Vorlesung Analytische Chemie

(1)

Herbstsemester 2010 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch 1

Vorlesung

Analytische Chemie

(für Biol./Pharm.Wiss.)

ZUSAMMENFASSUNG Chromatographie

Grundlagen: Techniken:

• Grundlegende Formeln • LC

• Trenneffizienz, Peakbreite & theoretische Böden • GC

• Asymmetrische Peaks (Überladungseffekte) • Elektrophorese

• Auflösung & Optimierung einer Trennung • Probenvorbereitung

• Quantifizierung & Kalibrierung (Probenaufarbeitung)

(2)

Chromatographie

Definition:

Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem

die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer

stationären Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar,

und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der

verschiedenen Substanzen. Die Technik ist so konzipiert, dass sich das

Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge mehrmals

während des Trennprozesses einstellen kann.

(3)

Herbstsemester 2010 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

„Chromatographie-Check“

3

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• 

Trenntechnik

•  Zwei nicht mischbare Phasen

•  Eine mobile und eine stationäre Phase

•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

(4)

Grundlegende Formeln

zur Chromatographie

(5)

Verteilungsgesetz und Phasenverhältnis

5

•  Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) K

_C

:

Gleichgewichtsverteilung von Analytmolekülen in der mobilen (A_M) und stationären (A_S) Phase.

Nernstsches Verteilungsgesetz

Bei gegebener stationärer und mobiler Phase ist K_C für einen Analyten bei konstanter Temperatur eine Konstante.

A_M A_S

K

_C

= c

_S

c

_M

= Analytkonzentration in der stationären Phase Analytkonzentration in der mobilen Phase

•  Phasenverhältnis β:

! = V

_M

V

_S

= Volumen der mobilen Phase

Volumen der stationären Phase

(6)

Das Chromatogramm

•  Durchflusszeit (Totzeit) t

_M

:

Retentionszeit einer Inertsubstanz

•  Lineargeschwindigkeit u:

u = L

t

_M

= Säulenlänge Durchflusszeit

•  Retentionszeit t

_R

•  Reduzierte Retentionszeit t’

_R

:

!

t

_R

= t

_R

" t

_M

•  Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

k = t_R !t_M

t_M = t _R"

t_M =K_C V_S

V_M = K_C

#

•  Trennfaktor (“Selektivität”) α :

per Definition: α ≥ 1

!= t_R₂ " t_M

t_R1" t_M = t _R# ₂

#

t _R1 = k₂

k₁ = K_C₂ K_C1

(7)

Peakbreite (idealer Gauss-Peak)

7

Peakbreite zwischen den Wendepunkten w

_i

:

Breite bei e^-1/2 = 0.607 bzw. 60.7%

der Peakhöhe.

w

_i

= 2 !

Basisbreite w

_b

:

Breite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der

x-Achse (Zeitachse).

w

_b

= 4 !

Peakbreite in halber Höhe w

_1/2

:

Breite bei 50% der Peakhöhe.

w

_{1/ 2}

= 2 ! 2 ln2 " 2.354 !

σ ... Standardabweichung der Gauss-Funktion

(8)

Trenneffizienz, Peakbreite &

theoretische Böden

(9)

Theoretische Böden & Trenneffizienz

9

Je mehr theoretische Böden, umso höher die Effizienz der Trennung

N = t_R

!

"

# $ %

&

'

2

=16 ( t_R

w_b

"

# $ %

&

'

2

= 5.54 ( t_R

w_{1/ 2}

"

# $ %

&

'

2

H = L N

•  Anzahl der theoretischen Böden N:

•  Bodenhöhe H:

Je grösser N bzw. je kleiner H, umso effizienter die Trennung

(10)

Trenneffizienz & van-Deemter-Gleichng

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinal-Diffusion C: Massentransport-Effekte

H = A + B

u + C u

Je kleiner H, umso mehr theoretische Böden und umso effizienter die Tren- nung ( schmalere Peaks) Je höher A, B und C, umso ineffizienter die Trennung

(11)

Asymmetrische Peaks

(Überladungseffekte)

(12)

Asymmetrie verstehen: Wie sind die Moleküle in der Säule verteilt?

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

Idealer Gauss- Peak

Tailing Fronting

Asymmetriefaktor oder

(13)

Abweichungen von der idealen Peakform

13

Unsymmetrische Peaks sind meist auf Überladungseffekte bei hohen Analytkonzentrationen zurückzuführen.

Überladung der mobilen Phase:

Der Analyt kondensiert auf der stationären Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer

unsymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Moleküle später als im Idealfall die Säule verlässt.

Überladung der stationären Phase:

Die Bindungsstellen auf der stationären Phase sind mit Analyt belegt.

Analytmoleküle aus der mobilen Phase können nicht mehr binden und werden

schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytmoleküle verlässt die Säule also früher als bei idealer Retention.

(14)

Auflösung &

Optimierung einer Trennung

(15)

Auflösung

15

R

_S

= ! " 1

!

#

$ % &

' ( k

₂

1 + k

₂

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

! = f k,K (

_C

)

k = f ( ) ,K

_C

)

N = f L, ( H )

 Gauss.xls R_S = t_R₂ ! t_R1

w_b1+ w_b2 2

"

# $ %

&

'

= 2

(

t_R₂ ! t_R1

)

w_b1+ w_b₂ = Differenz der Retentionszeiten Mittelwert der Basisbreiten

Auflösung R

_S

zweier benachbarter Peaks:

Koelution:

R_S < 0.75

2 Peaks erkennbar:

R_S > 0.75

Basisliniengetrennte Peaks:

R_S > 1.5

(16)

Optimierung

R

_S

= !" 1

!

#

$ % &

' ( k

₂

1 + k

₂

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

α : Trennfaktor

k: Retentionsfaktor

N: Anzahl theoretischer Böden

k ! t

_R

N ! 1

"

²

! = t

_R

"

₂

"

t

_R1

Ziel der Optimierung ist,

eine effektive Peakauflösung (R

_S

> 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit

zu erreichen.

Je höher α , k und N,

umso besser die Auflösung R

_S

(17)

Quantifizierung &

Kalibrierung

(18)

Mittelwert :

Ein kleiner Ausflug in die Statistik

Genauigkeit = Präzision + Richtigkeit

Häufigkeit eines Messwertes

x

Messwerte x_i

x

x = 1 n x_i

i=1

!

n ^!^x ⁼ _n¹_"₁ ⁽^xⁱ^"^x⁾²

i=1

#n

Standard-

abweichung σ: rel. Standard- abweichung:

!_rel,_x = !_x x

(19)

Kalibrierung

19

A_Analyt = a+ b c_Analyt

b = A_Analyt !a c_Analyt Empfindlichkeit b

(Steigung der Kalibriergeraden):

NG =

(

A₀+3!_A₀

)

^" ^a

b

Nachweisgrenze NG:

(limit of detection = LOD):

BG =

(

A₀ +6!_A₀

)

^" ^a

b

Bestimmungsgrenze BG:

(limit of quantification = LOQ):

(20)

Kalibriermethoden

•  Kalibrierung mit externem Standard:

•  einfachstes Kalibrierverfahren

•  Kalibrierung mit internem Standard:

•  Kompensation systematischer Fehler

•  Interner Standard kann z.B. vor der Probenaufarbeitung oder bei der Probenahme zugegeben werden

•  Einschränkung: Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt

•  Matrixeffekte werden nicht kompensiert

•  Kalibrierung mittels Standardaddition

•  Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als Standard

•  Matrixeffekte können kompensiert werden

(21)

Zusammenfassung LC

(22)

LC: Analyten

GC: Analyten müssen unzerstört verdampfbar sein.

LC: Auch geeignet für grosse und thermolabile Moleküle

•  kleine ungeladene (polare und unpolare) Moleküle

•  anorganische und organische Ionen

•  Polymere

•  Grosse (Bio-)Moleküle

Einschränkung: Analyt muss ausreichend in mobiler Phase löslich sein.

(23)

LC: Techniken

23

Trennmethode Trennung nach...

Normalphasen-HPLC Polarität

(t_R: polare > apolare Analyten)

Umkehrphasen-HPLC Polarität

(t_R: apolare > polare Analyten)

Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse

Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen Affinitätschromatographie spezifische biochemische

Bindungsaffinität

(z.B. Antikörper–Antigen)

Chirale Chromatographie Chiralität

(R- und S-Form)

Einschränkung: Analyt muss ausreichend in mobiler Phase löslich sein.

(24)

LC: Techniken

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

NP-LC

RP-LC Ionen- chroma- tographie (IC)

Molekulargewicht

(25)

LC: Detektoren

25

Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten

UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber

RID – – + universeller Detektor

ELSD o ++ universeller Detektor

Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore

Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare Analyten

MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur

Strukturaufklärung

Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie

(26)

LC: Detektoren

Zusätzlich: Leitfähigkeitsdetektor (mit Suppressor) in der Ionenchromatographie

Weitere Kriterien:

•  Kompatibel mit der Gradientenelution?

•  Preis, einfache oder komplizierte Bedienung, Aufwand für Justage, Wartung etc.

Derivatisierung:

Ermöglicht den Einsatz von Detektoren, die für die vorliegenden Analyten an sich nicht geeignet oder zu unempfindlich sind.

z.B. chemische Umsetzung mit starken UV-Absorbern oder Fluorophoren

(27)

LC: Trenneffizienz

27

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinal-Diffusion C: Massentransport-Effekte

H = A + B

u + C u

HPLC:

Verbesserung der Effizienz durch Einsatz kleiner

Partikel (µm-Bereich).

Dadurch hohe Drücke erforderlich (300-400 bar)

 vanDeemter.xls

(28)

LC: Auflösung

R_S > 1.5

Grundlinien- getrennte

Peaks

R

_S

= ! " 1

!

#

$ % &

' ( k

₂

1 + k

₂

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

! = f k,K (

_C

)

k = f ( ) ,K

_C

)

N = f L, ( H )

HPLC:

Verbesserung der Auflösung durch Verwendung kleiner Partikel (µm-Bereich)

 Verbesserung der Trenneffizienz (H) und Erniedrigung des Phasenverhältnisses β = V_M/V_S

 Gauss.xls

(29)

LC: Optimierung der Trennung

29

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflösung (R_S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

Mobile Phase: anderes Lösungsmittel(-gemisch), Gradientenelution

Stationäre Phase: Wechsel der Säule (z.B. Änderung der Polarität)

Lineargeschwindigkeit, Temperatur, Säulenlänge (selten, da Analysenzeit L)

Gradiententrennung:

Änderung des Eluenten während der Trennung (z.B. Acetonitril- Wasser-Gemisch in verschiedenen Konzentrationen)

Oft Erhöhung der Elutionskraft im Lauf der Trennung

 Kürzere Analysenzeiten, schmalere Peaks bei hoher Retention

t

Isokratische Trennung:

Lösungsmittelzusammensetzung konstant während der Trennung

!

(30)

Zusammenfassung GC

(31)

GC: Analyten

31

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (ca. 10–20% der bekannten org. Moleküle)

•  v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle

•  Derivatisierung: Überführung der Analyten in flüchtige Derivate

Die Betriebstemperatur des Gaschromatographen muss aber nicht über dem Siedepunkt der Analyten liegen.

Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:

z.B. kleine ungeladene Moleküle anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe

Polymere

grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)

(32)

GC: Vorteile & Probleme

Vorteile der GC gegenüber der LC:

•  Kapillarsäulen haben sehr hohe Bodenzahlen (bis ca. 200 000)

•  schmale Peaks

•  hohe Peakkapazität (viele basisliniengetrennte Peaks in einem Chromatogramm)

•  Untersuchung komplexer Proben

•  GC-Detektoren sind sehr empfindlich

•  Quantifizierung im Bereich sehr kleiner Konzentrationen möglich

•  Spurenanalytik

Typisches Problem:

•  Kapillarsäulen werden leicht überladen

•  Überladungseffekte, asymmetrische Peaks

•  Abhilfe: Verdünnung der Proben oder Split-Injektion

(33)

GC: Mobile Phasen

33

•  Häufigste Trägergase:

N₂, He, H₂

•  Mobile Phase dient nur zum

Transport der Analyten durch die Säule

•  Das Trägergas beeinflusst die

Trenneffizienz bzw. die Bodenhöhe

•  Viskosität:

H₂ < He < N₂

•  Diffusionskoeffizienten der Analyten in der mobilen Phase:

N₂ < He < H₂

•  Beste Trenneffizienz um ca. u = 1 mL/min mit H₂ und He. N₂ ist kostengünstiger.

H = A + B

u + C u

B ! D

_M ^CM ! 1 D_M

breites Optimum

bei Trägergasflüssen um 1 mL/min

(34)

GC: Stationäre Phasen (Kapillarsäulen)

Apolare Phasen: Trennung apolarer Analyten gemäss ihrem Siedepunkt

Standardphasen ^O ^Si

CH3

CH₃ 100%

O Si Si

CH₃

CH₃ O

5%

95%

O Si Si

CH3

CH₃ O CN

14%

86%

O

100%

Poly(dimethylsiloxan)

Poly(5%-diphenyl-95%-dimethylsiloxan)

Poly(14%-cyanopropylphenyl- 86%-dimethylsiloxan)

Polyethylenglykol

X-1

X-5

X-1701

X-Wax

apolar

polar

Zunahme der Polarität

Struktur Name Kürzel Polarität

(35)

GC: Optimierung

35

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflösung (R_S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

R

_S

= ! " 1

!

#

$ % &

' ( k

₂

1 + k

₂

#

$ % &

' ( N 4

#

$ % &

' (

! = f k, ( K

_C

)

k = f ( ) ,K

_C

)

N = f L, ( H )

•  Polarität der stationären Phase  k, α

•  Säulenlänge L  N (und Analysenzeit)

•  Säuleninnendurchmesser  β  k

•  Filmdicke  β  k

•  Säulentemperatur T  K_C  k

Gradientenelution (Temperaturprogramm):

Erhöhung der Temperatur entspricht Erhöhung der Elutionskraft

Je höher α, k und N, umso besser die Auflösung R_S

Aber: Je höher k und L, umso länger die Analysendauer

(36)

GC: Detektoren

Detektor Selektivität Nachweisgrenze Linearität

Flammenionisations- C-haltige Moleküle 1 pg C/s > 10⁶ detektor (FID) fast universell

Wärmeleitfähigkeits- universell 400 pg/mL 10⁴

detektor (WLD bzw. TCD)

Elektroneneinfang- selektiv (z.B. stark verbindungsabhängig 10⁶ detektor (ECD) –Cl, –Br, –NO₂)

Flammenphotometrischer selektiv 20 pg S/s 10³ (S)

Detektor (FPD) (S, P, Sn) 1 pg P/s 10⁴ (P / Sn)

Atomemissionsdetektor (AED) universell / stark elementabhängig 10²–10⁵

elementselektiv

Massenselektiver universell / verbindungsabhängig

Detektor (MSD) massenselektiv 10 pg–10 ng 10⁵

 Spektren, TIC, SIM

(37)

Zusammenfassung

Elektrophorese

(38)

Elektrophorese

•  Gel-Elektrophorese

•  Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), Agarose-Gelelektrophorese

•  Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente)

•  Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)

•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

•  Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex)

•  Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts

•  Kapillarelektrophorese (CE)

•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

•  Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen)

•  Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)

•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

•  Trennung ungeladener, kleiner Moleküle

•  Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)

(39)

Zusammenfassung

Probenvorbereitung

(Probenaufarbeitung)

(40)

Probenvorbereitung

•  Analyten in Lösung bringen

•  Abtrennen fester Störsubstanzen

•  Abtrennen gelöster Störsubstanzen

•  Anreichern der Analyten

•  Aufkonzentrieren oder Verdünnen der Probe

•  Überführen der Analyten in ein geeignetes Lösungsmittel

Vorlesung Analytische Chemie

Vorlesung

Analytische Chemie

(für Biol./Pharm.Wiss.)

ZUSAMMENFASSUNG Chromatographie

Chromatographie

Definition:

Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem

die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer

stationären Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar,

und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der

verschiedenen Substanzen. Die Technik ist so konzipiert, dass sich das

Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge mehrmals

während des Trennprozesses einstellen kann.

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

•

Grundlegende Formeln

zur Chromatographie

Verteilungsgesetz und Phasenverhältnis

• Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) K

:

K

= c

c

= Analytkonzentration in der stationären Phase Analytkonzentration in der mobilen Phase

• Phasenverhältnis β:

! = V

V

= Volumen der mobilen Phase

Volumen der stationären Phase

Das Chromatogramm

• Durchflusszeit (Totzeit) t

:

• Lineargeschwindigkeit u:

u = L

t

= Säulenlänge Durchflusszeit

• Retentionszeit t

• Reduzierte Retentionszeit t’

:

!

t

= t

" t

• Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

• Trennfaktor (“Selektivität”) α :

Peakbreite (idealer Gauss-Peak)

Peakbreite zwischen den Wendepunkten w

:

w

= 2 !

Basisbreite w

:

w

= 4 !

Peakbreite in halber Höhe w

:

w

= 2 ! 2 ln2 " 2.354 !

Trenneffizienz, Peakbreite &

theoretische Böden

Theoretische Böden & Trenneffizienz

Je mehr theoretische Böden, umso höher die Effizienz der Trennung

Trenneffizienz & van-Deemter-Gleichng

H = A + B

u + C u

Asymmetrische Peaks

(Überladungseffekte)

Abweichungen von der idealen Peakform

Abweichungen von der idealen Peakform

Auflösung &

Optimierung einer Trennung

Auflösung

R

= ! " 1

!

#

$ % &

' ( k

• 

•  Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) K

•  Phasenverhältnis β:

•  Durchflusszeit (Totzeit) t

•  Lineargeschwindigkeit u:

•  Retentionszeit t

•  Reduzierte Retentionszeit t’

•  Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

•  Trennfaktor (“Selektivität”) α :

•  Kalibrierung mit externem Standard:

•  einfachstes Kalibrierverfahren

•  Kalibrierung mit internem Standard:

•  Kompensation systematischer Fehler

•  Interner Standard kann z.B. vor der Probenaufarbeitung oder bei der Probenahme zugegeben werden

•  Einschränkung: Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt

•  Matrixeffekte werden nicht kompensiert

•  Kalibrierung mittels Standardaddition

•  Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als Standard

•  Matrixeffekte können kompensiert werden