lieben Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 2
2.1 Das Hepatitis C Virus (HCV) ... 2
2.1.1 Vorkommen und Genotypen des HCV ... 2
2.1.2 Taxonomie und Struktur des HCV ... 3
2.1.3 In vitro Modelle und in vivo Modelle ... 5
2.1.3.1 In vitro Modelle ... 5
2.1.3.2 In vivo Modelle ... 6
2.1.4 Übertragungswege des HCV... 7
2.1.5 Krankheitsverlauf von HCV-Infektionen ... 8
2.1.6 Therapiemöglichkeiten des HCV ... 10
2.2 Das nicht-primate Hepacivirus (NPHV) ... 11
2.2.1 Vorkommen des NPHV ... 11
2.2.2 Taxonomie und Struktur des NPHV ... 12
2.2.2.1 Nachweismethoden des NPHV ... 13
2.2.3 Klinik des NPHV ... 14
2.3 Weitere Hepatitis C Homologe ... 15
2.3.1 Affen ... 16
2.3.2 Hunde ... 16
2.3.3 Rinder ... 17
2.3.4 Mäuse, Ratten und Fledermäuse ... 18
2.4 Lebererkrankungen beim Pferd ... 19
2.4.1 Allgemeines... 19
2.4.1.1 Vorkommen ... 19
2.4.1.2 Klinische Symptome ... 19
2.4.1.3 Diagnose ... 20
2.4.2 Virale Lebererkrankungen ... 22
2.5 Epidemiologische Untersuchungen ... 23
4 Methode ... 27
4.1 Klinische Allgemeinuntersuchung ... 27
4.2 Hämatologische Untersuchung ... 27
4.3 Blutchemische Untersuchung ... 27
4.4 Untersuchung auf anti-NPHV NS3 Antikörper ... 28
4.4.1 Antigenherstellung ... 28
4.4.2 Durchführung des Luziferase-Immunpräzipitations-Systems (LIPS) ... 30
4.4.3 Bestimmung von Sensitivität und Spezifität der Messergebnisse ... 31
4.5 Untersuchung auf NPHV RNA mittels quantitativer real-time PCR ... 31
4.5.1 Extraktion der viralen RNA ... 32
4.5.2 Herstellen der komplementären DNA (cDNA) ... 33
4.5.3 Quantitative real-time PCR ... 34
4.6 Statistische Auswertung ... 36
5 Ergebnisse ... 38
5.1 Klinische Allgemeinuntersuchung ... 38
5.2 Hämatologische Untersuchung ... 38
5.3 Blutchemische Untersuchung ... 39
5.4 Seroprävalenz von NPHV-Infektionen ... 42
5.4.1 Geschlecht ... 44
5.4.2 Alter ... 45
5.4.3 Reproduktionsstatus ... 46
5.4.4 Zuchteinsatz im Untersuchungsjahr ... 47
5.4.5 Bestandsgröße ... 48
5.4.6 Auslandsaufenthalt im Untersuchungsjahr ... 49
5.5 Induktive Statistik ... 51
5.5.1 Ergebnisse über Assoziationen ... 51
5.5.2 Einfaktorielle logistische Regression ... 52
5.5.3 Mehrfaktorielle logistische Regression ... 53
3 Material... 25
3.1 Studienkooperation ... 25
3.2 Studienpopulation und Probengut ... 25
3.3 Labormaterialien ... 26
6.4.2 Alter ... 60
6.4.3 Reproduktionsstatus ... 60
6.4.4 Zuchteinsatz ... 61
6.4.5 Bestandsgröße ... 61
6.4.6 Auslandsaufenthalt ... 62
6.5 Induktive Statistik ... 63
6.5.1 Alter und Transport ins Ausland ... 63
6.6 Übertragungswege ... 66
6.6.1 Horizontale Übertragung ... 66
6.6.2 Vertikale Übertragung ... 68
6.6.3 Iatrogene Übertragung ... 70
6.6.4 Vektorgestützte Übertragung (via Arthropoden) ... 71
7 Zusammenfassung ... 72
8 Summary ... 74
9 Literaturverzeichnis ... 76
10Anhang ... 92
10.1 Labormaterialien ... 92
10.1.1 Chemikalien ... 92
10.1.2 Plasmide ... 95
10.1.3 Oligonukleotide ... 95
10.1.4 Geräte ... 96
10.1.5 Verbrauchsmaterialien ... 97
10.2 Ergebnisstabelle: Deskriptive Statistik ... 98
6 Diskussion ... 55
6.1 Studienpopulation und Probengut ... 55
6.2 Blutchemische Ergebnisse ... 55
6.3 Seroprävalenz von NPHV-Infektionen ... 57
6.4 Deskriptive Statistik ... 59
6.4.1 Geschlecht ... 59
Abkürzungsverzeichnis
UTR untranslated region
abs antibodies
AK Antikörper
ALT Alanin-Aminotransferase ANOVA analysis of variance
AP Alkalische-Phosphatase AST Aspartat-Aminotransferase BHV Bat Hepacivirus
BovHepV Bovines Hepacivirus BVDV Bovines Virusdiarrhoe-Virus bzw. beziehungsweise
bzgl. bezüglich
ca. circa
CCl4 Tetrachlorkohlenstoff CD34+ cluster of differentiation 34+
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure CHV Canines Hepacivirus
CnNPHV Canines nicht-primates Hepacivirus ct-Wert cycle threshold - Wert
DAA Direkte-Antivirale-Agentien DNA Desoxyribonukleinsäure e.g. exempli gratia
e.V. eingetragener Verein
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EHV Equines Herpesvirus
EIA Equine Infektiöse Anämie
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EPgV1 Equines Pegivirus-1
evtl. eventuell
FSME Früh-Sommer-Meningoenzephalitis GABA γ-Aminobuttersäure
GBV-B GB-Virus-B
GE Gesamteiweiß
ggr. geringgradig
GHV Guereza Hepacivirus GLDH Glutamat-Dehydrogenase
HCT Hämatokrit
HCV Hepatitis C Virus
HCVcc cellculture-derived HCV particles HCVpp HCV-Pseudopartikel
HGB Hämoglobin
HIV Humanes Immundefizienz-Virus HuH7 human hepatoma cells-7
IRES internal ribosome entry site JFH1 Japanese fulminant hepatitis 1 LDH Laktatdehydrogenase
LIPS Luziferase-Immunpräzipitations-System LPO Leistungs-Prüfungs-Ordnung
MAX Maximum
min Minute
MIN Minimum
miR micro RNA
MW Mittelwert
NPHV nicht-primates Hepacivirus / nonprimate hepacivirus NrHV Norway rat hepacivirus
NS Nicht-Strukturprotein
OR Odds Ratio
ORF open reading frame PBS phosphate buffered saline PI persistent infiziert PLT platelets (Thrombozyten) PCR Polymerase-Kettenreaktion
RBC rote Blutkörperchen (Erythrozyten) RHV Rodent hepacivirus
RLU relative light units
RNA Ribonukleinsäure
rpm rounds per minute RUC Renilla luciferase SDH Sorbitol-Dehydrogenase STD standard deviation spp. spezies pluralis
ssp. subspezies
SVR sustained viral response
TDAV Theiler’s Disease Associated Virus
TP total protein
vs. versus
WBC weiße Blutkörperchen (Leukozyten) γ-GT Gamma-Glutamyl-Transferase
z.B. zum Beispiel
Mengenangaben
μg Mikrogramm
μl Mikroliter μmol/l Mikromol/Liter
G/l Giga/ Liter
g/l Gramm/Liter mg/dl Milligramm/Deziliter ml Milliliter
mmol/l Millimol/Liter T/l Terra/Liter
U/l Units/Liter
Sonderzeichen:
< kleiner
> größer α alpha
°C Grad Celsius
1
1 Einleitung
Virusinfektionen verursachen häufig medizinisch und wirtschaftlich bedeutungsvolle Erkrankungen beim Pferd (BARTON 2010). Dazu zählen vor allem Infektionen mit Influenzaviren (MORLEY et al. 2000) und Herpesviren (PATEL u. HELDENS 2005).
In den vergangenen fünf Jahren wurden neue Hepaciviren (KAPOOR et al. 2011;
BURBELO et al. 2012; DREXLER et al. 2013; QUAN et al. 2013; BAECHLEIN et al.
2015) und Pegiviren (CHANDRIANI et al. 2013) in der Familie Flaviviridae entdeckt.
Ein neuer Vertreter aus dem Genus Hepacivirus ist das nicht-primate Hepacivirus (NPHV), das zunächst bei Hunden (KAPOOR et al. 2011) und anschließend bei Pferden (BURBELO et al. 2012) gefunden wurde. Erste Untersuchungen zeigten, dass das Pferd der natürliche Wirt des nicht-primaten Hepacivirus (NPHV) ist und dass das Virus phylogenetisch mit dem Hepatitis C Virus (HCV) des Menschen sehr eng verwandt ist (BURBELO et al. 2012). Beim Menschen kann eine HCV-Infektion akute oder chronische Leberschäden verursachen (HOOFNAGLE 1997). Obwohl auch für das NPHV ein Lebertropismus nachgewiesen wurde, verläuft die Infektion bei Pferden meist klinisch inapparent (PFAENDER et al. 2015). In Serumproben von Vollblutpferden wurden im Vergleich zu anderen Rassen häufiger virale NPHV RNA und anti-NPHV NS3 (Nichtstrukturprotein 3) Antikörper nachgewiesen (PFAENDER et al. 2015). Die Ursache für die höhere Prävalenz von NPHV-Infektionen bei Voll- blutpferden sowie natürliche Übertragungswege einer NPHV-Infektion sind bisher unbekannt und Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen.
Im Rahmen einer Querschnittstudie wurden daher zunächst die Prävalenzen von anti-NPHV NS3 Antikörpern und von viraler NPHV RNA in Serumproben von Voll- blutpferden aus Nord- und Westdeutschland bestimmt. Anschließend wurden poten- tielle Risikofaktoren ermittelt, die einen Einfluss auf das Vorkommen von NPHV- Infektionen besitzen, um damit Informationen zum Übertragungsweg des Virus zu erhalten. Eine Einschätzung zur klinischen Relevanz sollte anhand von hämatologi- schen Untersuchungen und über die Bestimmung von blutchemischen Parametern in den Serumproben erfolgen.
2
2 Literaturübersicht
2.1 Das Hepatitis C Virus (HCV)
Das Hepatitis C Virus (HCV) verursacht beim Menschen akute oder chronische Le- bererkrankungen. Neben den akuten Infektionen, die meist subklinisch verlaufen und kaum Komplikationen mit sich bringen, sind es vor allem die chronischen Infektionen, die mit lebensbedrohlichen Organschäden einhergehen können. Weltweit infizieren sich 3 - 4 Millionen Menschen pro Jahr neu, ca. 170 Millionen Menschen sind chro- nisch infiziert (MOHD HANAFIAH et al. 2013) und nahezu 350.000 Menschen ster- ben jährlich an den Folgen einer Hepatitis C Infektion, die zu Leberzirrhose oder Le- berkarzinomen führen kann (DAVILA et al. 2004; PERZ et al. 2006). Die vorhande- nen Medikamente sind insbesondere für Menschen aus Entwicklungsländern schwer zugänglich und sehr teuer (NEGRO 2014). Zusätzlich existiert derzeit kein prophylak- tischer bzw. therapeutischer Impfstoff (BILLERBECK et al. 2013), weil für dessen Entwicklung ein geeignetes Tiermodell fehlt (BUKH 2012).
2.1.1 Vorkommen und Genotypen des HCV
Das Hepatitis C Virus, früher Nicht-A / Nicht-B Hepatitis-Virus, wurde bereits in den 1960er Jahren gefunden (FEINSTONE et al. 1975). Erst 1989 gelang es CHOO et al.
das Genom zu klonieren. Experimentelle Infektionsversuche zeigten, dass neben den Menschen auch Schimpansen mit dem Virus infiziert werden können und er- kranken (TABOR et al. 1978; KOLYKHALOV et al. 1997). Der Ursprung des Virus ist jedoch weiterhin unbekannt (SIMMONDS 2013).
Das Vorkommen unterschiedlicher Nukleotid Sequenzen (29 – 34 %) des HCV führte zu einer Gliederung des HCV in Genotypen (LINDENBACH et al. 2013). Die Genoty- pen werden wiederum in Subtypen eingeteilt (SMITH et al. 2014), die sich aus ver- schiedenen Isolaten zusammen setzen. Bei Unterschieden von 1 - 5 % der Nukleo-
3
tidsequenzen bezogen auf Virusgenome aus ein und demselben Tier, liegen Quasispezies vor (HOOFNAGLE 2002).
Obwohl das Hepatitis C Virus weltweit endemisch zu finden ist, wurde eine höhere Prävalenz für Afrika und Asien im Vergleich zu Nord-Amerika, West-Europa und Australien beschrieben (SHEPARD et al. 2005). Derzeit sind etwa 19 Millionen Men- schen in Europa mit dem Virus infiziert (NEGRO 2014).
Die 7 Genotypen des Hepatitis C Virus weisen geographisch unterschiedlich hohe Prävalenzen auf (SIMMONDS 2004). In Nord-Amerika und Europa kommen am häu- figsten die Genotypen 1a und 1b vor (WASLEY u. ALTER 2000). Eine auffallend ho- he Prävalenz der Genotypen 1a und 3a tritt bei Drogenkonsumenten auf (PYBUS et al. 2005). In Asien findet häufig eine Infektion mit dem HCV Genotyp 1b und in China mit dem Genotyp 6 statt. Der Genotyp 4 kommt vor allem im mittleren Osten und Norden Afrikas vor. Die Genotypen 5 und 7 treten fast nur in Afrika auf (SIMMONDS 2004). Die genetisch größten Abweichungen bestehen zwischen dem Genotyp 4 aus Afrika und dem Genotyp 6 aus Südostasien und sind vermutlich vor 350 - 700 Jahren entstanden (PYBUS et al. 2001). Im Vergleich dazu scheint das HCV in westlichen Ländern erst vor etwa 100 Jahren aufgetreten zu sein (GRAY et al. 2011), sodass eine Ausbreitung aus Afrika bzw. Südostasien in die westlichen Länder vermutet werden kann. Die spätere Teilung und Verbreitung des Genotyps 1 in die Subtypen a und b fand vor etwa 60 - 70 Jahren statt (SIMMONDS et al. 2005) und könnte im Zu- sammenhang mit dem zweiten Weltkrieg und der damals vorherrschenden mangel- haften medizinischen Versorgung sowie dem Einsatz von Bluttransfusionen stehen (SIMMONDS 2013).
2.1.2 Taxonomie und Struktur des HCV
Das Hepatitis C Virus gehört zum Genus Hepacivirus und bildet zusammen mit den Pegiviren, den Pestiviren und den Flaviviren die Familie der Flaviviridae (SIMMONDS 2013).
Das HCV ist ein behülltes Virus mit einer positiven Einzelstrang-RNA und einer Län- ge von 9,6 Kilobasen (VON HAHN et al. 2010). Die RNA setzt sich zusammen aus dem offenen Leserahmen (open reading frame = ORF) und den beiden angrenzen-
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den untranslationierten Bereichen (untranslated region = 5’UTR und 3‘UTR) am 5‘
und 3‘ Ende (LINDENBACH et al. 2013). In der 5’UTR liegt die Bindungsstelle für das Ribosom an die RNA [internal ribosome entry site (IRES)] und zwei micro RNA (miR) -122 Bindungsstellen, die essentiell für die Replikation in der Leber sind (WILSON u.
SAGAN 2014). Die Nukleotide des offenen Leserahmens kodieren für ein Polyprotein aus 3011 Aminosäuren. Das Polyprotein wird nach der Translation in der Wirtszelle mittels zellulärer und viraler Proteasen in 10 virale Proteine gespalten (LINDENBACH et al. 2013). Am N-terminalen Ende der ORF befinden sich die Gene, die vor allem für die Strukturproteine kodieren, zu denen das core-Gen, das E1-Gen und das E2-Gen gehören. Über die Vervielfachung des core-Gens entstehen Protei- ne für die Nukleokapsidkapsel und über die Gene E1 und E2 werden Oberflächen- strukturproteine exprimiert, die für den Eintritt in die Wirtszelle benötigt werden.
Gleichzeitig bieten diese Oberflächenstrukturproteine Angriffsflächen für spezifische Antikörper des Wirtsorganismus. Zwischen den Struktur- und den Nicht- Strukturproteinen befindet sich das p7-Gen. Dieses Protein ist wichtig für den Zu- sammenbau und die Freisetzung von Viruspartikeln, ist jedoch nicht notwendig für die Virusreplikation. Zum C-terminalen Ende der ORF schließen sich die Gene: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B an. Diese Gene kodieren vor allem für Nicht- Strukturproteine, die für die Replikation innerhalb der Wirtszelle verantwortlich sind und für Strukturproteine, die für den Zusammenbau (Assembly) und die Freisetzung (Release) des Virus aus der Zelle benötigt werden (VON HAHN et al. 2010). Von be- sonderer Bedeutung ist das Gensegment NS5B, das für die RNA abhängige RNA- Polymerase kodiert. Die Polymerase ist sehr fehleranfällig, weil ein Korrektur- Lesesystem fehlt (BARTENSCHLAGER u. LOHMANN 2000). Zusätzlich ist die Rep- likationsrate des Virus mit einer Produktion von 1010 bis 1012 Virionen pro Tag (NEUMANN et al. 1998) sehr hoch. Dadurch entsteht eine große Genvielfalt und in- nerhalb eines infizierten Wirtes können genetisch eng verwandte, aber verschiedene Variationen des Virus, Quasispezies, auftreten (HOOFNAGLE 2002). Zusammenfas- send sind die Strukturproteine vor allem wichtig für die extrazelluläre Existenz als Virion, den Zelleintritt und die Immunevasion und die Nicht-Strukturproteine vor allem
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für die virale Replikation und dem Virus-Zusammenbau, der an die Lipoprotein Bio- genese gekoppelt ist (BARTENSCHLAGER et al. 2011).
2.1.3 In vitro Modelle und in vivo Modelle
Der Replikationszyklus des Hepatitis C Virus beginnt mit dem Kontakt des Virus mit der Wirtsmembran (Attachment). Der anschließende Zelleintritt verläuft über eine rezeptorvermittelte Endozytose mit Verschmelzen der Virusmembran und der Wirts- membran. Im Zytoplasma wird die virale RNA freigesetzt (uncoating). Die darauffol- gende Translation findet am endoplasmatischen Retikulum der Wirtszelle statt. Nach der Translation entsteht ein Replikationskomplex, der durch die Nichtstrukturproteine NS3-NS5B gebildet wird (membranous web). Im letzten Schritt werden die neugebil- deten Viruspartikel aus der Wirtszelle freigesetzt (Assembly).
In den vergangenen Jahren konnte über die Entwicklung und Nutzung von Replikon- systemen (LOHMANN et al. 1999), HCV-Pseudopartikeln (HCVpp) (BARTOSCH et al. 2003) und Zellkultur-abgeleiteten HCV-Partikeln (cellculture-derived HCV particles
= HCVcc) (LINDENBACH et al. 2005) der gesamte Lebenszyklus des HCV in vitro untersucht werden. Ein immunkompetentes, geeignetes Tiermodell zur Entwicklung von prophylaktischen bzw. therapeutischen Impfstoffen fehlt jedoch (BILLERBECK et al. 2013).
2.1.3.1 In vitro Modelle
Die ersten Versuche, das Hepatitis C Virus anzuzüchten, um Informationen über den Lebenszyklus zu erhalten, begannen 1989 und blieben lange erfolglos (STEINMANN u. PIETSCHMANN 2013). Erst 1999 konnten erste Informationen zum Replikations- mechanismus des HCV über die Entwicklung von Replikonsystemen gewonnen wer- den (LOHMANN et al. 1999). Durch die Synthese einzelner Genabschnitte aus dem HCV Genom (insbesondere der Gene NS3 bis NS5B) an Reportergene kann eine HCV Replikon-RNA erstellt werden. Diese kann in menschlichen Leberzelllinien (hu- man hepatoma cells, HuH7) repliziert werden und damit Aufschlüsse über den Repli-
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kationsmechanismus des HCV geben. Einen weiteren Fortschritt brachte die Ent- wicklung sogenannter HCV Pseudopartikel (HCVpp), mit denen die Eintrittsschritte des Virus in die Zielzelle untersucht werden konnten (BARTOSCH et al. 2003). Dabei exprimieren Retroviren an ihrer Oberfläche die HCV Oberflächenproteine E1 und E2.
Diese werden nach in vitro Transfektion von drei Plasmiden gewonnen. In das erste Plasmid ist ein retrovirales Gen, welches ein Reportergen beinhaltet, eingebaut. In das zweite Plasmid werden die retroviralen gruppenspezifischen Antigene gag und pol und in das dritte die HCV Gene E1 und E2 integriert. Die gag kodiert unter ande- rem für die Kapsidproteine und die pol für die Reverse Transkriptase.
Schließlich gelang es 2005 mit der Entdeckung des HCV-Isolates der Japanese ful- minant hepatitis 1 (JFH1) vom Genotyp 2a, Zellkultur-abgeleitete HCV-Partikel (HCVcc) in vitro zu gewinnen mit denen der gesamte Lebenszyklus vom Viruseintritt bis zur Freisetzung neuer infektiöser Viren untersucht werden konnte (LINDENBACH et al. 2005). Durch die Bildung von JFH-Chimären war es letztlich auch möglich alle anderen Genotypen und ihre Lebenszyklen zu untersuchen (STEINMANN u.
PIETSCHMANN 2013).
2.1.3.2 In vivo Modelle
Trotz der Fortschritte im Bereich der Entwicklung von in vitro Modellen gibt es derzeit außer Schimpansen kein immunkompetentes, geeignetes Tiermodell für das Hepati- tis C Virus (BILLERBECK et al. 2013).
Die Forschung an Schimpansen lieferte wertvolle Informationen über den Krank- heitsverlauf, die Reaktionen des angeborenen und erworbenen Immunsystems auf eine Infektion und die Wirksamkeit neuer Medikamente oder Impfstoffe. Obwohl bei Schimpansen seltener schwerwiegende Lebererkrankungen mit Fibrosen, Zirrhosen oder Karzinomen auftreten, sollte der Einsatz von Menschenaffen im Tierversuch aus ethischen Gründen stets kritisch hinterfragt werden (BILLERBECK et al. 2013).
Des Weiteren entdeckten Forscher, dass nördlichen Spitzhörnchen (Tupaia belan- geri) für das Hepatitis C Virus empfänglich sind (AMAKO et al. 2010). Experimentell infizierte Spitzhörnchen zeigten klinische Symptome einer milden Hepatitis und einer intermittierenden Virämie. Mittels histologischer Untersuchungen konnten zusätzlich
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Leberveränderungen, wie Verfettung, Fibrosen und Zirrhosen bestätigt werden (AMAKO et al. 2010). Weitere Studien werden zeigen, inwiefern die Tiere für die HCV-Forschung eingesetzt werden können (BILLERBECK et al. 2013).
Derzeit wird vor allem an genmanipulierten, partiell-immunkompetenten Mäusen ge- forscht, die mit dem HCV infiziert werden können (BUKH 2012; VERCAUTEREN et al. 2015). Genmanipuliert, partiell-immunkompetent bedeutet, dass die Mäuse eine chimäre Leber aus Maus- und Menschen-Hepatozyten ausbilden und menschliche CD34+ haematopoetische Stammzellen aufweisen. Dieses System bietet eine gute Möglichkeit Informationen über den Lebenszyklus, die Pathogenese und erste Wir- kungen von Medikamenten zu erhalten. Nachteilig ist, dass die Mäuse nicht gezüch- tet werden können und das es sich nur um ein partiell-immunkompetentes Tiermodell handelt. Das heißt, dass immunologische Vorgänge und Wirkungen von Impfstoffen in diesem Modell nicht untersucht werden können (BILLERBECK et al. 2013).
2.1.4 Übertragungswege des HCV
Das Hepatitis C Virus wird von Mensch zu Mensch über den parenteralen Kontakt zu virushaltigem Blut oder Blutprodukten übertragen (FIORDALISI et al. 1997; VON HAHN et al. 2010). Aufgrund der heutigen verbesserten technischen Möglichkeiten und standardisierten Untersuchungen ist der Übertragungsweg über Bluttransfusio- nen (SCHREIBER et al. 1996) mit Ausnahme von Infektionen in den Entwicklungs- ländern selten geworden. In den Entwicklungsländern herrscht zudem ein erhöhter Infektionsdruck in Gesundheitseinrichtungen, in denen nicht ausreichend gesäuberte und sterilisierte medizinische Produkte, insbesondere Spritzen und Nadeln, wieder- verwendet werden (KANE et al. 1999; ILES et al. 2013; NEGRO 2014).
Mit der Verbreitung von Spritzen und Injektionsmaterialien im zwanzigsten Jahrhun- dert nahm die Ausbreitung des HCV stark zu (GLOBAL BURDEN OF HEPATITIS 2004). Drogenkonsumenten stellen seitdem eine Hauptrisikogruppe für HCV- Infektionen, insbesondere der Genotypen 1a und 3a dar (TREPO u. PRADAT 1999;
PYBUS et al. 2005). Neben dem intravenösen Drogenmissbrauch konnte eine Studie von CONRY-CANTILENA et al. (1996) belegen, dass Personengruppen, die intrana- sal Kokain konsumieren, eine weitere Risikogruppe für HCV-Infektionen darstellen.
8
Auch das Piercen und Tätowieren bedeutet ein erhöhtes Risiko, sich mit dem HCV zu infizieren (CONRY-CANTILENA et al. 1996). In einer umfangreichen Fall-Kontroll- Studie von KARMOCHKINE et al. (2006) stellte sich heraus, dass unterschiedlich begründete Krankenhausaufenthalte, unterschiedliche Behandlungen (Injektionen, Akupunktur, Venenverödung…), aber auch intranasaler Kokain-Konsum oder Kos- metikbehandlungen als weitere Risikofaktoren zu sehen sind, sich mit dem HCV zu infizieren.
Eine transsexuelle Übertragung wird kontrovers diskutiert. Für Männer, die mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infiziert sind und Geschlechtsverkehr mit Männern ausüben, ist jedoch das erhöhte Risiko einer transsexuellen HCV- Übertragung bestätigt worden (VAN DE LAAR et al. 2009; WANDELER et al. 2012).
Insgesamt sind etwa 7 Millionen HIV infizierte Menschen mit dem HCV koinfiziert (SULKOWSKI et al. 2000).
Eine vertikale Übertragung des Hepatitis C Virus ist selten (SHEPARD et al. 2005).
Dennoch konnte bei mehr als einem von zwanzig Kindern von HCV virämischen Müt- tern eine vertikale Infektion nachgewiesen werden (BENOVA et al. 2014). Insbeson- dere für Neugeborene HIV-positiver Mütter oder von Müttern, die Drogen konsumie- ren, besteht ein erhöhtes Risiko der Transmission (INDOLFI u. RESTI 2009; NEGRO 2014).
2.1.5 Krankheitsverlauf von HCV-Infektionen
Die Prävalenz von HCV-Infektionen wird weltweit auf 2,2 % der Bevölkerung ge- schätzt (GLOBAL BURDEN OF HEPATITIS 2004). Über eine parenterale Infektion gelangt das Hepatitis C Virus über die Blutbahn zur Leber und schädigt dort die He- patozyten (LINDENBACH et al. 2013). Individuell entwickeln die Infizierten einen akuten oder chronischen Krankheitsverlauf. Untersuchungen zeigen, dass 15 – 45 % der Infizierten das Virus spontan innerhalb der ersten 6 Monate ohne eine Behand- lung eliminieren können. Die anderen 55 - 85 % entwickeln eine chronische Hepatitis (HOOFNAGLE 2002), bei denen das Risiko eine Leberzirrhose zu bilden auf 5- 25 % innerhalb der folgenden 25 Jahre nach der Infektion geschätzt wird (SANGIOVANNI
9
et al. 2006). Eine chronische HCV-Infektion liegt vor, wenn über 6 Monate nach der Infektion virale HCV RNA im Blut nachgewiesen wurde (HOOFNAGLE 2002).
Bei einem akuten Krankheitsverlauf zeigen in etwa ein Drittel der Patienten milde Symptome einer Lebererkrankung, die innerhalb von wenigen Wochen abklingen (HOOFNAGLE 1997). Nur vereinzelt zeigen Patienten mit einer akuten Hepatitis Symptome, wie Ermüdung, Anorexie, Übelkeit, Ikterus oder einen dunklen Urin. Bei einer chronischen Infektion treten dagegen entartete Leberfunktionen, Bluthochdruck oder Leberfibrosen auf, die später zu einer Leberzirrhose oder zu einem Leberkarzi- nom führen können (HOOFNAGLE 2002; DAVILA et al. 2004). Dabei ist nicht das Virus selbst zytopathogen, sondern die Leberzellen werden durch die zelluläre Im- munantwort zerstört (KANTO u. HAYASHI 2006). Dabei führen ein höheres Alter, unkontrollierter Alkoholkonsum und eine Immundefizienz zu einem schnelleren und ernsthafterem Fortschreiten der Erkrankung (HOOFNAGLE 1997). Zum Beispiel ist bekannt, dass für HIV-Patienten, die mit dem HCV koinfiziert sind, die Wahrschein- lichkeit der Entstehung einer Zirrhose und eine damit einhergehende Mortalität steigt (DE LEDINGHEN et al. 2008). Typischerweise ist bei diesen Patienten fast immer virale RNA in Serumproben nachweisbar und bei zwei Drittel der Patienten bleibt die Konzentration der Alanin-Aminotransferase um das 1,5 bis 10-fache erhöht (HOOFNAGLE 1997). Neben den Leberschädigungen können extrahepatische Mani- festationen auftreten. Häufig entwickeln chronisch infizierte Patienten eine Kryoglo- bulinämie, eine Vaskulitis aufgrund einer kältebedingten Ablagerung von Immun- komplexen in kleinen Gefäßen. Die Patienten leiden dabei unter Hautausschlag, Schwäche, Gelenkschmerzen und Neuropathien (MARCELLIN et al. 1993).
Verschiedene Studien konnten zudem belegen, dass Menschen mit afrikanischen Wurzeln eher eine chronische Hepatitis entwickeln, dafür aber einen milderen Krank- heitsverlauf zeigen (TERRAULT et al. 2008). Außerdem ist bekannt, dass ein erhöh- ter Alkoholkonsum, Insulinresistenz oder Typ 2 Diabetes stark mit einer chronischen HCV-Infektion assoziiert sind (LINDENBACH et al. 2013).
10 2.1.6 Therapiemöglichkeiten des HCV
Die klassische Therapie mit pegyliertem Interferon α und Ribaverin führte nicht im- mer zu einem Behandlungserfolg und war häufig verbunden mit heftigen Nebenwir- kungen (BERTINO et al. 2016). Über das pegylierte Interferon α wird die Aktivität der T-Lymphozyten gesteigert und das Ribaverin wirkt als Nukleosid-Analogon hemmend auf die Polymerase und damit virostatisch. Neuere Medikamente, sogenannte Direk- te-Antivirale-Agentien (DAA) sind dagegen mit weniger Nebenwirkungen verbunden und verkürzen den Behandlungszeitraum. Unterschiedliche Kombinationstherapien aus DAA, pegyliertem Interferon α und Ribaverin werden für die unterschiedlichen Genotypen des HCV eingesetzt und zeigen eine verbesserte Wirksamkeit. So wird zum Beispiel bei dem schwer zu behandelnden Genotyp 1 das DAA Sofosbuvir (ein NS5B RNA abhängiger RNA-Polymerase-Inhibitor, zugelassen seit 2014) zusammen mit pegyliertem Interferon α und Ribaverin eingesetzt und eine „anhaltende Vi- rusantwort“ (sustained viral response (SVR)) von bis zu 89 % erreicht (BERTINO et al. 2016). Das bedeutet, dass bei 89 % der Patienten 12 Wochen nach Therapieende keine virale RNA im Blut mehr nachweisbar war. Neben diesen Medikamenten gibt es noch weitere DAAs auf dem Markt und weitere Substanzen mit unterschiedlichen Wirkweisen befinden sich in der Entwicklung. Bleibt die Therapie ohne Erfolg, gilt die Lebertransplantation als letzte Chance auf Genesung. Die chronische Hepatitis C- Infektion stellt daher eine der Hauptursachen für eine Lebertransplantation dar (BROWN 2005). Problematisch ist jedoch, dass sich das Virus extrahepatozellulär zum Beispiel im lymphatischen Gewebe aufhalten und die transplantierte Leber wie- der reinfizieren kann (VON HAHN et al. 2010). Für viele der infizierten Menschen, die in Entwicklungsländern leben sind die neueren, sichereren und effektiveren Medika- mente schwer zugänglich und mit hohen Kosten verbunden (NEGRO 2014). Ziel bleibt es daher, einen schützenden Impfstoff zu entwickeln.
11 2.2 Das nicht-primate Hepacivirus (NPHV)
Das nicht-primate Hepacivirus ist ein behülltes Virus mit einer positiven Einzelstrang- RNA und ist ein Vertreter der Hepaciviren aus der Familie der Flaviviridae. Der natür- liche Wirt des nicht-primaten Hepacivirus ist das Pferd (BURBELO et al. 2012). Virale NPHV RNA wurde 2011 zunächst in Nasentupfern von Hunden (KAPOOR et al.
2011) und 2012 zum ersten Mal im Serum von Pferden gefunden (BURBELO et al.
2012). Das Virusgenom hat derzeit am meisten Ähnlichkeit zu dem Genom des He- patitis C Virus des Menschen (BURBELO et al. 2012) und besitzt wie das HCV einen Lebertropismus (PFAENDER et al. 2015; SCHEEL et al. 2015b). Im Unterschied zum Menschen können die meisten Pferde das Virus nach einer Zeit der Virämie eliminie- ren und bleiben über den gesamten Infektionsverlauf symptomfrei (MATSUU et al.
2015; PFAENDER et al. 2015).
2.2.1 Vorkommen des NPHV
Das NPHV konnte in Serumproben und/oder Leberproben bei Pferden in Amerika (BURBELO et al. 2012; SCHEEL et al. 2015b), Brasilien (GEMAQUE et al. 2014;
FIGUEIREDO et al. 2015), Europa (LYONS et al. 2012; REUTER et al. 2014;
PFAENDER et al. 2015) und Asien (TANAKA et al. 2014; MATSUU et al. 2015) nachgewiesen werden. Erste Untersuchungen von BURBELO et al. (2012) schätzten eine Seroprävalenz von 30 bis 40 % anti-NPHV NS3 Antikörper-positiven und von 2 bis 7 % NPHV RNA-positiven Pferden. Bei einer Untersuchung von Pferden aus Norddeutschland konnten vergleichbare Ergebnisse mit 31,4 % anti-NPHV NS3 Anti- körper-positiven und 2,5 % NPHV RNA-positiven Proben festgestellt werden (PFAENDER et al. 2015). Überraschend ist, dass bei einem Screening von TANAKA et al. (2014) bei Pferden in Japan bei 35,6 % virale NPHV RNA und lediglich bei 22,6
% spezifische anti-NPHV NS3 Antikörper gefunden wurden. Eine Untersuchung von ausgewählten Vollblütern zeigte, dass 68 % anti-NPHV NS3 Antikörper-positiv waren und 10,43 % virale NPHV RNA trugen (PFAENDER et al. 2015). Die Ursache für die höhere Infektionsrate bei Vollblütern im Vergleich zu anderen Rassen ist bislang un-
12
bekannt. Diskutiert werden genetische Faktoren, ein erhöhter Impfeinsatz, die aus- schließliche Bedeckung im Natursprung und damit verbundene Transporte oder der gehäufte Einsatz von Immun- oder Blutprodukten bei Vollblütern (PFAENDER et al.
2015). Des Weiteren fanden sowohl MATSUU et al. (2015) als auch GEMAQUE et al. (2014) mehr NPHV RNA-Träger bei den Untersuchungen von Renn- und Sport- pferden (Matsuu: 13,68 %; Gemaque: 18,1 %). Bei Eseln und Mulis konnte das Virus bisher nicht gefunden werden (GEMAQUE et al. 2014). Zusätzlich beschrieben MATSUU et al. (2015), dass bei Pferden unter zwei Jahren eine signifikant höhere Prävalenz von NPHV RNA-positiven Pferden feststellbar war (37,34 % NPHV RNA- positiv und 43,37 % anti-NPHV NS3 Antikörper-positiv). Einen Unterschied zwischen den Geschlechtern oder regionale Unterschiede waren nicht erkennbar. Ob das Pferd als Träger des nicht-primaten Hepacivirus ein geeignetes Tiermodell für die Hepatitis C Forschung darstellen kann, bleibt noch zu klären (PFAENDER et al.
2015).
2.2.2 Taxonomie und Struktur des NPHV
Über phylogenetische Untersuchungen ist das NPHV dem Genus Hepacivirus, Fami- lie Flaviviridae zugeordnet worden (KAPOOR et al. 2011). Das nicht-primate Hepa- civirus besitzt eine positive Einzelstrang-RNA und ist behüllt. Das Genom umfasst ca. 9,2 Kilobasen (RAMSAY et al. 2015) und setzt sich aus der ORF mit ungefähr 8826 Nukleotiden (MATSUU et al. 2015) und den beiden benachbarten untranslatio- nierten Bereichen mit geschätzten 384 Nukleotiden am 5‘ und am 3‘ Ende zusam- men (BURBELO et al. 2012). Die Nukleotide der ORF kodieren für ein Polyprotein aus 2942 Aminosäuren, das nach der Translation über virale und zelluläre Proteasen in die einzelnen Proteine gespalten wird (PFAENDER et al. 2014) (Abbildung 1).
Analog zum Hepatitis C Virus beginnt die ORF mit dem core-Gen, E1-Gen und E2- Gen und wird von der 5’UTR flankiert. Diese Gene kodieren vermutlich für Struktur- proteine, die für die Kontaktherstellung des Virus mit der Wirtsmembran und dessen Zelleintritt benötigt werden. Die nachfolgenden Gene p7 und NS2 bilden Nicht- Strukturproteine, die für den Zusammenbau des Virus (Assembly) benötigt werden.
Für die Virusreplikation sind vermutlich die Gene NS3, NS4A, NS4B, NS5A und
13
NS5B verantwortlich (BURBELO et al. 2012). Große Abweichungen innerhalb der Nukleotid-Sequenzen der einzelnen Gene zu HCV finden sich vor allem in den Gen- abschnitten E1-E2 und NS5B (PFAENDER et al. 2015).
In der 5‘UTR existieren wie beim Hepatitis C Virus die internal ribosome entry site (IRES), aber nur eine miR-122 Bindungsstelle (BURBELO et al. 2012). Insgesamt zeigten phylogenetische Untersuchungen, dass es mehr Übereinstimmungen im Be- reich des offenen Leserahmens gibt als in den untranslationierten Bereichen zwi- schen dem HCV und NPHV (BURBELO et al. 2012).
(+)RNA-Genom
Polyprotein
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Genomstruktur des nicht-primaten Hepacivirus (NPHV) [modifiziert nach (VON HAHN et al. 2010)].
2.2.2.1 Nachweismethoden des NPHV
Für die Untersuchung der Serumproben auf spezifische Antikörper gegen Antigene des NPHV ist derzeit das Luziferase-Immunpräzipitation-System (LIPS) weit verbrei- tet (BURBELO et al. 2012). Bei diesem Testverfahren werden die Proben auf das Vorliegen von Antikörpern gegen NS3 Antigene untersucht (4.4).
Der Nachweis virusspezifischer Ribonukleinsäure gelingt mit einer quantitativen real- time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (4.5). Das Verfahren ist weit verbreitet und gut etabliert.
C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B
ORF
N 5´UTR
C 3´UTR
14 2.2.3 Klinik des NPHV
Die meisten Pferde mit positivem NPHV RNA Nachweis weisen keine klinischen Krankheitssymptome und keine erhöhten Leberwerte auf, sodass ein subklinischer Krankheitsverlauf für eine NPHV-Infektion vermutet wird (GEMAQUE et al. 2014).
Lediglich zum Zeitpunkt der Viruseliminierung zeigen einige Pferde geringgradig er- höhte Gamma-Glutamyl-Transferase (γ-GT)- und Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)- Werte (PFAENDER et al. 2015; RAMSAY et al. 2015; SCHEEL et al. 2015b). Abwei- chend von der Annahme einer subklinischen Infektion beschreiben REUTER et al.
(2014) den Fall eines natürlich NPHV-infizierten Pferdes mit einem Ikterus und stark veränderten Leberwerten, sodass ein akuter Krankheitsverlauf nicht ausgeschlossen werden kann.
Infektionsstudien zeigen, dass ca. eine Woche post infectionem virale NPHV RNA und ca. 8 - 12 Wochen post infectionem anti-NPHV NS3 Antikörper im Serum nach- weisbar sind (PFAENDER et al. 2015; RAMSAY et al. 2015; SCHEEL et al. 2015b).
Mit Zunahme der Antikörper-Titer kann im Regelfall eine Abnahme des Virusgehalts beobachtet werden. Im Gegensatz zu Menschen mit einer HCV-Infektion eliminieren die meisten Pferde das NPHV. Jedoch können Pferde auch chronisch infiziert sein (LYONS et al. 2014; REUTER et al. 2014; MATSUU et al. 2015; PFAENDER et al.
2015; RAMSAY et al. 2015; SCHEEL et al. 2015b).
Neben dem Nachweis der viralen NPHV RNA im Blut belegen histopathologische Untersuchungen das Vorkommen viraler NPHV RNA neben der Leber auch im Bron- chialepithel, im Kleinhirn und im Tracheobronchial-Lymphknoten (PFAENDER et al.
2015; SCHEEL et al. 2015b). Parallele Untersuchungen mittels Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung zeigen jedoch, dass negativsträngige NPHV RNA als Zeichen für die Virusreplikation nur im Lebergewebe vorkommt (PFAENDER et al. 2015). Leberver- änderungen, eventuell auf Grund einer NPHV-Infektion, konnten bei zwei chronisch infizierten Jährlingen gefunden werden. Die Obduktionen zeigten bei dem einen Pferd eine Gallenganghyperplasie und bei dem anderen eine lymphohistiozytäre He- patitis (RAMSAY et al. 2015). Die Überlegung, ob neben der parenteralen Übertra- gung des NPHV eine vertikale Übertragung von der Stute auf das Fohlen stattfindet, konnte bisher nicht bestätigt werden (MATSUU et al. 2015).
15 2.3 Weitere Hepatitis C Homologe
Der Ursprung des Hepatitis C Virus ist bis heute nicht bekannt (SIMMONDS 2013).
Es gibt Vermutungen, dass das Virus ähnlich wie beim Humanen Immundefizienz- Virus (HIV) vom Affen auf den Menschen übertragen wurde (KEELE et al. 2006). Ei- ne andere Hypothese ist die zoonotische Übertragung vom nicht-primaten Säugetier auf den Menschen (SCHEEL et al. 2015a). Für die erste Hypothese spricht die Ent- deckung des GB-Virus-B (GBV-B) bei einem Tamarin, einem Neuweltaffen im Jahr 1995 (SIMONS et al.) und für die zweite Hypothese der Fund von HCV Homologen bei Hunden (KAPOOR et al. 2011), Pferden (BURBELO et al. 2012), Rindern (BAECHLEIN et al. 2015), Mäusen (KAPOOR et al. 2013b), Ratten (DREXLER et al.
2013) und Fledermäusen (QUAN et al. 2013) (Abbildung 2).
Abbildung 2: Vereinfachte Übersicht der Hepatitis C Homologe und ihre Verwandtschaftsgrade.
Wirtszugehörigkeit: Rot = Rinder; Hellblau = Fledermäuse; Braun = Primaten; Dunkelblau = Ratten und Mäuse; Gelb = Menschen; Grün = Pferde; Violett = Hunde [aus (PYBUS u. THEZE 2015)].
16 2.3.1 Affen
Schimpansen und andere Neuwelt-Affen, wie Pinseläffchen und Nachtaffen, sind für eine Hepatitis C Infektion empfänglich und entwickeln häufig einen akuten Krank- heitsverlauf (BUKH 2012). Im Jahr 1967 transfundierten DEINHARDT et al. einem Neuweltaffen Plasma von einem Chirurgen, der die Initialen G.B. trug und unter einer idiopathischen Hepatitis litt. Dieser Neuweltaffe entwickelte anschließend ebenfalls Symptome einer Lebererkrankung. Erst im Jahr 1995 konnte das Pathogen, das GB- Virus-B (GBV-B) identifiziert werden und in die Familie der Flaviviridae, Genus He- pacivirus eingeordnet werden (SIMONS et al.). Untersuchungen zeigen, dass 28 % der Aminosäuresequenzen aus dem offenen Leserahmen des GBV-B mit dem HCV Genotyp 1 übereinstimmen (MUERHOFF et al. 1995). Jedoch konnte dieses Virus seither nicht wieder bei einem Menschen gefunden werden, sodass der Ursprung weiterhin ungeklärt bleibt (STAPLETON et al. 2011).
Mit der Studie von LAUCK et al. (2013) wurde zum ersten Mal das Vorkommen von Hepaciviren bei Mantelaffen, die sich auf natürlichem Weg infiziert haben, beschrie- ben. Sie benannten das Virus Guereza Hepacivirus (GHV). Es weist phylogenetisch große Ähnlichkeit zum GBV-B, zu dem Ratten (Rodent) Hepacivirus (RHV) und zu dem Fledermaus (Bat) Hepacivirus (BHV) Klasse A auf, sodass ein gemeinsamer Ursprung dieser Hepaciviren vermutet wird (LAUCK et al. 2013).
2.3.2 Hunde
In Nasentupfern von Hunden, die unter unterschiedlichen Atemwegserkrankungen litten und in der Leber von Hunden mit unspezifischen Gastrointestinalerkrankungen wurde 2011 unbekannte virale RNA gefunden (KAPOOR et al.). Die phylogeneti- schen und molekularbiologischen Untersuchungen bestätigten, dass es sich bei dem Virus um eine neue Spezies der Hepaciviren handelte. Das Virus erhielt damit den Namen: Canines Hepacivirus (CHV). Die Sequenzen zwischen dem CHV und dem NPHV sind zu 99 % identisch (BURBELO et al. 2012). Jedoch konnten in nachfol- genden Studien häufig keine CHV RNA oder anti-CHV NS3 Antikörper im Blut oder
17
in Gewebeproben von Hunden gefunden werden (BURBELO et al. 2012; BEXFIELD et al. 2014; VAN DER LAAN et al. 2014).
Nur LYONS et al. (2014) wiesen bei einem Hund anti-CHV NS3 Antikörper nach und EL-ATTAR et al. (2015) fanden bei Zwingerhunden mit Atemwegserkrankungen vira- le Canine (Cn) NPHV RNA in der Trachea, in der Lunge und in der Leber. Histologi- sche Veränderungen des Respirationstraktes oder der Leber standen jedoch nicht im signifikanten Zusammenhang mit dem Vorkommen von viraler CHV RNA (EL-ATTAR et al. 2015).
2.3.3 Rinder
In der Studie von BURBELO et al. (2012) konnten bei einer Kuh anti-CHV NS3 Anti- körper nachgewiesen werden. Passend dazu fanden BAECHLEIN et al. (2015) in 1,6% der Serumproben von 320 Rindern aus unterschiedlichen Herden aus Deutsch- land virale RNA und benannten das Virus Bovines Hepacivirus (BovHepV). Neben den Serumproben konnte der höchste Virusgehalt in der Leber festgestellt werden.
Die Tiere zeigten keine klinischen Symptome einer Lebererkrankung. Über Verlaufs- kontrollen bestätigte sich analog zum NPHV, dass die meisten Rinder das Virus eli- minierten, aber einige Tiere infiziert blieben. Das BovHepV besitzt 8.841 Nukleotide und damit weniger als das HCV oder das NPHV. Die ORF setzt sich aus 8.337 Nuk- leotiden zusammen und kodiert für ein Polyprotein aus 2.779 Aminosäuren (BAECHLEIN et al. 2015). In Verbindung mit weiteren phylogenetischen Untersu- chungen konnten mehr Gemeinsamkeiten zu dem GBV-B und dem RHV festgestellt werden als zu dem HCV oder NPHV (BAECHLEIN et al. 2015).
Vergleichbare Untersuchungsergebnisse erzielten CORMAN et al. (2015), die in 8,5% der Serumproben afrikanischer Rinder bovine Hepacivirus RNA fanden. Phylo- genetische Untersuchungen zeigten große Unterschiede zwischen den gefundenen bovinen Hepaciviren, sodass von mindestens zwei Abstammungslinien ausgegangen wurde. Eine geschlechts- oder altersabhängige Prädisposition konnte nicht festge- stellt werden.
18 2.3.4 Mäuse, Ratten und Fledermäuse
Neben den Haussäugetieren wurden HCV-Homologe bei Mäusen (KAPOOR et al.
2013b), Ratten (DREXLER et al. 2013; FIRTH et al. 2014) und bei Fledermäusen (QUAN et al. 2013) gefunden. KAPOOR et al. (2013b) wiesen in Serumproben von wilden Ratten aus Nord-Amerika, von Weißfußmäusen, von Rauhaar- Taschenmäusen und von amerikanischen Buschratten Hepaciviren nach. Zeitgleich stellten DREXLER et al. (2013) das Vorhandensein von Hepaciviren in Ratten aus Europa, Afrika, Thailand und Mexiko fest. Sie wurden als Ratten (Rodent) Hepacivi- rus (RHV) bezeichnet, besitzen jedoch mehr Ähnlichkeit zum GBV-B als zum HCV (PFAENDER et al. 2014). In einer weiteren Studie von FIRTH et al. (2014) konnten zwei neue Hepaciviren bei Wanderratten aus New York City gefunden werden (Nor- way rat hepacivirus (NrHV) -1 und -2). Histopathologische Untersuchungen von RHV-positiven Tieren bestätigten einen hohen Virusgehalt und Entzündungssymp- tome innerhalb der Leber (DREXLER et al. 2013). Außerdem konnte negativsträngi- ge virale RNA nur in der Leber infizierter Ratten nachgewiesen werden, sodass ana- log zum HCV und NPHV von einem Lebertropismus ausgegangen wurde (FIRTH et al. 2014).
Neben den Untersuchungen an Ratten konnten mehrere Forschungsgruppen HCV- Homologe bei Fledermäusen nachweisen [Bat Hepacivirus (BHV)]. QUAN et al.
(2013) fanden das BHV bei insektenfressenden Fledermäusen aus Kenia und DREXLER et al. (2013) bei Fledermäusen aus West- und Südafrika. Bedingt durch die unterschiedlichen Sequenzierungsergebnisse gibt es 22 verschiedene Spezies des BHV, die in drei Klassen aufgeteilt sind (SCHEEL et al. 2015a). Die Klasse A, die vor allem Parallelen zum GBV-B aufweist und die Klassen C und D, die größere Ähn- lichkeiten zum HCV bzw. NPHV besitzen. Insgesamt scheinen 5 % der Fledermäuse Träger viraler BHV RNA zu sein (SCHEEL et al. 2015a). Zwischen den Ratten- und Fledermaus-Hepaciviren gibt es phylogenetisch große Unterschiede, sodass vermu- tet wurde, dass die beiden Ur-Ahnen für das HCV sein könnten (PYBUS u. GRAY 2013).
19 2.4 Lebererkrankungen beim Pferd
2.4.1 Allgemeines
Die Leber synthetisiert 90 % der Plasma-Proteine, ist zentraler Ort der Glukoneoge- nese und Glykolyse und reguliert den Fett-Stoffwechsel (BARTON 2010). Neben den metabolischen Funktionen spielt die Leber eine essentielle Rolle in der Elimination körpereigener und körperfremder schädlicher Stoffe. Diese werden anschließend zusammen mit der Galle oder über die Niere ausgeschieden. Zusätzlich werden von der Leber einige Vitamine (A, D und B12) sowie Eisen und Kupfer gespeichert. Bei Feten ist die Leber maßgeblich für die Haematopoese verantwortlich (ENGELHARDT u. AURICH 2015).
2.4.1.1 Vorkommen
Lebererkrankungen kommen beim Pferd relativ häufig vor, verlaufen aber aufgrund der hohen Reserve- und Regenerationsfähigkeit meist subklinisch (GEHLEN et al.
2010). Eindeutige klinische Symptome treten erst auf, wenn über 75 % des Leber- gewebes zerstört sind (MCAULIFFE 2014). Abhängig von den Noxen entstehen aku- te oder chronische Krankheitsbilder. Die meisten Noxen führen zu Veränderungen und Zerstörung der Hepatozyten. Eine Entzündung der Gallengänge und dem an- grenzenden Lebergewebe (Cholangiohepatitis) kann ebenso auftreten. Gallen- gangobstruktionen, insbesondere durch Gallengangsteine, Cholelithen sind seltener (SAVAGE 1999).
2.4.1.2 Klinische Symptome
Die klinischen Symptome sind meist sehr unspezifisch, weil die hohe Regenerations- und Reservekapazität der Leber den Funktionsausfall einzelner Leberbezirke auf- fängt, sodass Lebererkrankungen ante mortem schwer zu diagnostizieren sind (BARTON 2010).
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Pferde mit einer Lebererkrankung haben häufig weniger Appetit, verhalten sich ruhi- ger und verlieren mit zunehmender Erkrankungsdauer an Gewicht. Im fortgeschritte- nen Stadium zeigt sich meistens ein Ikterus aufgrund einer Hyperbilirubinämie. Für eine Differenzierung eines prähepatischen, eines hepatischen oder eines posthepati- schen Ikterus sind zusätzliche diagnostische Untersuchungen notwendig. Bei Pfer- den mit einer akuten Leberschwellung oder Gallengangobstruktion treten häufig un- spezifische, starke Koliksymptome auf. Die Pferde schauen zum Bauch und die Pal- pation des Abdomens, insbesondere der rechten Thorax-Seite, hinter den Rippen kann schmerzhaft sein (GEHLEN et al. 2010).
Des Weiteren neigen manche lebererkrankten Pferde zu petechialen Blutungen, Ek- chymosen oder Hämorrhagien, weil nicht ausreichend Fibrinogen von der Leber syn- thetisiert wird. Außerdem kann aufgrund mangelnder Galleproduktion nicht ausrei- chend Vitamin K aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert werden, das essentiell für die Bildung der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX, X und Protein C ist. Eine Hypopro- teinämie ist möglich, tritt aber selten auf (PARRAGA et al. 1995). Fieber kann bei Pferden mit Lebererkrankungen konstant oder intermittierend auftreten. Eine En- dotoxämie, Steatorrhoe, ein Pruritus oder eine Pigmenturie sind ebenfalls selten (BARTON 2010).
2.4.1.3 Diagnose
Für die Diagnose, die Therapie und die Prognose von Lebererkrankungen sind Un- tersuchungen von Blutparametern von großer Bedeutung. Die Bestimmung der Kon- zentrationen von Leberenzymen, von Gallensäuren, Bilirubin und anderen leberspe- zifischen Parametern können Hinweise auf den Krankheitsauslöser, die Dauer der Erkrankung, das Ausmaß an geschädigten Strukturen und den primären Sitz der Er- krankung geben.
Eine Erhöhung der Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)- Konzentration im Blut kenn- zeichnet mit großer Wahrscheinlichkeit eine akute Schädigung der Leberzellen, weil dieses Enzym trotz Vorkommen im Nierengewebe, im Gehirn, im Muskel und im Darm die höchste Aktivität in den Hepatozyten aufweist (BARTON 2010). Die Aspar- tat-Aminotransferase (AST) und die Alanin-Aminotransferase (ALT) kommen zwar im
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Zytosol der Hepatozyten vor, haben aber eine höhere Aktivität in den Muskelzellen, sodass bei einer Konzentrationserhöhung im Blut zunächst eine Muskelerkrankung in Betracht gezogen werden sollte. Die Laktatdehydrogenase (LDH) kommt in allen Geweben vor und ist aus diesem Grund zur Diagnose von Lebererkrankungen beim Pferd wenig geeignet. Eine Auftrennung in die einzelnen Isoenzyme mittels Elektro- phorese und der Bestimmung des Isoenzym 5 wäre spezifischer. Aber das Isoenzym 5 liegt auch in der Skelettmuskulatur vor. Das Enzym Alkalische Phosphatase (AP) kommt im Knochen, im Darm, in der Niere in der Plazenta und der Leber vor und ist damit wenig spezifisch für eine Lebererkrankung (AMBROJO et al. 2013). Jedoch ist eine Konzentrationserhöhung häufig ein sensitiver Indikator für eine Cholestase (PEARSON 1999).
Im Gegensatz zu den bisher genannten Enzymen, die alle im Zytosol und zumeist an die Mitochondrien gebunden vorliegen, ist die Gamma-Glutamyl-Transferase (γ-GT) membrangebunden am Gallengangepithel (MEYER u. WALTON 2014). Eine Kon- zentrationserhöhung im Blut ist daher leberspezifisch und weist auf eine chronische Erkrankung und insbesondere auf das Vorliegen einer Gallengangerkrankung hin.
Die γ-GT kommt außerdem im Pankreas und in den Nierentubuli vor, wird aber in der Niere bei Überschuss über den Urin aus dem Organismus eliminiert. Da Pankreaser- krankungen beim Pferd sehr selten sind, bleibt die γ-GT primär leberspezifisch (BARTON 2010). Bei der Beurteilung der γ-GT- Werte ist zu beachten, dass die Wer- te beim Fohlen physiologisch höher sind als beim adulten Pferd (PATTERSON u.
BROWN 1986).
Neben der Untersuchung der Enzyme gibt die Gallensäurekonzentration spezifische Hinweise auf eine Lebererkrankung (AMBROJO et al. 2013). Gallensäuren werden in den Hepatozyten gebildet und sind für die Fettresorption und die Fettverdauung un- erlässlich. Damit ist die Gallensäure-Konzentration ein Maß für die Funktionalität der Leber. Insbesondere bei Gallengangobstruktionen und portosystemischen Shunts sind hohe Werte zu beobachten (BARTON 2010).
Die Hyperbilirubinämie führt zum klinischen Symptom des Ikterus. Die Konzentrati- onsbestimmung des Gesamtbilirubins sowie des konjugierten und unkonjugierten Bilirubins sind daher für die Diagnostik von Lebererkrankungen und der Differenzie-
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rung eines Ikterus von großer Bedeutung. Einer Konzentrationserhöhung des unkon- jugierten Bilirubins liegt meist eine starke innere Blutung zugrunde (prähepatischer Ikterus). Eine hepatozelluläre Erkrankung führt dagegen zu einer Konzentrationser- höhung des konjugierten Bilirubins (hepatischer Ikterus). Wenn der Anteil des konju- gierten Bilirubins am Gesamtbilirubin mehr als 30 % beträgt, liegt häufig eine Cho- lestase vor (posthepatischer Ikterus). Zu beachten ist, dass die Konzentration des unkonjugierten Bilirubins aufgrund von Anorexie und bestimmten Medikamenten er- höht sein kann (BARTON 2010; MEYER u. WALTON 2014).
Trotz der verringerten Syntheseleistung der Leber bei Erkrankung, sind eine Hy- poproteinämie und -albuminämie selten (PARRAGA et al. 1995). Erstens besitzt Al- bumin mit 19 bis 20 Tagen eine sehr lange Halbwertszeit und zweitens werden bei Verlust von Kupfer‘schen Zellen vermehrt Gammaglobuline gegen die erhöhte An- zahl von Antigenen gebildet, sodass eine Hypergammaglobulinämie vorliegt.
2.4.2 Virale Lebererkrankungen
In den letzten Jahren sind neue hepatotrope Viren in der Familie Flaviviridae bei Pferden und anderen Tierarten gefunden und identifiziert worden (CHANDRIANI et al. 2013; PFAENDER et al. 2015).
Neben dem bereits erwähnten NPHV sind zwei weitere Viren, das equine Pegivirus 1 (EPgV1) und das „Theiler‘s Disease assoziierte Virus“ (TDAV) kürzlich in Serumpro- ben von Pferden gefunden worden, die zum Genus Pegivirus gehören (CHANDRIANI et al. 2013; KAPOOR et al. 2013a). Das EpgV1 scheint im Gegensatz zu dem TDAV, das als Pathogen für die Theiler‘s Disease vermutet wird, keine Er- krankung auszulösen (POSTEL et al. 2016).
Akute hepatische Nekrose, Serum-Hepatitis oder Serumkrankheit gelten als Syno- nyme für die Theiler‘s Disease. Die Erkrankung verläuft akut und tritt bei adulten Pferden auf. Die Pferde zeigen häufig Fieber, einen Ikterus, Anorexie, Kolik, einen dunklen Urin und Anzeichen einer Hepatoenzephalopathie (ALEMAN et al. 2005).
Zusätzlich können plötzliche Todesfälle beobachtet werden. Die Symptome schreiten
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schnell voran und für betroffene Tiere endet die Theiler‘s Disease meist tödlich. Ob- duktionen erkrankter Pferde wiesen meist zentrolobuläre hepatozelluläre Nekrosen auf (ALEMAN et al. 2005). Erhöhte GLDH- und Bilirubinwerte sind feststellbar (SMITH et al. 1991). Im Jahre 1918 ist diese Erkrankung zum ersten Mal bei einem Pferd, das mit einer Kombination aus Lebendimpfstoff und Pferde-Antiserum gegen die Afrikanische Pferdepest geimpft wurde, beschrieben worden (THEILER 1918).
Weitere Fälle in unterschiedlichen Ländern zeigten, dass fast alle betroffenen Pferde biologische Produkte equinen Ursprungs erhalten hatten, bevor Symptome auftraten.
So gab es Fälle nach der Gabe von Tetanus-Antitoxin (SMITH et al. 1991), nach An- tisera gegen Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Streptococcus ssp, In- fluenza oder Equines Herpesvirus (EHV) 1 und 4 (ALEMAN et al. 2005). Studien stellten ein erhöhtes Risiko für laktierende Zuchtstuten (MEYER u. WALTON 2014) und für Pferde, die jünger als 2 Jahre alt sind fest (WALDRIGE 2006). Außerdem traten die Erkrankungen im Sommer und im Herbst häufiger auf (ALEMAN et al.
2005). Inwiefern das TDAV in biologischen Produkten equinen Ursprungs vorkommt und tatsächlich das Pathogen für die Theiler‘s Disease darstellt, müssen weitere Studien zeigen.
2.5 Epidemiologische Untersuchungen
Das Ziel epidemiologischer Untersuchungen ist neben der Bestimmung von Inziden- zen und Prävalenzen, die Analyse der Verbreitung von Krankheiten in einer Popula- tion und von Faktoren, die das Vorkommen von Krankheiten beeinflussen können (KREIENBROCK et al. 2012). Je nach Fragestellung bzw. Untersuchungsziel eignen sich unterschiedliche Studientypen.
Querschnittstudien werden für die Bestimmung von Prävalenzen von Erkrankungen (Prävalenzstudien) in einer Population und von potentiellen Risikofaktoren einge- setzt. Dafür werden zu einem festgelegten Zeitpunkt aus einer ausgewählten Studi- enpopulation eine repräsentative Anzahl an Stichproben entnommen bzw. Untersu-
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chungsmerkmale analysiert. Ein großer Nachteil ist, dass diese Studien in der analy- tischen Epidemiologie zum Kausalitätsnachweis nur bedingt geeignet sind, da die Probenentnahmen unabhängig vom Infektionszeitpunkt und der Erkrankung stattfin- den (KLUG et al. 2004). Die Querschnittsstudie dient daher vor allem der Beschrei- bung eines Ist-Zustandes in einer Untersuchungskohorte und der Hypothesengene- rierung (KREIENBROCK et al. 2012).
Ist das Ziel der Untersuchung dagegen die Bestimmung kausaler Zusammenhänge zwischen einer Erkrankung und einer Exposition x sind vor allem Kohortenstudien, die auch als Longitudinal-, Follow-up- oder prospektive Studie bezeichnet werden, geeignet (KLUG et al. 2004). Dabei werden Probanden über einen festgelegten Zeit- raum auf das Eintreten bedeutender Ereignisse, wie Erkrankung oder Todesfall, hin untersucht (KREIENBROCK et al. 2012). Zusätzlich werden häufig Probanden, die nicht-exponiert sind beobachtet und als Vergleichsgruppe untersucht. Dadurch kann eine höhere Inzidenz in der Risikogruppe gegenüber der Vergleichsgruppe auf das Einwirken von Risikofaktoren zurückgeführt werden. Ein Nachteil dieser Studie ist der meist höhere Kosten- und Zeitaufwand (PETRIE u. WATSON 2013).
Ein weiterer Studientyp, die sogenannte Fall-Kontroll-Studie eignet sich insbesonde- re für die Analyse seltener Erkrankungen und dient der Bestimmung von Risikofakto- ren (KLUG et al. 2004). Dabei wird retrospektiv eine Gruppe von Erkrankten (Fälle) mit einer Gruppe Gesunden (Kontrolle) aus einer gemeinsamen Population hinsicht- lich einer zeitlich vorausgegangenen Exposition miteinander verglichen (KREIENBROCK et al. 2012). Die Hauptschwierigkeit des Studientyps ist die Aus- wahl einer geeigneten Kontrollgruppe und die Datenerhebung bei Fällen und Kontrol- len gleichermaßen zu standardisieren (KREIENBROCK et al. 2012).
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3 Material
3.1 Studienkooperation
Die vorliegende Studie erfolgte in Kooperation mit dem Institut für Experimentelle Virologie, TWINCORE Zentrum für Experimentelle und Klinische Infektionsforschung GmbH in Hannover und dem Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e.V. in Köln.
3.2 Studienpopulation und Probengut
Die Studienpopulation bestand aus 733 Vollblutpferden, von denen im Rahmen der Herbstuntersuchung 2014 (September und Oktober 2014) zu diagnostischen Zwe- cken Blut (EDTA-antikoaguliertes Vollblut und Serum) entnommen wurde. In Koope- ration mit dem Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e.V. wurden die Besitzer der Pferde zuvor schriftlich über die geplanten Probenentnahmen informiert und aufge- klärt. Die Pferde waren alle als Zuchtpferde im Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. eingetragen und befanden sich in Niedersachsen, Hamburg, Schles- wig-Holstein und Nordrhein-Westfalen.
Die Blutproben wurden innerhalb von 12 Stunden nach der Entnahme in das Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht. Dort fand zunächst eine hämatologische Untersuchung (4.2) statt, bevor das Serum, wel- ches mittels Zentrifugation (Universal 320®, Hettich, Tuttlingen Deutschland) bei 3000 Umdrehungen über 6 min gewonnen und anschließend bei - 80 °C aserviert wurde.
26 3.3 Labormaterialien
Für die Untersuchung der Serumproben auf anti-NPHV NS3 Antikörper und virale NPHV RNA sind verschiedene Chemikalien, Pufferlösungen, Plasmide, Oligonukleo- tide und Geräte verwendet worden, die im Anhang unter 10.1 (Labormaterialien) auf- gelistet sind.
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4 Methode
4.1 Klinische Allgemeinuntersuchung
Eine klinische Allgemeinuntersuchung der Probanden wurde zusammen mit der Be- stimmung des Fruchtbarkeitsstatus von den Untersuchern der Herbstuntersuchung durchgeführt.
4.2 Hämatologische Untersuchung
Im Rahmen der hämatologischen Untersuchung, die im Labor der Klinik für Pferde Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stattfand, wurden die Zahl der weißen (WBC) und roten Blutkörperchen (RBC), der Hämoglobingehalt (HGB), der Hämato- krit (HCT) und der Thrombozytengehalt (PLT) bestimmt. Die Untersuchungen erfolg- ten mit dem Sysmex Hämatologieanalysator KX-21N® (Sysmex, Hamburg, Deutsch- land). Eine Bestimmung des Gesamteiweißgehalts (GE) im Plasma fand mit einem Handrefraktometer (Euromex, Arnhem, Niederlande) nach Zentrifugation (Haemato- krit210®, Hettich, Tuttlingen, Deutschland) bei 5000 Umdrehungen über 2 min statt.
4.3 Blutchemische Untersuchung
Alle Pferde wurden entsprechend dem Nachweis von NPHV RNA und/oder anti- NPHV NS3 Antikörper in folgende Gruppen eingeteilt:
[AK - / RNA - ]: anti-NPHV NS3 Antikörper negativ + NPHV RNA negativ, [AK + / RNA - ]: anti-NPHV NS3 Antikörper positiv + NPHV RNA negativ, [AK + / RNA + ]: anti-NPHV NS3 Antikörper positiv + NPHV RNA positiv, [AK - / RNA + ]: anti-NPHV NS3 Antikörper negativ + NPHV RNA positiv.
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Für die Bestimmung leberspezifischer Parameter wurde die gleiche Anzahl an Pro- ben aus den Gruppen [AK - / RNA -], [AK + / RNA +] und [AK - / RNA +] untersucht.
Es wurde darauf geachtet, dass Proben von Pferden mit ungefähr gleichem Alter und vom selben Betrieb untersucht wurden um alters- oder fütterungs- oder haltungsab- hängige Faktoren zu reduzieren.
Insgesamt wurden 78 Proben (26 Proben je Gruppe) auf Trockeneis an das Zentral- labor der Kleintierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Justus-Liebig- Universität Gießen verschickt. Dort fand eine Untersuchung der Albumin-, Bilirubin-, Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)-, Gallensäuren-, Alkalische Phosphatase (AP)-, Aspartat-Aminotransferase (AST)-, Laktat-Dehydrogenase (LDH)- und Gamma- Glutamyl-Transferase (γ-GT)- Konzentrationen statt.
4.4 Untersuchung auf anti-NPHV NS3 Antikörper
Die Untersuchung auf anti-NPHV NS3 Antikörper fand im Institut für Experimentelle Virologie, TWINCORE Zentrum für Experimentelle und Klinische Infektionsforschung GmbH in Hannover statt.
4.4.1 Antigenherstellung
Für die Antigenherstellung wurden Cos-1-Zelllinien genutzt, die nach einem Stan- dard-Gewebekulturprotokoll in Gibco®DMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) mit 10 % Gibco® fetalem Kälberserum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) kultiviert wurden. Analog zu BURBELO et al. (2012) erhielten wir ein Plasmid, an welches eine DNA-Teilsequenz des Nicht-Strukturprotein 3 (NS3)-Peptids (Heli- kase) mit dem C-terminalen Ende der Renilla luciferase (Ruc) fusioniert wurde.
Einen Tag vor der geplanten Transfektion wurden neue Zellkulturschalen mit Cos-1- Zellen in einer Konzentration von ca. 2 x 106 Zellen/Platte vorbereitet. Für die Trans- fektion wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) 94
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μl des Mediums GibcoTMOpti-MEM®I (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) und 6 μl X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Deutschland) pipettiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 1- 2μg des hergestellten Plasmids, in das der Expressionsvektor pRen2, die Renilla luciferase und die DNA-Teilsequenz für das NS3-Antigen eingebaut wurden in das Reaktionsgefäß zugefügt, gut vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten in- kubiert. Eine vorsichtige Übertragung der gesamten Lösung zu den Cos-1-Zellen folgte. Die Zellen wurden anschließend für 48 Stunden bei 37 °C in einem CO2- Inku- bator (5 %) inkubiert.
Zwei Tage nach der Transfektion fand die Gewinnung der RUC- NPHV NS3 Antige- ne, die von den Cos-1-Zellen gebildet wurden, statt. Dafür wurde zunächst die Zell- kulturschale mit 6 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 1,4 ml Lyse-Puffer aufgeschlossen, um so die RUC- NPHV NS3 Antigene zu gewinnen. Die gewonnenen Zelllysate (Antigene) wurden zweimal bei 12.500 Umdrehungen pro Minute für 4 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Nach der ersten Zentrifugation wurden Schmutz und Zellreste von den Wänden vorsichtig entfernt, nach der zweiten wurde der Überstand der zwei Reaktionsröhrchen in ein neues Reaktionsröhrchen auf Eis überführt.
Zuletzt wurde die Lumineszenz des hergestellten Lysats gemessen. Dafür wurde 1 μl des Lysats mit 8 μl PBS in einem neuen Reaktionsröhrchen verdünnt und nach direk- ter Zugabe von 100 μl Coelenterazin-Substrat (p.j.k. GmbH, Kleinblittersdorf) mit Hil- fe des Luminometers (LB 90 Centro XS3; Berthold, Freiburg) gemessen.
Nach der Messung von vier Proben ergab sich der Durchschnittswert von 661 000 relativer Licht Einheit (RLU) / μl, sodass für die Durchführung des Luciferase- Immunpräzipitations-Systems (LIPS) mit 107 RLU 15 μl Antigen pro Well benötigt wurden. Das Ruc-Antigen-Lysat wurde aliquotiert und bei - 80 °C für die folgenden Untersuchungen aufbewahrt.
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4.4.2 Durchführung des Luziferase-Immunpräzipitations-Systems (LIPS)
Für die Herstellung der Serum Master Platte wurden jeweils 50 μl Serumprobe mit 450 μl Puffer A verdünnt, so dass eine Verdünnung von 1:10 entstand. Die Proben wurden jeweils im Doppelansatz in eine 1,2 ml Polypropylen-96-Well-Platte (LVL technologies, Crailsheim, Deutschland) pipettiert. Puffer A galt als Negativkontrolle und das kommerzielle Pferdeserum (AXA 29619®, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) stellte als bereits untersuchtes und als NS3 Antikörper-positiv diag- nostiziertes Pferdeserum die Positivkontrolle dar. Beide Kontrollen wurden mit 450 μl Puffer A im analogen Mischungsverhältnis verdünnt. Nach Verschluss der Serum Master Platte mit Parafilm-Folie (Bemis® Flexible Packaging, Neenah Paper, Alpha- retta, Giorgia) wurde diese bei 4 °C aufbewahrt. Es folgte eine Inkubation bei Raum- temperatur auf dem Schüttler (Unimax 1010®, Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland) für ein bis zwei Stunden. In eine weitere 96-Well-Zellkulturplatte (Fal- con, Durham, USA) wurden zunächst 40 μl Puffer A und 50 μl (= 1 x 107 Lichteinhei- ten) RUC-NPHV NS3 Antigen verdünnt in Puffer A vorgelegt. Danach wurden 10 μl aus der Serum Master Platte dazu pipettiert, sodass eine Antikörper-Antigen-Bindung während einer weiteren einstündigen Inkubation stattfinden konnte. Für das Binden vorhandener Antikörper-Antigen-Komplexe dienten Ultralink Protein A/G Beads®
(Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Dazu wurden fünf Mikroliter einer 30 %-igen Suspension des Ultralink Protein A/G Beads® (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) in PBS und die gesamten 100 μl des Antigen-Antikörper-Gemisches in eine 96-Well- Filter-HTS-Platte (Merck Millipore, Bedford, Massachusetts) pipettiert. Es folgte eine weitere Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde auf dem Schüttler bei 300 Umdrehungen pro Minute (rpm) (Unimax 1010®, Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland). Im Anschluss wurde die Filterplatte mit einer 96-Well-Vakuumpumpe (Welch, Monroe, Louisiana, USA) zunächst 8-mal mit jeweils 100 μl Puffer A sowie 2- mal mit jeweils 100 μl PBS gewaschen und danach mit Zellstofftüchern abgetrocknet.
Die Lumineszenzmessung erfolgte mithilfe eines Plattenluminometers (LB 960 Cen- tro XS3; Berthold, Freiburg, Deutschland) nach automatischer Zugabe von Coelen- terazin-Lösung (p.j.k. GmbH, Kleinbittersdorf, Deutschland), gesteuert durch das zu-
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gehörige Softwareprogramm Microwin2000 (Mikrotek Laborsysteme GmbH, Overath, Deutschland). Pro Well wurden zunächst 50 μl Coelenterazin-Lösung zugefügt, dann für 2 Sekunden geschüttelt und anschließend innerhalb von 5 Sekunden die Fluores- zenz gemessen.
Im Anschluss wurden die Daten nach Excel (Microsoft Office, Microsoft Corporation, Redmond, Washington) exportiert. Eine graphische Auswertung der Ergebnisse fand unter anderem mit der GraphPadPrism® Software (San Diego, Kalifornien) statt.
4.4.3 Bestimmung von Sensitivität und Spezifität der Messergebnisse
Für die Bestimmung von Sensitivität und Spezifität der Messergebnisse wurde ana- log der Methoden anderer Untersucher ein Grenzwert („cut-off“) berechnet, der den Mittelwert plus die dreifache Standardabweichung des Puffer-A-Ruc-Extrakt-Protein- A/G-Gemischs wiedergibt (BURBELO et al. 2012; PFAENDER et al. 2015). Der cut- off-Wert lag in dieser Versuchsreihe bei 28.812 RLU. Wenn die gemessene RLU ei- ner Probe oberhalb des cut-off-Wertes lag, wurde diese Probe als anti-NPHV NS3 Antikörper-positiv gewertet.
4.5 Untersuchung auf NPHV RNA mittels quantitativer real-time PCR
Eine Bestimmung von Virusantigen wurde mittels quantitativer real-time PCR im Institut für Experimentelle Virologie, TWINCORE Zentrum für experimentelle und kli- nische Infektionsforschung GmbH in Hannover durchgeführt. Dafür wurde die virale RNA aus den Serumproben extrahiert, in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrie- ben und anschließend wurde mittels SYBRGreen-basierter quantitativer real-time PCR der virale RNA-Gehalt in den Proben bestimmt.
32 4.5.1 Extraktion der viralen RNA
Im ersten Schritt wurde die virale RNA mit Hilfe des High-Pure Viral RNA Kit® (Ro- che, Mannheim, Deutschland) extrahiert.
Zur Extraktion wurde wie folgt vorgegangen:
1. Für die Präparation von 30 Serumproben, wurden 120 μl Poly (A)- und 12 ml Binding Buffer in einem 15 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen (Falcon, Durham, USA) vorbereitet.
2. In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) wurden 400μl Binding Buffer mit Poly (A) und 200 μl Serum gegeben und vermischt.
3. Nach Herstelleranweisung wurde ein 1,0 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nüm- brecht, Deutschland) als Sammelgefäß benutzt und in dieses ein High Pure Filter Tube (Filter-Zentrifugensäule) eingesetzt.
4. Die 600 μl Probenlösung wurde vollständig in das obere Reservoir der Filter- Zentrifugensäule pipettiert.
5. Das zusammengesetzte Sammelgefäß wurde in einer Tischzentrifuge (Ep- pendorf Centrifuge 5417C®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 8000 rpm für 15 Sekunden zentrifugiert.
6. Das Sammelröhrchen wurde mit aufgefangener Flüssigkeit verworfen und die Filter-Zentrifugensäule in ein neues Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) eingesetzt.
7. Danach wurden 500 μl Inhibitor-Removal Buffer auf die Filter-Zentrifugen- säulen pipettiert um Kontaminanten (intakte Viren, Nukleasen und andere zel- luläre Komponenten), die die quantitative real-time PCR negativ beeinflussen, möglichst vollständig zu eliminieren.
8. Es folgte eine Zentrifugation für 1 Minute bei 8000 rpm.
9. Das Sammelgefäß mit Flüssigkeit wurde verworfen und die Filter-Zentrifugen- säule in ein neues Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) ein- gesetzt.
10. Die Reinigung von Salzen, Proteinen und anderen Verunreinigungen wurde durch 2-maliges Waschen der Filter-Zentrifugensäule mit je 450 μl Wash Buf-
