Die Studienpopulation bestand aus 733 Vollblutpferden, von denen im Rahmen der Herbstuntersuchung 2014 (September und Oktober 2014) zu diagnostischen Zwe-cken Blut (EDTA-antikoaguliertes Vollblut und Serum) entnommen wurde. In Koope-ration mit dem Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e.V. wurden die Besitzer der Pferde zuvor schriftlich über die geplanten Probenentnahmen informiert und aufge-klärt. Die Pferde waren alle als Zuchtpferde im Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. eingetragen und befanden sich in Niedersachsen, Hamburg, Schles-wig-Holstein und Nordrhein-Westfalen.
Die Blutproben wurden innerhalb von 12 Stunden nach der Entnahme in das Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht. Dort fand zunächst eine hämatologische Untersuchung (4.2) statt, bevor das Serum, wel-ches mittels Zentrifugation (Universal 320®, Hettich, Tuttlingen Deutschland) bei 3000 Umdrehungen über 6 min gewonnen und anschließend bei - 80 °C aserviert wurde.
26 3.3 Labormaterialien
Für die Untersuchung der Serumproben auf anti-NPHV NS3 Antikörper und virale NPHV RNA sind verschiedene Chemikalien, Pufferlösungen, Plasmide, Oligonukleo-tide und Geräte verwendet worden, die im Anhang unter 10.1 (Labormaterialien) auf-gelistet sind.
27
4 Methode
4.1 Klinische Allgemeinuntersuchung
Eine klinische Allgemeinuntersuchung der Probanden wurde zusammen mit der Be-stimmung des Fruchtbarkeitsstatus von den Untersuchern der Herbstuntersuchung durchgeführt.
4.2 Hämatologische Untersuchung
Im Rahmen der hämatologischen Untersuchung, die im Labor der Klinik für Pferde Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stattfand, wurden die Zahl der weißen (WBC) und roten Blutkörperchen (RBC), der Hämoglobingehalt (HGB), der Hämato-krit (HCT) und der Thrombozytengehalt (PLT) bestimmt. Die Untersuchungen erfolg-ten mit dem Sysmex Hämatologieanalysator KX-21N® (Sysmex, Hamburg, Deutsch-land). Eine Bestimmung des Gesamteiweißgehalts (GE) im Plasma fand mit einem Handrefraktometer (Euromex, Arnhem, Niederlande) nach Zentrifugation (Haemato-krit210®, Hettich, Tuttlingen, Deutschland) bei 5000 Umdrehungen über 2 min statt.
4.3 Blutchemische Untersuchung
Alle Pferde wurden entsprechend dem Nachweis von NPHV RNA und/oder anti-NPHV NS3 Antikörper in folgende Gruppen eingeteilt:
[AK - / RNA - ]: anti-NPHV NS3 Antikörper negativ + NPHV RNA negativ, [AK + / RNA - ]: anti-NPHV NS3 Antikörper positiv + NPHV RNA negativ, [AK + / RNA + ]: anti-NPHV NS3 Antikörper positiv + NPHV RNA positiv, [AK - / RNA + ]: anti-NPHV NS3 Antikörper negativ + NPHV RNA positiv.
28
Für die Bestimmung leberspezifischer Parameter wurde die gleiche Anzahl an Pro-ben aus den Gruppen [AK - / RNA -], [AK + / RNA +] und [AK - / RNA +] untersucht.
Es wurde darauf geachtet, dass Proben von Pferden mit ungefähr gleichem Alter und vom selben Betrieb untersucht wurden um alters- oder fütterungs- oder haltungsab-hängige Faktoren zu reduzieren.
Insgesamt wurden 78 Proben (26 Proben je Gruppe) auf Trockeneis an das Zentral-labor der Kleintierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Justus-Liebig-Universität Gießen verschickt. Dort fand eine Untersuchung der Albumin-, Bilirubin-, Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)-, Gallensäuren-, Alkalische Phosphatase (AP)-, Aspartat-Aminotransferase (AST)-, Laktat-Dehydrogenase (LDH)- und Gamma-Glutamyl-Transferase (γ-GT)- Konzentrationen statt.
4.4 Untersuchung auf anti-NPHV NS3 Antikörper
Die Untersuchung auf anti-NPHV NS3 Antikörper fand im Institut für Experimentelle Virologie, TWINCORE Zentrum für Experimentelle und Klinische Infektionsforschung GmbH in Hannover statt.
4.4.1 Antigenherstellung
Für die Antigenherstellung wurden Cos-1-Zelllinien genutzt, die nach einem Stan-dard-Gewebekulturprotokoll in Gibco®DMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) mit 10 % Gibco® fetalem Kälberserum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) kultiviert wurden. Analog zu BURBELO et al. (2012) erhielten wir ein Plasmid, an welches eine DNA-Teilsequenz des Nicht-Strukturprotein 3 (NS3)-Peptids (Heli-kase) mit dem C-terminalen Ende der Renilla luciferase (Ruc) fusioniert wurde.
Einen Tag vor der geplanten Transfektion wurden neue Zellkulturschalen mit Cos-1-Zellen in einer Konzentration von ca. 2 x 106 Zellen/Platte vorbereitet. Für die Trans-fektion wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) 94
29
μl des Mediums GibcoTMOpti-MEM®I (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) und 6 μl X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Deutschland) pipettiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 1- 2μg des hergestellten Plasmids, in das der Expressionsvektor pRen2, die Renilla luciferase und die DNA-Teilsequenz für das NS3-Antigen eingebaut wurden in das Reaktionsgefäß zugefügt, gut vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten in-kubiert. Eine vorsichtige Übertragung der gesamten Lösung zu den Cos-1-Zellen folgte. Die Zellen wurden anschließend für 48 Stunden bei 37 °C in einem CO2- Inku-bator (5 %) inkubiert.
Zwei Tage nach der Transfektion fand die Gewinnung der RUC- NPHV NS3 Antige-ne, die von den Cos-1-Zellen gebildet wurden, statt. Dafür wurde zunächst die Zell-kulturschale mit 6 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 1,4 ml Lyse-Puffer aufgeschlossen, um so die RUC- NPHV NS3 Antigene zu gewinnen. Die gewonnenen Zelllysate (Antigene) wurden zweimal bei 12.500 Umdrehungen pro Minute für 4 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Nach der ersten Zentrifugation wurden Schmutz und Zellreste von den Wänden vorsichtig entfernt, nach der zweiten wurde der Überstand der zwei Reaktionsröhrchen in ein neues Reaktionsröhrchen auf Eis überführt.
Zuletzt wurde die Lumineszenz des hergestellten Lysats gemessen. Dafür wurde 1 μl des Lysats mit 8 μl PBS in einem neuen Reaktionsröhrchen verdünnt und nach direk-ter Zugabe von 100 μl Coelendirek-terazin-Substrat (p.j.k. GmbH, Kleinblitdirek-tersdorf) mit Hil-fe des Luminometers (LB 90 Centro XS3; Berthold, Freiburg) gemessen.
Nach der Messung von vier Proben ergab sich der Durchschnittswert von 661 000 relativer Licht Einheit (RLU) / μl, sodass für die Durchführung des Luciferase-Immunpräzipitations-Systems (LIPS) mit 107 RLU 15 μl Antigen pro Well benötigt wurden. Das Ruc-Antigen-Lysat wurde aliquotiert und bei - 80 °C für die folgenden Untersuchungen aufbewahrt.
30
4.4.2 Durchführung des Luziferase-Immunpräzipitations-Systems (LIPS)
Für die Herstellung der Serum Master Platte wurden jeweils 50 μl Serumprobe mit 450 μl Puffer A verdünnt, so dass eine Verdünnung von 1:10 entstand. Die Proben wurden jeweils im Doppelansatz in eine 1,2 ml Polypropylen-96-Well-Platte (LVL technologies, Crailsheim, Deutschland) pipettiert. Puffer A galt als Negativkontrolle und das kommerzielle Pferdeserum (AXA 29619®, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) stellte als bereits untersuchtes und als NS3 Antikörper-positiv diag-nostiziertes Pferdeserum die Positivkontrolle dar. Beide Kontrollen wurden mit 450 μl Puffer A im analogen Mischungsverhältnis verdünnt. Nach Verschluss der Serum Master Platte mit Parafilm-Folie (Bemis® Flexible Packaging, Neenah Paper, Alpha-retta, Giorgia) wurde diese bei 4 °C aufbewahrt. Es folgte eine Inkubation bei Raum-temperatur auf dem Schüttler (Unimax 1010®, Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland) für ein bis zwei Stunden. In eine weitere 96-Well-Zellkulturplatte (Fal-con, Durham, USA) wurden zunächst 40 μl Puffer A und 50 μl (= 1 x 107 Lichteinhei-ten) RUC-NPHV NS3 Antigen verdünnt in Puffer A vorgelegt. Danach wurden 10 μl aus der Serum Master Platte dazu pipettiert, sodass eine Antikörper-Antigen-Bindung während einer weiteren einstündigen Inkubation stattfinden konnte. Für das Binden vorhandener Antikörper-Antigen-Komplexe dienten Ultralink Protein A/G Beads®
(Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Dazu wurden fünf Mikroliter einer 30 %-igen Suspension des Ultralink Protein A/G Beads® (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) in PBS und die gesamten 100 μl des Antigen-Antikörper-Gemisches in eine 96-Well-Filter-HTS-Platte (Merck Millipore, Bedford, Massachusetts) pipettiert. Es folgte eine weitere Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde auf dem Schüttler bei 300 Umdrehungen pro Minute (rpm) (Unimax 1010®, Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland). Im Anschluss wurde die Filterplatte mit einer 96-Well-Vakuumpumpe (Welch, Monroe, Louisiana, USA) zunächst 8-mal mit jeweils 100 μl Puffer A sowie 2-mal mit jeweils 100 μl PBS gewaschen und danach mit Zellstofftüchern abgetrocknet.
Die Lumineszenzmessung erfolgte mithilfe eines Plattenluminometers (LB 960 Cen-tro XS3; Berthold, Freiburg, Deutschland) nach automatischer Zugabe von Coelen-terazin-Lösung (p.j.k. GmbH, Kleinbittersdorf, Deutschland), gesteuert durch das
zu-31
gehörige Softwareprogramm Microwin2000 (Mikrotek Laborsysteme GmbH, Overath, Deutschland). Pro Well wurden zunächst 50 μl Coelenterazin-Lösung zugefügt, dann für 2 Sekunden geschüttelt und anschließend innerhalb von 5 Sekunden die Fluores-zenz gemessen.
Im Anschluss wurden die Daten nach Excel (Microsoft Office, Microsoft Corporation, Redmond, Washington) exportiert. Eine graphische Auswertung der Ergebnisse fand unter anderem mit der GraphPadPrism® Software (San Diego, Kalifornien) statt.
4.4.3 Bestimmung von Sensitivität und Spezifität der Messergebnisse
Für die Bestimmung von Sensitivität und Spezifität der Messergebnisse wurde ana-log der Methoden anderer Untersucher ein Grenzwert („cut-off“) berechnet, der den Mittelwert plus die dreifache Standardabweichung des Puffer-A-Ruc-Extrakt-Protein-A/G-Gemischs wiedergibt (BURBELO et al. 2012; PFAENDER et al. 2015). Der cut-off-Wert lag in dieser Versuchsreihe bei 28.812 RLU. Wenn die gemessene RLU ei-ner Probe oberhalb des cut-off-Wertes lag, wurde diese Probe als anti-NPHV NS3 Antikörper-positiv gewertet.
4.5 Untersuchung auf NPHV RNA mittels quantitativer real-time PCR
Eine Bestimmung von Virusantigen wurde mittels quantitativer real-time PCR im Institut für Experimentelle Virologie, TWINCORE Zentrum für experimentelle und kli-nische Infektionsforschung GmbH in Hannover durchgeführt. Dafür wurde die virale RNA aus den Serumproben extrahiert, in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrie-ben und anschließend wurde mittels SYBRGreen-basierter quantitativer real-time PCR der virale RNA-Gehalt in den Proben bestimmt.
32 4.5.1 Extraktion der viralen RNA
Im ersten Schritt wurde die virale RNA mit Hilfe des High-Pure Viral RNA Kit® (Ro-che, Mannheim, Deutschland) extrahiert.
Zur Extraktion wurde wie folgt vorgegangen:
1. Für die Präparation von 30 Serumproben, wurden 120 μl Poly (A)- und 12 ml Binding Buffer in einem 15 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen (Falcon, Durham, USA) vorbereitet.
2. In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) wurden 400μl Binding Buffer mit Poly (A) und 200 μl Serum gegeben und vermischt.
3. Nach Herstelleranweisung wurde ein 1,0 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nüm-brecht, Deutschland) als Sammelgefäß benutzt und in dieses ein High Pure Filter Tube (Filter-Zentrifugensäule) eingesetzt.
4. Die 600 μl Probenlösung wurde vollständig in das obere Reservoir der Filter-Zentrifugensäule pipettiert.
5. Das zusammengesetzte Sammelgefäß wurde in einer Tischzentrifuge (Ep-pendorf Centrifuge 5417C®, Ep(Ep-pendorf, Hamburg, Deutschland) bei 8000 rpm für 15 Sekunden zentrifugiert.
6. Das Sammelröhrchen wurde mit aufgefangener Flüssigkeit verworfen und die Filter-Zentrifugensäule in ein neues Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) eingesetzt.
7. Danach wurden 500 μl Inhibitor-Removal Buffer auf die Filter-Zentrifugen-säulen pipettiert um Kontaminanten (intakte Viren, Nukleasen und andere zel-luläre Komponenten), die die quantitative real-time PCR negativ beeinflussen, möglichst vollständig zu eliminieren.
8. Es folgte eine Zentrifugation für 1 Minute bei 8000 rpm.
9. Das Sammelgefäß mit Flüssigkeit wurde verworfen und die Filter-Zentrifugen-säule in ein neues Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) ein-gesetzt.
10. Die Reinigung von Salzen, Proteinen und anderen Verunreinigungen wurde durch 2-maliges Waschen der Filter-Zentrifugensäule mit je 450 μl Wash
Buf-33
fer erreicht. Zwischen den zwei Waschschritten fand eine Zentrifugation für 1 Minute bei 8000 rpm mit darauffolgendem Verwerfen des Sammelgefäßes und Umsetzten der Filter-Zentrifugensäule in ein neues Reaktionsgefäß statt (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland).
11. Nach dem zweiten Waschen wurden die Probenröhrchen für 1 Minute bei 8000 rpm und zusätzlich im Anschluss für 10 Sekunden bei maximaler Ge-schwindigkeit zentrifugiert, sodass jegliche Waschlösung entfernt wurde.
12. Das Sammelgefäß wurde verworfen und die Filter-Zentrifugensäule in ein neues Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) eingesetzt.
13. Im Anschluss wurden 50 μl Elution Buffer in das Filterröhrchen pipettiert und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert. Bei diesem Schritt lösten sich die Nuk-leinsäuresequenzen von der Filtermembran.
14. In dem Sammelgefäß befand sich die gelöste RNA, die schnell auf Eis ver-bracht wurde und bei - 80 °C aufbewahrt wurde. Die Filter-Zentrifugensäule wurde verworfen.
4.5.2 Herstellen der komplementären DNA (cDNA)
Nach der RNA-Präparation wurde über eine Reverse Transkription die RNA in eine komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben, da diese stabiler ist als eine RNA.
Für die Herstellung der cDNA wurde der PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)® (TaKaRa, Kusatsu, Japan) verwendet. Insgesamt 2 μl des PrimeScript RT Master Mix® wurden zu 8 μl RNA-Probe in ein Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nüm-brecht, Deutschland) pipettiert und gut gemischt. Der PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)® (TaKaRa, Japan) enthielt alle Komponenten, die für die Rever-se Transkription benötigt wurden.
Für die Reverse-Transkription wurden die Proben zunächst für 15 min bei 37 °C auf dem Heizblock (Thermomixer compact®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inku-biert. Eine anschließende Erhitzung der Proben auf 85 °C für 5 Sekunden führte zur
34
Inaktivierung der Reversen Transkriptase. Nach Zugabe von 40 μl reinsten Wassers (Aqua ad iniectabilia®, Braun, Melsungen, Deutschland) wurden die Proben bis zur Messung bei - 20 °C gelagert.
4.5.3 Quantitative real-time PCR
Die quantitative Bestimmung des viralen RNA Gehalts in den Serumproben wurde mit einer SYBR-Green-basierten quantitativen real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Ziel war die Amplifizierung eines Gensegmentes aus der un-translationierten Region am 5’-Ende (5‘UTR). Das verwendete Substrat war das SYBR®GreenI aus dem SYBR®Premix Ex TaqTM II (TliRNaseH Plus) [Bulk®, TaKa-Ra, Kusatsu, Japan]. Für den Reaktionsansatz (Master Mix) wurden das SYBR
®Premix Ex Taq II, die Primer, Quanti-5UF1 und Quanti-5UR1 (MWG-Biotech AG, High Point, North Carolina, USA) und Wasser verwendet (Tabelle 1).
Tabelle 1: Master Mix für die quantitative real-time PCR
1 Probe 96 Proben
H2O 4,88μl 460,8μl
Quanti-5UF1 0,06μl 5,76μl
Quanti-5UR1 0,06μl 5,76μl
SYBR ® Premix Ex Taq II 10,00μl 960μl
insgesamt 15μl 1432,23μl
+ je 5μl Probe
Auf jeder Platte wurde eine Verdünnungsreihe (von 107 bis 101 Kopien/ml) mit dem Standardplasmid pFK_i389-NPHV5’UTRLucNS3-3’_JFH-dg angelegt. Diese diente der Erstellung der Standardkurve und der anschließenden Ergebnisauswertung. In die übrigen Vertiefungen wurden die cDNA Proben sowie in jeweils zwei Vertiefun-gen H2O als Negativkontrolle und in zwei Vertiefungen NPHV RNA-positiv getestete cDNA als Positivkontrolle pipettiert.
35
Die Messung wurde mit dem LightCycler® 480 (Roche, Mannheim, Deutschland) und der dazugehörigen Software durchgeführt. Die gemessenen Konzentrationen wurden in Kopien/ml hochgerechnet. Eine graphische Auswertung der Ergebnisse fand mit der GraphPadPrism® Software (San Diego, Kalifornien) statt.
Für die Denaturierung wurde die Probe auf 95 °C erhitzt, sodass die doppelsträngige cDNA in ihre zwei Einzelstränge getrennt wurde (Tabelle 2). Die Bindung der Primer an diese fand bei 54 °C statt (= Annealing). Im dritten Schritt, der Elongation wurden bei 72 °C durch die DNA-Polymerasen die freien DNA-Abschnitte passend zum je-weiligen Strang synthetisiert. An die neu entstehenden Doppelstränge lagerte sich das fluoreszierende SYBR®GreenI an. Damit korrelierte die Messung der Fluores-zenz positiv mit der Menge neu gebildeter DNA-Stränge.
Tabelle 2: Ablauf der quantitativen real-time PCR
1. Schritt Initiale Denaturierung (1 Zyklus)
95°C 10 Minuten
2. Schritt Amplifizierung (40 Zyklen)
Denaturierung 95°C 15 Sekunden
Annealing 54°C 1 Minute
Elongation 72°C 15 Sekunden
3. Schritt Schmelzkurve (1 Zyklus)
95°C 15 Sekunden
4. Schritt Abkühlen (1 Zyklus)
40°C 30Sekunden
Für die Auswertung wurde eine Probe als NPHV RNA-positiv bewertet, sobald der gemessene ct-Wert (cycle threshold) unter dem ct-Wert der geringsten Standardkon-zentration (< 35) lag. Proben mit einem ct-Wert zwischen 35 und 40 wurden als ne-gativ gewertet. Der ct-Wert ist der Schwellenwert, der den Zyklus der quantitativen
36
real-time PCR angibt, bei dem die Fluoreszenz zum ersten Mal exponentiell über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt.
4.6 Statistische Auswertung
Für die statistische Auswertung wurden die Laborergebnisse um pferdespezifische Daten wie Alter, Geschlecht, Standort der untersuchten Pferde sowie Informationen zur Zucht- und Transporthistorie, die aus der Datenbank des Direktoriums für Voll-blutzucht und Rennen e.V. entnommen wurden, ergänzt. Über Daten zur Zuchthisto-rie wurden Informationen zum Reproduktionsstatus und Zuchteinsatz gewonnen.
Stuten, die in den Jahren vor der Untersuchung bereits belegt wurden, erhielten den Reproduktionsstatus „Zuchtstute“ und Stuten, die im Untersuchungsjahr zum ersten Mal belegt wurden den Status einer „Maidenstute“. Alle untersuchten Hengste waren im Deckeinsatz tätig. Über das Merkmal Zuchteinsatz im Untersuchungsjahr wurde zwischen Vollblütern, die im Deckeinsatz waren (Deckhengste eingeschlossen) und Vollblütern ohne Zuchteinsatz im Untersuchungsjahr differenziert. Daten zur Trans-porthistorie lieferten Informationen darüber, welche Pferde im Untersuchungsjahr ins Ausland transportiert wurden und wann ein Transport ins Ausland stattgefunden hat-te. Die Bestandsgröße gab die Anzahl an Pferden wider, mit denen ein untersuchtes Tier in Kontakt stand und wurde telefonisch bei den Besitzern/ Gestüten/ Auf-zuchtställen erfragt. Eine Einteilung der Bestandsgröße erfolgte indem Gruppen mit in etwa gleicher Anzahl an Betrieben pro Gruppe gebildet wurden. Damit gab es 36 Bestände mit 1 bis 9 Pferden, 34 Bestände mit 10 bis 39 Pferden und 19 Bestände mit über 40 Pferden.
Mit Hilfe der Statistiksoftware SAS®, Version 9.3 (SAS Institute, Cary, North Caroli-na) fand die statistische Auswertung statt. Zunächst wurden eine Plausibilitätsprü-fung und eine deskriptive Statistik durchgeführt und die Datenverteilungen auf die Gruppen [AK - / RNA -], [AK + / RNA -], [AK + / RNA +] und [AK - / RNA +] untersucht (SAS-Prozedur PROC TABULATE). Dabei wurden quantitative Variablen anhand von Lage-Kenngrößen (arithmetisches Mittel, Maximal- und Minimalwert, 5 %- und 95 %-
37
Quantil) sowie Streuungskenngrößen (Standardabweichung, Variationskoeffizient in
%) beschrieben. Für qualitative Variablen wurden die absoluten und die relativen Häufigkeiten ihrer Ausprägung bestimmt. Das Alter wurde für die graphische Darstel-lung der deskriptiven Ergebnisse zusätzlich kategorisiert. Dabei wurden eine Auftei-lung mit in etwa gleich großer Pferdeanzahl pro Gruppe vorgenommen: Die 3- bis 6-jährigen Pferde mit 171 Probanden, die 7- bis 10-6-jährigen Pferde mit 206 Probanden, die 11- bis 15-jährigen Pferde mit 233 Probanden und die 16- bis 24-jährigen Pferde mit insgesamt 123 Probanden.
Für die induktive Auswertung wurden Daten aus der Gruppe [AK - / RNA -] (252 Pferde) mit Daten von Pferden mit positivem Virusnachweis [AK ± / RNA +] (134 Pferde) verwendet und analysiert. Im ersten Schritt der induktiven Statistik wurden die Assoziationen zwischen zwei qualitativen Variablen über den Likelihood Ratio difference test (p-Wert) bestimmt. Für die Untersuchung von einem qualitativen Merkmal und einem quantitativen Merkmal wurde das Coefficient of determination (R2)ermittelt. Mit der anschließenden einfaktoriellen logistischen Regression wurden analysiert ob einzelne feste Effekte: Alter, Reproduktionsstatus, Zuchteinsatz im Un-tersuchungsjahr, Bestandsgröße und Auslandsaufenthalt im Untersuchungsjahr mit dem Vorkommen viraler NPHV RNA assoziiert sind (SAS-Prozedur PROC LOGIS-TIC). Im Anschluss wurde die mehrfaktorielle logistische Regression mit der SAS-Prozedur PROC GLIMMIX durchgeführt. Im ersten Schritt fand eine Analyse von al-len oben genannten Variabal-len statt. Anschließend wurden Faktoren mit einem p-Wert > 0,05 Schritt-für-Schritt aus dem Modell selektiert. Eine Untersuchung aller Wechselwirkungen zwischen den Faktoren folgte. Die darauffolgende manuelle Rückwärtsselektion der Wechselwirkungen wurde zu einem Signifikanzniveau von <
0,1 vorgenommen. Mit Hilfe dieser Einzelschritte konnte das Endmodell aufgestellt werden.
38
5 Ergebnisse
5.1 Klinische Allgemeinuntersuchung
Eine klinische Allgemeinuntersuchung, die im Rahmen der Untersuchung des Fruchtbarkeitsstatus stattfand, zeigte, dass alle 733 Vollblüter klinisch allgemein ge-sund waren.
5.2 Hämatologische Untersuchung
Bei 689 der 733 Pferde konnten hämatologische Untersuchungen durchgeführt wer-den. Die errechneten Mittelwerte der einzelnen Untersuchungsparameter befanden sich innerhalb der Referenzbereiche (Tabelle 3). In Einzelfällen wurden gering-gradige Abweichungen von den Referenzwerten festgestellt, die aber nicht mit dem Vorkommen einer NPHV-Infektion korrelierten.
Tabelle 3: Ergebnisse der Hämatologischen Untersuchung.
MW: Mittelwert; STD: Standardabweichung; MIN: Minimum; MAX: Maximum; Ref: Referenzbe-reich
MW STD MIN
5%-Quantil
95%-Quantil MAX Ref.
WBC(G/l) 8,74 1,74 3,7 6,3 12,0 15,0 5-10
RBC (T/l) 8,92 1,07 6,48 7,3 10,8 12,76 5-10 HGB (g/dl) 14,72 1,58 10,6 12,4 17,5 19,9 11-17 HCT (%) 44,35 5,46 30,9 36,4 54,3 61,6 30-45
PLT (μl) 109 39,47 7 43 171 393 90-300
GE (g/l) 68,35 4,53 50,0 60,0 76,0 84,0 55-75
39 5.3 Blutchemische Untersuchung
Signifikante Unterschiede zwischen den gemessenen Parametern und den Gruppen wurden nicht festgestellt. Jedoch lagen die GLDH-Mittelwerte aus den Gruppen [AK+
/ RNA +] und [AK - / RNA +] im Gegensatz zu dem GLDH-Mittelwert der Gruppe [AK- / RNA -] oberhalb vom Referenzwert (Tabelle 4). Zusätzlich war auffallend, dass die γ-GT- Mittelwerte aller Gruppen erhöht waren.
Tabelle 4: Ergebnisse der Blutchemischen Untersuchung.
MW: Mittelwert; STD: Standardabweichung; MIN: Minimum; MAX: Maximum
Parameter Gruppe MW STD MIN MAX
40
AK - / RNA + 159,77 54,54 73 284
AST
Referenzwert:
< 250 U / l
AK - / RNA - 321,62 133,42 182 792
AK + / RNA + 311,96 124,22 136 658
AK - / RNA + 290,58 64,58 155 433
LDH
Referenzwert:
< 450 U / l
AK - / RNA - 450,31 82,27 299 609
AK + / RNA + 384,77 130,92 119 621
AK - / RNA + 393,69 110,10 175 663
Albumin
Referenzwert:
27,4 - 35,7 g / l
AK - / RNA - 32,68 2,54 26,7 36,5
AK + / RNA + 29,9 6,41 14,9 36,7
AK - / RNA + 29,83 4,74 17,2 37,8
Insgesamt wurden die meisten Abweichungen von den Referenzwerten in Proben aus der Gruppe [AK + / RNA +] gefunden (Abbildung 3). Dabei wurden häufig erhöh-te γ-GT-Konzentrationen, oder eine Kombination aus erhöhten γ-GT- und GLDH-Konzentrationen festgestellt. Demgegenüber lagen auch erhöhte Untersuchungspa-rameter bei Proben aus der Gruppe [AK - / RNA -] vor.
41
ohneVe rä nde runge n
*
GGT z w isc he n
2 0 -3 0
U/l
GLDH+ GGTe rhöht**
GGTundGa llens äure e rhöht
Sons tige s 0
5 1 0 1 5
A K / R N A -A K + / R N -A + A K - / R N A +
AnzahlanProben
B lu t c h e m is c h e U n t e r s u c h u n g
Abbildung 3: Graphische Darstellung der Ergebnisse der blutchemischen Untersuchung.
Je Gruppe wurden 26 Proben untersucht. * Bei diesen Proben lagen die untersuchten Werte innerhalb der Referenzbereiche. ** GLDH > 8 U / l und γ-GT > 30 U / l zum Teil mit erhöhter Gal-lensäurekonzentration und/oder Leukozytengesamtzahl. Sonstiges = nur γ-GT-Konzentration >
30 U / l oder nur Gallensäurekonzentration > 12 μmol / l.
42 5.4 Seroprävalenz von NPHV-Infektionen
Bei 453 Pferden (61,8 %) wurden anti-NPHV NS3 Antikörper und bei 134 Pferden [18,28 %] virale NPHV RNA nachgewiesen (Abbildung 4).
Puffer
Serumproben 1 03
1 04 1 05 1 06 1 07
NPHV-NS3 Antikörper [RLU]
Abbildung 4: Graphische Darstellung der Untersuchungsergebnisse des LIPS und der quantita-tiven real-time PCR mit der GraphPadPrism® Software (San Diego, Kalifornien).
Mittelwert (—) der Puffer; cut-off-Wert ( ): 28.812 RLU. Punkte oberhalb des cut-off-Wertes:
anti-NPHV NS3 Antikörper-positive Proben. Rote Punkte: Proben, bei denen mittels quantitati-ver real-time PCR virale NPHV RNA nachgewiesen wurde. RLU: relative light units.
43
Eine Aufteilung in die vier möglichen Ausprägungsgruppen zeigte, dass bei 347 Pferden [47,34 %] nur anti-NPHV NS3 Antikörper [AK + / RNA -], bei 106 Pferden [14,46 %] anti-NPHV NS3 Antikörper und virale NPHV RNA [AK + / RNA +], bei 28 Pferden [3,82 %] nur virale NPHV RNA [AK - / RNA +] und bei 252 Pferden [34,38 %]
weder anti-NPHV NS3 Antikörper noch virale NPHV RNA [ AK - / RNA -] gefunden wurden (Abbildung 5).
A K - / R N A - (n = 2 5 2 ) A K + / R N A - (n = 3 4 7 ) A K + / R N A + (n = 1 0 6 ) A K - / R N A + (n = 2 8 ) S e r o p r ä v a le n z v o n N P H V - In f e k t io n e n
3 4 %
4 7 % 1 4 %
4 %
Abbildung 5: Prozentuale Verteilung von anti-NPHV NS3 Antikörpern und viraler NPHV RNA in der Untersuchungskohorte, bestehend aus insgesamt 733 Vollblütern (n = Anzahl an Pferden
Abbildung 5: Prozentuale Verteilung von anti-NPHV NS3 Antikörpern und viraler NPHV RNA in der Untersuchungskohorte, bestehend aus insgesamt 733 Vollblütern (n = Anzahl an Pferden