Braunschweig und den
Leibnizforschungslaboratorien für
Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO) der Medizinischen Hochschule Hannover
Experimentelle Untersuchungen zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea
Inaugural-Dissertation Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Bettina Giere
aus Peine
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl.- Prof. Dr. med. vet. H. Niemann,
Institut für Tierzucht (Mariensee) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Junior-Professorin Heike Mertsching,
Leibnizforschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO) der Medizinischen Hochschule Hannover
1. Gutachter: Apl.- Prof. Dr. med. vet. H. Niemann 2. Gutacher: Prof. Dr. Hassan Y. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.05
Inhaltsverzeichnis
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1 EINLEITUNG ...7
2 LITERATURÜBERSICHT ...9
2.1 ANATOMIE,HISTOLOGIE UND FUNKTION DER LUFTRÖHRE... 9
2.2 LUFTRÖHRENRESEKTIONEN UND IHRE DURCHFÜHRBARKEIT... 10
2.2.1 Erkrankungen der Luftröhre und ihrer Umgebung ... 10
2.2.2 Reparatur und Heilung der Luftwege... 11
2.2.3 Entwicklung der Tracheachirurgie ... 11
2.2.4 Anforderung an eine Luftröhrenprothese... 12
2.2.5 Luftröhrenprothesen im klinischen und experimentellen Einsatz... 13
2.3 TISSUE ENGINEERING... 14
2.3.1 Säule 1: Zellen ... 16
2.3.2 Säule 2: Matrices ... 17
2.3.3 Säule 3: Kultivierungstechniken ... 19
2.4 HISTOLOGIE UND BIOCHEMIE DES HYALINEN KNORPELS... 19
2.4.1 Extrazelluläre Matrix... 21
2.4.2 Proteoglykane ... 22
2.4.3 Glykoproteine ... 23
2.4.4 Kollagene ... 23
2.5 PROBLEME DER KNORPELZELLKULTIVIERUNG... 25
2.6 ZIEL DIESER ARBEIT... 28
3 MATERIAL...30
3.1 TIERE... 30
3.2 CHEMIKALIEN... 30
3.3 ZELLKULUTURMEDIEN,ZUSÄTZE UND LÖSUNGEN... 33
3.4 KNORPELZELLKULTURMEDIUM... 33
3.5 ANTIKÖRPER UND SEREN... 34
3.6 PRIMER... 35
3.7 VERBRAUCHSMATERIAL... 35
3.8 LABORGERÄTE... 37
4 METHODIK ...39
4.1 SÄULE 1:ZELLEN... 39
4.1.1 Isolation primärer Knorpelzellen ... 39
4.1.2 Zellzahlbestimmung ... 40
4.2 SÄULE 2:MATRICES... 41
4.2.1 Herstellung der Small Intestinal Submucosa (SIS)... 41
4.2.2 Herstellung der flüssigen Matrix ... 42
4.3 SÄULE 3:KULTIVIERUNGSTECHNIKEN... 43
4.3.1 Kultivierung der Knorpelzellen... 43
4.4 EXPERIMENTELLES DESIGN... 44
4.4.1 Experiment 1: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren... 45
2-D Kultivierung von Knorpelzellen ... 45
3-D Kultivierung von Knorpelzellen ... 46
4.4.2 Experiment 2: Einfaches 3-D Kulturverfahren ... 46
Sandwich-Besiedlungstechnik ... 46
Injektions-Besiedlungstechnik... 47
4.4.3 Experiment 3: Komplexes 3-D Kulturverfahren ... 48
Aufbau Bioreaktor ... 48
Einspannen und Rebesiedlung der SIS im Bioreaktor ... 48
Anschluss der Perfusionsflasche ... 49
4.5 NACHWEISMETHODEN... 50
4.5.1 LIVE/DEAD Viability Assay Kit ... 50
4.5.2 Cell Proliferation Assay (MTT-Test) ... 50
4.5.3 Sauerstoffmessung ... 51
4.5.4 DMMB Assay (GAG-Assay) ... 53
4.5.5 Histologie ... 54
Silanisierung der Objektträger... 55
Paraffineinbettung... 55
Hämalaun-Eosin (HE) Färbung... 56
Azan-Färbung ... 56
Pentachrom... 58
4.5.6 SDS-Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Westernblot 60 Extraktion des Knorpelgewebes... 60
Proteinbestimmung nach Bradford... 61
Protein-Fällung... 62
SDS-Page ... 62
Westernblot... 63
Antiköpervermittelte Chemiluminescenz ... 65
4.5.7 PCR... 66
Gewinnung der Zellen ... 66
Isolierung von RNA und DNA... 66
Messung der RNA-Konzentration ... 66
Messung der DNA-Konzentration ... 67
RT-PCR (Reverse Transkription-PCR) ... 68
PCR ... 68
Analyse der PCR-Amplifikate durch Gelelektrophorese... 70
4.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG... 71
5 ERGEBNISSE...72
5.1 VORVERSUCHE... 72
5.1.1 Knorpelzellisolation ... 72
5.1.2 Knorpelzellquellen im Vergleich ... 73
5.1.3 Zellverträglichkeit der flüssigen Matrix ... 74
5.1.4 Ermittlung der Besiedlungsdichte ... 75
5.1.5 Optimierung der flüssigen Matrix... 76
Sauerstoffmessung ... 77
Cell Proliferation Assay (MTT-Test) ... 78
DMMB- Assay (GAG-Assay)... 79
Inhaltsverzeichnis
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5.2 EXPERIMENT 1:VERGLEICH ZWISCHEN 2-D UND 3-D
KULTURVERFAHREN... 82
5.2.1 Makroskopie... 82
5.2.2 Durchlichtmikroskopie ... 84
5.2.3 Cell Proliferation Assay (MTT) ... 84
5.2.4 DMMB-Assay (GAG-Assay) ... 85
5.2.5 Westernblot (Kollagensynthese) ... 86
5.2.6 PCR (Genexpression für Kollagen) ... 89
5.2.7 Histologie ... 91
HE-Färbung ... 91
Pentachrom... 94
5.3 EXPERIMENT 2:EINFACHES 3-DKULTURVERFAHREN... 95
5.3.1 Experimente zur Sandwich-Besiedlungstechnik... 96
5.3.2 Experimente zur Injektions-Besiedlungstechnik ... 97
5.3.3 Probenentnahme... 98
5.3.4 Sandwich-Besiedlungstechnik: LIVE/DEAD Viability Kit, Cell Proliferation Assay, Histologie ... 98
5.3.5 Injektions-Besiedlungstechnik: LIVE/DEAD Viability Kit, Cell Proliferation Assay, Histologie ...100
5.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse...101
5.4 EXPERIMENT 3:KOMPLEXES 3-DKULTURVERFAHREN... 103
5.4.1 Makroskopie...104
5.4.2 Fluoreszenzfärbung zur Zellverteilung ...106
5.4.3 Cell Proliferation Assay (MTT-Test) ...107
5.4.4 DMMB-Assay (GAG-Assay) ...108
5.4.5 Westernblot (Kollagensynthese) ...109
5.4.6 Histologie ...111
6 DISKUSSION ...113
6.1 EINLEITUNG... 113
6.2 TISSUE ENGINEERING:TRACHEALER KNORPEL... 114
6.3 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK... 125
7 ZUSAMMENFASSUNG ...127
8 SUMMARY...132
9 LITERATURVERZEICHNIS...136
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ...147
11 DIAGRAMMVERZEICHNIS ...149
12 TABELLENVERZEICHNIS ...150
13 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...151
14 LISTE EIGENER PUBLIKATIONEN... 152
1 Einleitung
Mit dem sich in den letzten Jahren entwickelnden biotechnologischen Forschungszweig des Tissue Engineering bieten sich neue Behandlungsmöglichkeiten in der Medizin, im Besonderen in der Transplantationsmedizin. Das Tissue Engineering zielt auf die in-vitro Herstellung von Ersatzorganen oder Geweben ab, um den Mangel an Spenderorganen auszugleichen und die Behandelbarkeit von Krankheiten zu verbessern und so die Lebensqualität der Patienten zu erhöhen. Ziel ist die Entwicklung biologischer Implantate unter Verwendung patienteneigener Zellen, die die Gewebefunktionen geschädigter Organe erhalten, reparieren oder unterstützen (VACANTI et al. 1999).
Den Begriff Tissue Engineering verwendeten erstmals 1987 Vertreter der US- amerikanischen National Science Foundation (NSF) in Washington. Ein Jahr später wurde folgende Definition geprägt (JÜLICH 2005):
„Tissue engineering is the application of principles and methods of engineering and life science toward fundamental understanding of structure-function relationship in normal and pathological mammalian tissues and the development of biological substitutes to restore, maintain, or improve functions.”
Diese neuen Behandlungsformen stehen kurz vor dem klinischen Einsatz und werden teilweise schon seit Jahren verwendet. Die Therapien von Erkrankungen, die bisher nicht zufriedenstellend durchgeführt werden konnten, wie z.B. Herz- und Gefäßerkrankungen, sollen in Zukunft durch die Implantation biotechnologisch hergestellter Klappen, Gefäße oder Herzmuskelgewebe verbessert werden. Die Implantation von autologen Chondrozyten zur Reparatur von Gelenkknorpeldefekten wird in der Klinik schon seit Jahren eingesetzt (VISNA et al. 2004)
In der hier vorgestellten Arbeit soll mit den Methoden des Tissue Engineering in-vitro Knorpelgewebe gezüchtet werden, das als stabilisierendes Gerüst für eine flexible Luftröhrenprothese in der Thorax-Chirurgie verwendet werden soll.
Erkrankungen der Luftröhre und ihrer Umgebung durch z. B. primäre und sekundäre Tumoren, Intubationstraumata oder Unfalltraumata, angeborene langstreckige Trachealstenosen, Agenesie und Atresie haben häufig umfangreiche Resektionen
Einleitung 8
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zur Folge (GRILLO 2003b). Eine Entfernung von über 50 % der Ausgangslänge (> 6 cm) des Organs ist problematisch und lebensbedrohlich für den Patienten.
Die Zahl der Patienten, die eine langstreckige Luftröhrenprothese benötigen, ist eher gering. Da bisher weder die Implantation natürlicher noch synthetischer Prothesen zu befriedigenden Resultaten geführt hat (GRILLO 2002), bieten sich mit dem Bereich Tissue Engineering neue Möglichkeiten für die Behandlung solcher Patientengruppen. Im Besonderen für die Therapie von Kindern mit angeborenen Missbildungen, da so generierte Grafts im Patienten mitwachsen und häufige Nachoperationen überflüssig machen.
In dieser Arbeit sollen in-vitro Knorpelzellkulturverfahren zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea entwickelt, standardisiert und Nachweismethoden etabliert werden. Mit Hilfe der vorgestellten Techniken werden neue alternative Behandlungsmöglichkeiten für umfangreiche Luftröhrendefekte aufgezeigt.
2 Literaturübersicht
2.1 Anatomie, Histologie und Funktion der Luftröhre
Die Luftröhre (Trachea) verbindet als elastisches Rohr den Kehlkopf mit den beiden Hauptbronchien (Abb. 1). Sie ist etwa 12 cm lang, hat einen Durchmesser von 2,5 cm und wird durch 16-20 hufeisenförmige hyaline Knorpelspangen, die rückenwärts offen sind, gestützt. Die Knorpelspangen sorgen für eine ausreichende Stabilität, um ein Kollabieren der Trachea während der Atmung zu verhindern. Zum Erhalt der notwendigen longitudinalen Elastizität sind die Spangen untereinander über Bindegewebe verbunden.
Abb. 1: Eine anatomische Darstellung des Kehlkopf, der Luftröhre und der Hauptbronchien (GRAU 1825-1861)
Das Bindegewebe, die so genannte Lamina propria, ist reich an kollagenen und elastischen Fasern und wird durchzogen von tubuloazinösen Drüsen, die ein muköses Sekret bilden. Das Trachea-Lumen ist komplett mit Schleimhaut ausgekleidet, welches aus einem mehrreihigen, hochprismatischen Flimmerepithel besteht. Quer zu den Knorpelspangen auf der unten offenen Seite verläuft der Musculus trachealis. Eine bindegewebige äußere Hülle bildet die Tunica adventitia (Abb. 2). Die Blutversorgung des Organs wird von der Arteria thyreoidea inferior und der Arteria thyreoidea superior übernommen.
Literaturübersicht 10
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Abb. 2:
Histologie der Trachea, HE-Färbung, Affe, (KORF 2004 ),
A: Respiratorisches Epithel, B: Lamina propria,
C: Hyaliner Knorpel, D: Tunica adventitia,
Die Luftröhre dient der Beförderung von Luft zum Ein- und Ausatmen mit dem Ziel des alveolären Gasaustausches in den Lungen. Sie ist ein lebensnotwendiges Organ und versorgt indirekt den Organismus mit Sauerstoff als Grundlage für die zelluläre Atmung. Auf dem Weg durch die Luftröhre wird die Atemluft erwärmt, angefeuchtet und gereinigt. Die Flimmerhärchen und der von den Tracheadrüsen produzierte Schleim sorgen für eine Selbstreinigung der Atemwege. Verunreinigungen werden durch den abgesonderten Schleim gebunden und mit den in Richtung Rachen schlagenden Flimmerhärchen abtransportiert. Auf die selbe Art und Weise werden ebenfalls in der Luft enthaltende Keime wie z. B. Bakterien, Pilze oder Viren abgewehrt, so dass das Organ eine entscheidende Funktion in der Immunabwehr übernimmt.
2.2 Luftröhrenresektionen und ihre Durchführbarkeit
2.2.1 Erkrankungen der Luftröhre und ihrer Umgebung
Die meisten trachealen Läsionen können heute erfolgreich entfernt und rekonstruiert werden (GRILLO 1970 u. GRILLO 1989). Erkrankungen der Luftröhre, die eine Resektion von mehr als der halben Ausgangslänge unumgänglich machen, sind aber immer noch lebensbedrohliche Eingriffe. Es gibt eine Reihe von Krankheitsursachen wie z. B. primäre und sekundäre Tumoren, Intubationstraumata oder Unfalltraumata und angeborene Missbildungen wie z. B. langstreckige Trachealstenosen, Agenesie
und Atresie, die eine Indikation für einen größeren Luftröhrenersatz darstellen (GRILLO 2003b). Wobei nur eine kleine Anzahl von Patienten betroffen sind, die zur Zeit palliativ mit Stents und T-tubes behandelt werden (GRILLO 2002). Bis heute findet jedoch keine dieser Methoden eine klinische Akzeptanz.
2.2.2 Reparatur und Heilung der Luftwege
Operative Eingriffe an der Luftröhre und die anschließende Heilungsphase sind aufgrund der anatomischen Gegebenheiten kompliziert. Die Luftröhre hat kein eigenes Blutversorgungsgefäß und wird über kleinlumige Seitenäste der Schilddrüsengefäße, welche wiederum ein kollaterales Netzwerk ausbilden, durchblutet (SALASSA et al. 1977). Bei Dissektionen kommt es zur Zerstörung dieses Netzwerkes. Dadurch ist die für die Heilung essenzielle Durchblutung im Wundbereich nicht gegeben. Hinzu kommt, dass die Knorpelspangen aufgrund der physiologisch nicht vorhandenen Durchblutung diesen Prozess unterstützen. Die Folge sind Nekrosen, die zu Komplikationen in den Wundbereichen führen.
NAEF vergleicht 1990 das Heilungsvermögen der Luftwege mit dem des Magen- Darm-Traktes und der Haut. Die Wundheilung dieser Gewebe verkompliziert sich durch die vorhandenen keimhaltigen Schleimhäute. Die Wundflächen sind über den ständigen Kontakt zur Atemluft einem hohen Keimdruck ausgesetzt und so empfänglicher für bakterielle Infektionen. Zusätzlich führt nekrotisches Gewebe im Bereich der Anastomosen zur Ausbildung von Luftlecks, die wiederum ein hohes Infektionspotenzial für das umliegende Gewebe darstellen.
2.2.3 Entwicklung der Tracheachirurgie
In der Trachea-Chirurgie gelten heute Luftröhrenresektionen von über 50 % der Ausgangslänge (> 6 cm) des Organs als sehr problematisch. Bei kleineren Resektionen ist es möglich, nach der Entfernung des erkrankten Gewebes die Enden der Trachea wieder zu re-anastomosieren (GRILLO 2002). Dies ist erstmals 1881 GLÜCK und ZELLER in einem Hundemodell gelungen, mit der Hoffnung diese Technik auch in der Humanmedizin anwenden zu können.
Im frühen 20. Jahrhundert wurden von NOWAKOWSKI (1909) und LEVIT (1912) zur Reparatur trachealer Defekte Haut und Fascia lata eingesetzt. Später, in der Mitte
Literaturübersicht 12
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des 20. Jahrhunderts, haben CONLEY (1953), KAY (1951) und SWEET (1952) die meisten Heilungen nach Resektionen wieder durch End-zu-End-Anastomosen erzielt. Der zu resezierende Anteil beschränkte sich jedoch auf höchsten 2-3 Trachealringe; dies entspricht einer ungefähren Länge von 2-3 cm. MICHELSON et al. gelang 1961 an einem Hundemodell die Trachea aus dem umliegenden Gewebe zu mobilisieren und so die Resektionslänge auf 12 Ringe, also ca. 4-6 cm zu erhöhen. GRILLO et al. (1964a) haben diese Form der Rekonstruktion an menschlichen Leichen durchgeführt. Dabei fanden sie heraus, dass bei physiologischer Halshaltung mit zunehmender Resektionslänge die anatomische Spannung exponentiell steigt. In nachfolgenden Arbeiten von Grillo wurden die Resektionslängen durch eine Halsbeugehaltung der Patienten in Richtung Brust erhöht. Bei Resektionslängen von mehr als 6 cm ist eine Re-anastomosierung trotz Halsbeugung nicht durchführbar. In solchen Fällen wurden Prothesen aus den unterschiedlichsten Materialien implantiert. Eine geeignete Prothese für größere Resektionen ist bis heute nicht gefunden (GRILLO 2002).
2.2.4 Anforderung an eine Luftröhrenprothese
BESLEY hat 1950 die longitudinale Flexibilität bei ausreichender seitlicher Stabilität und die luminale Besiedelbarkeit mit respiratorischem Epithel als wichtige Eigenschaften für eine Luftröhrenprothese beschrieben. Wobei die luminale Epithelialisierung wünschenswert wäre, aber nicht unbedingt erforderlich ist (CRAIG et al. 1953 u. GRILLO 1965). Das Prothesenmaterial sollte ein gutes Einwachsen des Empfängergewebes ermöglichen und gleichzeitig keine Entzündungen, Granulationen, Infektionen oder Erosionen hervorrufen. Forscher wie JACKSON et al. (1950) und SCHERER et al. (1986) ergänzten wichtige Kriterien wie z. B.
Biokompatibilität, keine Toxizität, geringe Immunogenität, geringe Thrombozytogenität und keine Karzinogenität der implantierten Prothesen. Weiterhin ist eine Resistenz der Prothese gegenüber bakteriellen Besiedlungen und ein dauerhaft haltbares Material zwingend notwendig.
2.2.5 Luftröhrenprothesen im klinischen und experimentellen Einsatz Bis heute sind die Behandlungserfolge unter der Verwendung von Prothesen und den verschiedensten Operationstechniken zum Ersatz größerer Luftröhrendefekte nur kurzfristig (GRILLO 2003a). Körperfremde tubuläre Prothesen aus festen und porösen Materialien wurden in Tierexperimenten und teilweise auch in der Klinik implantiert. Als feste Materialien kamen, überwiegend in Hundemodellen, Stahlröhren (DANIEL 1948 u. WYKOFF 1973), Stahlspiralen (KESHISHIAN et al.
1956), Glassröhren (DANIEL 1948), Polyethylenstrukturen (SHAW et al. 1968), Siliconschläuche (BORRIE et al. 1973 u. DEMOS et al. 1973) und Teflonröhren (KRAMISH et al. 1963 u. BAILEY et al. 1970) zum Einsatz. Da die Ergebnisse dieser Studien sehr unbefriedigend waren, wurden diese Prothesen nur gelegentlich klinisch eingesetzt. Als nachteilig erwies sich ein schlechtes Einwachsen der Prothesen, da sie aufgrund ihrer Steifheit wanderten und sich vom Implantationsort entfernten.
Selten erfolgte eine komplette Re-Epithelialisierung des Lumens, und häufig traten Infektionen zwischen den Prothesen und dem respiratorischen Epithel auf. Zu Anfang war die Steifigkeit der Prothesen für kurze Zeit von Vorteil, bis sich aufgrund von Infektionen Granulationsgewebe ausbildete und den Luftweg stenotisch verschloss. Ebenso wurden poröse Prothesen wie z. B. Biopolymere aus Fibrin oder Collagen, Marlix-Prothesen (BEALL et al. 1962), Polytetrafluoroethylen-(PTFE)- Prothesen (CULL et al. 1990), Polyurethan-Prothesen (JACOBS et al. 1988) und Meshes gestützt von Plastikringen oder Spiralen (BUCHER et al. 1951, GREENBERG et al. 1962 u. POTICHA et al. 1966) mit Omentum, Faszie oder Perikard zur Luftabdichtung umwickelt, tierexperimentell getestet. Wenige dieser vielversprechenden Techniken kamen auch klinisch zum Einsatz.
Tierexperimente zur Porengröße (SCHERER et al. 1986) der porösen Prothesen ergaben, dass eine optimale Kapillarsprossung bei einer Porengröße von 40-60 µm erreicht werden kann. Die Studien zeigten, dass die porösen Grafts eine bessere Basis für die Zellmigration bieten. Leider gilt dies auch für die bakterielle Kolonisation. Zusätzlich kam es bei den festen Prothesen durch die Proliferation von Narbengewebe zu Obstruktionen und Stenosen.
Die experimentelle Implantation von nicht vitalen, autogenen, allogenen und xenogenen Bioprothesen aus Kadavertracheen fixiert in Alkohol, Formalin, Glutaraldehyd oder flüssigem Stickstoff waren im Großtiermodell (SCHERER et al.
Literaturübersicht 14
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1986) nicht erfolgreich. GRILLO et al. (1964b) machten die gleichen Erfahrungen.
Die von ihnen implantierten, konservierten lyophylisierten Gewebe wurden schnell durch Narbengewebe ersetzt.
Große Luftröhrendefekte mit schlechter Prognose wurden später durch nicht vitale und vitale autogene, allogene Bioprothesen mit direkter oder indirekter Vaskularisation aus z. B. Omentum (BALDERMANN et al. 1987), Intercostalmuskel (PENTON et al. 1952), Rippe und Pleura (WATSON et al. 1983) ersetzt. Die Vaskularisation fördert den Heilungsprozess und soll das Auftreten von Nekrosen verhindern. So wurde eine Vielzahl von Prothesen aus den verschiedensten Kombinationen von vitalem oder totem Gewebe mit variierenden Graftmaterialien getestet.
In einem Review von 2002 fasst GRILLO zusammen, dass lange Grafts zu Nekrosen und Granulationen neigen, und dass die Revaskularisation der Implantate aufgrund der trachealen Gefäßstruktur ein schwer lösbares Problem darstellt. Für erfolgreich hält er einen Autograft oder einen kryokonservierten Allograft mit omentaler Vaskularisation. Zudem weist er auf das Problem der Immunsuppression bei Patienten mit frisch transplantierten Allografts hin. Im Gegensatz dazu, wird bei der Verwendung von kryokonservierten Grafts nur eine geringe bis keine Immunsuppression benötigt.
Aus den aufgeführten Gründen wäre ein vaskularisiertes, idealerweise autologes Trachea-Implantat wünschenswert. Eine langfristige und spannungsfreie Rekonstruktion sowie ein Längenwachstum nach Tracheaoperationen im Kindesalter sollten möglich sein. Für die Herstellung solcher Trachea-Implantate bietet der Bereich Tissue Engineering erfolgversprechende alternative Therapieansätze (GRILLO 2003c).
2.3 Tissue Engineering
Das Tissue Engineering (TE) ist ein interdisziplinäres Feld aus einer Fächerkombination von Medizin, Naturwissenschaft und Ingenieurswissenschaft (LANGER et al. 1999). Ziel ist die Entwicklung biologischer Implantate, die die Gewebefunktion geschädigter Organe erhalten, reparieren oder unterstützen (VACANTI et al.1999). Die Umsetzung des Konzepts kann auf unterschiedliche Weise erfolgen, bei dem so genannten Guided Tissue Engineering werden zellfreie
Trägerstrukturen implantiert und die Rebesiedlung erfolgt in-vivo. Davon abzugrenzen ist das Tissue Engineering bei dem in-vitro besiedelte Matrices implantiert werden (SKALAK et al. 1991). Des Weiteren wird die Technik der Zelltransplantation sowie die Injektion von autologen oder xenogenen Zellen verwendet.
Die drei Hauptsäulen des Tissue Engineering sind die Zellen (Kapt. 2.3.1), die Matrices (Kapt. 2.3.2) als Trägerstrukturen für diese und die verschiedensten Kultivierungstechniken (Kapt. 2.3.3), wie z. B. der Einsatz von Bioreaktoren. Die Zellen können autologer, allogener oder xenogener Herkunft sein. Sie werden in-vitro vermehrt und gegebenenfalls auf einer Matrix angesiedelt. Diese Matrices sind dreidimensionale Gerüste, in der Regel in der Form des zu ersetzenden Organs. Sie können synthetischer oder biologischer Herkunft sein. Die Verwendung von Bioreaktorsystemen dient der Simulation zellphysiologischer Bedingungen.
In den unterschiedlichsten medizinischen Disziplinen findet Tissue Engineering bereits seine Anwendung. Auf einigen Gebieten befindet sich die Entwicklung noch im Bereich der Grundlagenforschung [z. B. artifizielle Trachea (KOJI et al. 2003)] und auf anderen schon im präklinischen bzw. im klinischen Einsatz [z. B. Haut (WALGENBACH et al. 2001) und Knorpel (MARLOVITS et al. 2004a)].
Die Entwicklung komplexer bioartifizieller Organe ist derzeit noch problematisch.
Einen limitierenden Faktor stellt die mangelnde Vaskularisation und somit mangelhafte Sauerstoff- und Nährstoffversorgung der künstlichen Gewebe dar (WALLES et al. 2003). Durch die Injektion von Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF/TGF- β) in die ischämischen Gewebeareale wird versucht, in-vivo Neoangiogenese zu induzieren (ISNER et al. 1996).
Somit ergeben sich mit den Methoden des Tissue Engineering neue Möglichkeiten, geschädigte oder zerstörte Organe zu ersetzen. Die bisher angewandten Techniken der Allotransplantation, also Organspende, der Transplantation von xenogenen Gewebe oder der Implantation von künstlichen Prothesen bergen einige Nachteile gegenüber dem neuen Forschungszweig.
Bei der allogenen Organtransplantation ist die Verfügbarkeit der Organe begrenzt. Im Jahr 2003 standen 9479 angemeldete Patienten zur Nierentransplantation auf der aktiven Warteliste in Deutschland. Durchgeführt wurden in diesem Jahr jedoch nur 2515 Nierentransplantationen (PADBERG 2004).
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Die Implantation eines allogenen Spenderorgans hat für die Patienten eine lebenslange Immunsuppression zur Folge. Damit steigt für diese das Risiko, an malignen Tumoren oder schwer kontrollierbaren Infektionen zu erkranken.
Eine weitere mögliche Alternative zur Organspende ist die Xenotransplantation. Die Verwendung tierischer Organe bietet die theoretische Möglichkeit unbegrenzter Verfügbarkeit. Intensive Forschungsbemühungen der letzten Jahre haben dazu geführt, dass einige Hürden der massiven Abstoßungsreaktionen bei der Implantation frischer xenogener Organe überwunden werden konnten (KUES u.
NIEMANN 2004). Dennoch ist nicht geklärt, ob alle zellulären Oberflächenproteine, die Immun- bzw. Abwehrreaktionen des Patienten auslösen, zu kontrollieren sind.
Die mögliche Übertragung von Zoonosen durch das porcine endogene Retrovirus (PERV) stellt mit der Züchtung PERV freier Mini-pigs scheinbar kein Problem mehr dar (KUES u. NIEMANN 2004).
Fixierte Herzklappen vom Schwein werden schon seit Jahren erfolgreich implantiert (PARK et al. 2000). Durch den Fixierungsprozess nimmt die Immunogenität der Implantate ab. Allerdings halten auch diese biologischen Prothesen degradationsbedingt nur 5-15 Jahre.
Bei der Verwendung künstlicher Prothesen überwiegen die Nachteile. Die Eigenschaften der Implantate sind häufig durch eine eingeschränkte Funktionalität, eine schlechte Biomechanik, eine hohe Thrombogenität und eine schwierige Integration ins Empfängergewebe gekennzeichnet (HODDE 2002).
Aufgrund der aufgezählten Mängel bietet das Tissue Engineering eine Alternative zu allen bisher eingesetzten Behandlungsmethoden.
2.3.1 Säule 1: Zellen
Die im Tissue Engineering verwendeten Zellen können autologer, heterologer und xenogenen Ursprungs sein. Erstrebenswert ist der Einsatz autologer Zellen, um einer notwendigen Immunsuppression vorzubeugen. Nach den Entwicklungsstadien werden primäre adulte ausdifferenzierte Zellen, embryonale und adulte Stammzellen unterschieden. Adulte gewebetypspezifische Zellen werden den Patienten über Gewebsbiopsien entnommen. Häufig steht nur begrenzt oder bei totalem Organverlust kein organspezifisches Material mehr zur Verfügung. Eine geringe Ausgangszellzahl bedeutet eine in-vitro Zellvermehrung mit dem Risiko der
Dedifferenzierung der Zellen unter Zellkulturbedingungen (MARLOVITS et al.
2004b). Bei dem Prozess der Dedifferenzierung verlieren die Zellen ihre physiologischen Eigenschaften und können ihre Funktion nach Implantation nicht mehr oder nur eingeschränkt erfüllen.
Ein Ansatz, um diese Schwierigkeiten zu umgehen, ist die Verwendung von adulten Stammzellen. Sie haben das Potenzial nach der Isolierung in verschiedene Zelltypen zu differenzieren (QUARTO et al.). Die gezielte Induktion und Kontrolle der Differenzierung sowie der Proliferation sind noch ungelöste Probleme, die derzeit intensiv erforscht werden. Die Differenzierung lässt sich durch die Bereitstellung zelltypspezifischer Nährstoffe oder über die Verwendung bestimmter Zellkuturmedien bzw. Wachstumsfaktoren in Maßen steuern. Unterstützend können Zell-Zell- Kontakte, Kontakte zur extrazellulären Matrix (ECM) (BEHONICK et al. 2003) und der Einsatz von mechanischem Stress in Bioreaktorsystemen (VUNJAK- NOVAKOVIC et al. 1996) wirken. Inwieweit das Proliferationsvermögen der Zellen steuerbar ist, und ob diese Zellen nach In-vivo-Implantation nicht tumorös entarten ist unklar.
2.3.2 Säule 2: Matrices
Die Matrices dienen als Trägerstrukturen für die Zellen und bilden die Grundlage für einen gewebeähnlichen räumlichen Aufbau. Die Trägerstrukturen für das Tissue Engineering sollten biokompatibel sein, die Ernährung und Anhaftung von Zellen gewährleisten und ein gutes Einwachsen des umliegenden Gewebes ermöglichen.
Grundsätzlich werden natürliche Matrices und synthetische Matrices unterschieden.
Synthetische Materialien wie PTFE (CHEN et al. 1997) oder Polyglykolsäuren haben den Vorteil einer variablen Formgestaltung, Porengröße und Stabilität. Eine verbesserte Zelladhäsion der künstlichen Konstrukte lässt sich durch Beschichtungsverfahren mit z. B. Fibronektin erzielen. Ein großer Nachteil der synthetischen Grafts sind toxische Abbauprodukte, Thrombosierungen, Kalzifikationen (VYAVAHARE et al. 1989) und überschießende Entzündungsreaktionen des umliegenden Gewebes, sowie nur im geringen Umfang stattfindende Umbauprozesse der Matrix durch Zellen (Remodeling) (HODDE 2002).
Um Komplikationen zu vermeiden, die mit körperfremden Grafts einhergehen, sind in den letzten Jahren eine Vielzahl natürlicher Matrices getestet worden. Die Gewebe
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werden mit mechanischen und chemischen Verfahren unter Erhalt der ECM von Zellen befreit, wie z. B. die Small Intestinal Submucosa (LANTZ et al. 1993), die azelluläre Dermis (WAINWRIGHT 1995), die azelluläre Kadaver-Faszie (BLANDER et al. 2000), die azelluläre Blase (BADYLAK et al. 2000) oder die azellulären Membranen der Amnionhülle (KIM et al. 1995). Die entstandenen dreidimensionalen biologischen Matrices enthalten Wachstumsfaktoren und Komponenten einer für Zellen essenziellen natürlichen Mikroumgebung wie Kollagen, Elastin, Glucosamnioglykanen, Fibronectin, Heparin- und Dermatansulfat. Diese Umgebung bietet optimale Vorraussetzungen für eine Rebesiedlung. Sie fördert die Anhaftung, Migration, Proliferation und Differenzierung der Zellen. Die generierten Implantate interagieren schnell mit dem Empfängergewebe und induzieren früh Angiogenese und führen so zu einem funktionellen Gewebeersatz (HODDE 2002). Dieser indirekten Vaskularisation der Implantate durch das Empfängergewebe sind Grenzen gesetzt. Mit zunehmender Größe des künstlich generierten Gewebes wird die Revaskularisation immer schwieriger. Eine Möglichkeit für das Tissue Engineering größere Gewebe- bzw. Organdefekte zu reparieren, bietet die in unserem Labor entwickelte biologische vaskularisierte Matrix, die sogenannte BioVaM® (SCHULTHEISS et al. 2004). Dabei handelt es sich um ein azelluläres Segment porcinen Dünndarms, der unter Erhalt des Gefäßsystems präpariert wird. Die Gefäße des arteriellen Zuflusses und des venösen Abflusses bleiben bei der Azellularisierung strukturell erhalten. An der Rebesiedlung mit autologen Zellen wird derzeit gearbeitet. Dies sind erste Forschungsansätze zur Problemlösung des Vaskularisationsdefizits größerer Implantate.
Neben den natürlichen Geweben kommen auch künstlich hergestellte biologische Matrices zum Einsatz. Sie können allerdings nicht die Vielfalt einer natürlichen Mikroumgebung bieten. Bei der Herstellung dieser Konstrukte werden eine oder mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix benutzt. Die Implantationen besiedelter Grafts aus Kollagen als Knorpelgelenksersatz werden bereits in der Klinik durchgeführt (STARK et al. 1998, S.189-193).
Auch andere biologische Materialien wie Alginat (CHUBINSKAYA et al. 2001), Chitosan oder Gelatine werden verwendet.
2.3.3 Säule 3: Kultivierungstechniken
Neben der klassischen zweidimensionalen Kultivierung von Zellen in Zellkulturflaschen oder Petrischalen gibt es heute eine Reihe neuer Kultivierungsmöglichkeiten von Zellen. Unter Anwendung der zweidimensionalen Zellkulturen verändern sich die Zellen in ihrer Morphologie und ihrem Metabolismus häufig, sie dedifferenzieren. Die Kultivierung der Zellen in einem zelltypspezifischen Kulturmedium mit den geeigneten Zusätzen an Wachstumsfaktoren wirkt diesem Prozess entgegen. Ebenfalls soll die Entwicklung einer dreidimensionalen Kultur in Matrices oder in Flüssigkeiten, so genannten Spinner Flasks, die Dedifferenzierung vermeiden und Stammzellen eine gezielte Reifung ermöglichen oder zuvor zweidimensional kultivierten Zellen die Möglichkeit der Rückdifferenzierung erlauben.
Neue Bioreaktortechnologien erlauben neben der ursprünglichen statischen Kultivierung der Gewebekonstrukte auch eine dynamische Kultivierung. Sie sind in der Lage, definierte Formen von Stress zu applizieren. Je nach Zellart und ursprünglichen physiologischen Bedingungen werden Scherstress, Dehnungsstress oder Zugstress eingesetzt. Mit dieser Technologie konnten z. B. die elastischen Eigenschaften von in-vitro kultiviertem Knorpel verbessert werden (PEI et al. 2002).
Andere Arbeiten belegen eine Differenzierung von Progenitor-Zellen aus dem Knochenmark in Richtung ligamentbildenden Zellen unter Verwendung von Zug- und Dehnungsstress (ALTMAN et al. 2002).
Unter Simulation einer pulsatilen Perfusion ist es gelungen, funktionelle autologe Arterien im Bioreaktor zu generieren (NIKLASON et al. 2001). Die Perfusionstechnik wird bei der Herstellung kompakterer Gewebe wie Knorpel genutzt, um die Ernährung der Zellen zu gewährleisten und den Transport von Nährstoffen, Gasen und Stoffwechselendprodukten zu erleichtern (VUNJAK-NOVAKOVIC et al. 1996).
2.4 Histologie und Biochemie des hyalinen Knorpels
Der hyaline Knorpel kommt am häufigsten im menschlichen Körper vor. Er bildet z. B. die Grundlage für Rippenknorpel, Nasenknorpel, Gelenkknorpel und Knorpel der Atemwege. Makroskopisch betrachtet erscheint frisch synthetisierter Knorpel bläulich weiß und älterer Knorpel gelblich.
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Knorpelgewebe besteht zu 3 % aus Zellen, zu 67 % aus Wasser und zu 30 % aus ECM, welche sich aus Grundsubstanz und Fasern zusammensetzt. Das Gewebe unterliegt keiner Vaskularisation und Innervation. Die Ernährung erfolgt über Diffusion der den Knorpel umgebenden Gewebe.
Knorpelgewebe gehört zu der Gruppe der Bindegewebe und hat seinen Ursprung im mesenchymalen Gewebe. Funktionell intaktes Gewebe ist von fester Konsistenz, druckelastisch, verformbar und stoßdämpfend-elastisch. Die mechanische Funktionalität ist von der Struktur der ECM abhängig.
Grundsubstanz produzierende Zellen werden als Chondroblasten bezeichnet. Sie scheiden Grundsubstanz aus, in der die Zellen auseinander weichen und vereinzelt liegen bleiben. Eine zur Ruhe gekommende Knorpelzelle wird als Chondrozyt bezeichnet. Liegen die Zellen dennoch paarweise in der ECM, sind durch Zellteilung so genannte isogene Zellgruppen entstanden.
Knorpelzellen synthetisieren und erhalten die ECM. Sie bilden intrazellulär Prokollagen, dass sie an den extrazellulären Raum abgeben. Eine stoffwechselaktive Zelle ist gekennzeichnet durch einen hohen Gehalt an erweiterten Schläuchen des endoplasmatischen Retikulums und vergrößerten Golgi-Feldern. Dies sind Hinweise auf eine verstärkte Protein- und Kohlenhydratsynthese zur Bildung von Fasern und Glucosaminoglykanen (GAG). Zwischen der Zelle und der ECM befindet sich ein 1- 2 µm breiter Knorpelhof, der schalenartig von einem Geflecht von Kollagenfasern umgeben wird, der Knorpelkapsel. Lichtmikroskopisch erscheint dieser Raum, der auch als Knorpellagune bezeichnet wird, durch die histologische Fixierung künstlich erweitert. In diesen Spalt ragen fingerförmige Mikrovilli, die Zellprodukte abgeben, Kollagenfasern synthetisieren und mit Proteoglykanen vernetzen. Die die Zelle umgebende Knorpelkapsel und der Knorpelhof sind die wichtigsten Baueinheiten des Knorpelgewebes. Sie werden als Chondrone bezeichnet.
Neben den Fasern bilden die Zellen auch ungeformte Grundsubstanz aus Glucosaminoglykanen. Sie bestehen aus Hyaluronsäure und Proteoglykanen, die mit unterschiedlichen Seitenketten wie Chondroitin-4-Sulfat, Chondroitin-6-Sulfat oder Keratansulfat ausgestattet sein können. Die Glucosaminoglykane verleihen dem Gewebe die nötige Festigkeit und die Proteoglykane, durch ihr Wasserbindungsvermögen, die Elastizität und Verformbarkeit.
Es gibt zwei Knorpelzellwachstumsformen, das „Äußere“, das heißt, die Knorpelzellvermehrung erfolgt von der Knorpelhaut aus und das „Innere“, schon differenzierte Zellen teilen sich nochmals. Das Wachstum lässt sich durch Vitamin A anregen. Die sekretorische Aktivität der Zellen lässt sich durch Wachstumshormone, Thyroxin und Geschlechtshormone steigern. Eine Hemmung der Chondrocyten- Reifung kann mit dem Adreno-Corticotropen-Hormon (ACTH) und Kortisol erzielt werden.
Neben dem hyalinen Knorpel kommen noch elastischer Knorpel und Faserknorpel im Säugetierorganismus vor. Der elastische Knorpel ist sehr biegsam und bildet z. B.
die Grundlage für die Ohrmuschel und den Kehldeckel. Der sehr widerstandfähige Faserknorpel kommt in der Zwischenwirbelscheibe und in Sehnen vor.
Abb. 3:
Histologie, hyaliner Knorpel, Schwein,
HE-Färbung,
Vergrößerung: 400-fach,
A: Chondrozyt, B: Knorpellagune, C: Isogene Zellgruppe
2.4.1 Extrazelluläre Matrix
Die ECM hält die Zellen aller Bindegewebstypen zusammen. Sie füllt als gallertartige Masse den Raum zwischen den Zellen und bildet die Diffusionsgrundlage für die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung. Die ECM des Knorpelgewebes besteht aus der Grundsubstanz der ungeformten Komponente und den kollagenen Fasern der geformten Komponente.
A
B
C
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2.4.2 Proteoglykane
Die Grundsubstanz besteht aus Heteropolysachariden, die als Glucosaminoglykane bezeichnet werden und aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten aufgebaut sind. Die Veresterung der Zucker mit Sulfatgruppen führt zu einer hohen negativen Ladungsdichte und damit zu einem hohen Wasserbindungsvermögen, welches dem Knorpel die Elastizität verleiht. Durch die Bindung der Glucosaminoglykane an extrazelluläre Proteine entstehen Proteoglykane. Im Knorpelgewebe werden Chondroitinsulfat, Hyaluronsäure und Keratansulfat als Glucosaminoglykane unterschieden. Das knorpelspezifische Proteoglycan Aggrecan besteht aus einem Hyaluronatstrang, von dem seitlich zahlreiche Kernproteine abgehen, welche wiederum eine Bindung mit den Glucosaminoglykanen eingehen.
Die Zusammensetzung der ECM veranschaulicht die Abbildung 4 und den Aufbau des Aggrecanmoleküls die Abbildung 5.
Chondrozyt
Kollagenfaser
Hyaluronsäure Extrazelluläre Matrix Aggrecan
Abb. 4: „Structural Hierarchy and Function of the components of Articular Cartilage“
(SEOG 2004)
Die Proteoglykane werden nach der Struktur der Kernproteine in Familien, wie Aggrecan (im Knorpel), Perlecan (in der Basalmembran), Versican (in der Gefäßwand), Decorin (im kollagenen Bindegewebe) und Syndecan (an der Zellmembran) eingeteilt. Die Anordnung der Proteoglykane im Raum ist für die physikalischen Eigenschaften eines Bindegewebes ausschlaggebend und bestimmt somit Diffusionsvorgänge und Konsistenzeigenschaften von fest, viskös bis elastisch.
Abb. 5: Der Aufbau des knorpelspezifischen Aggrecanmolküls (ROYCE et al. 1993)
2.4.3 Glykoproteine
Glykoproteine setzen sich aus Eiweißen und an diese kovalent gebundenen Kohlenhydratketten zusammen. Der Proteinanteil überwiegt gegenüber dem Zuckeranteil. Im Bindegewebe vermitteln sie Bindungen zwischen Adhäsionsproteinen der ECM und den Integrinen der Zellmembranen der Bindegewebszellen. Als Glykoproteine kommen Vitronektin, Laminin, Thromospondin und Fibronektin vor. Fibronectin, eines der wichtigeren Glykoproteine, sorgt für die Verankerung der Zellen in der ECM und für den Zusammenhalt der Proteoglykane und der Fasern innerhalb ECM.
2.4.4 Kollagene
Die Proteoglykane werden durch ein kollagenes Netzwerk zusammengehalten. Von den derzeit bekannten 20 Kollagentypen kommt im hyalinem Knorpel überwiegend Kollagen Typ II und in geringen Maßen auch Kollagen Typ IX und XI vor. Von den letzten beiden Kollagentypen wird angenommen, dass sie eine stabilisierende Funktion auf das Kollagengerüst haben, indem sie die Quervernetzung zu Kollagen Typ II Fasern bilden.
Kollagene sind Proteine, die ihrer Konformation nach eine Kollagenhelix darstellen.
Sie bestehen aus 3 Aminosäurenresten pro Windung. Die vorherrschenden
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Aminosäuren sind Glycin mit 35 %, Alanin mit 11 % und Prolin oder Hydroxyprolin mit 21 %. Charakteristisch für Kollagenfasern ist ihre extrem hohe Zugfestigkeit.
Diese entsteht durch das Umschlingen von drei Kollagenhelixes zu einem rechtsgängigen Kabel, der so genannten Superhelix.
Die wichtigsten Kollagentypen und ihr Vorkommen sind in folgender Tabelle dargestellt.
Kollagentypen Vorkommen
I Unterhautbindegewebe, Sehne, Knochen, Dentin
II Hyaliner- und Faserknorpel, Glaskörper des Auges, Chorda dorsalis III Unterhautbindegewebe, Muskel, Blutgefäßwände, lockeres
Bindegewebe IV Basalmembranen
V Fetales Gewebe, interstitielles Gewebe, Chorium, Knochen, Plazenta
VI Interstitielles Gewebe
VII Verankert die Basallamina von Epithelien mit dem darunterliegenden Bindegwebe
VIII Subendotheliales Gewebe, Descemet-Membran X Epiphysenfugen
XI Knorpel
IX Knorpel, Glaskörper,
XII Embryonale Sehne, Unterhautbindegewebe XIV Fetales Unterhautbindegewebe, Sehnen
Tab. 1: Die unterschiedlichen Kollagentypen und ihr Vorkommen
2.5 Probleme der Knorpelzellkultivierung
Die Knorpelzellkultivierung findet in vielen medizinischen Bereichen, wie in der Orthopädie bei Gelenkerkrankungen (OAKES 2004) oder in der Rekonstruktiven Chirurgie (STARK et al. 1998 S.179-187) eine experimentelle und klinische Anwendung. Die Problematik liegt bei Knorpeldefekten in der nur begrenzten Regenerationsfähigkeit des Gewebes, die in dessen anatomischen Aufbau begründet ist. Zum Erhalt geschädigter oder zerstörter Knorpelgewebe bietet sich die Möglichkeit der Transplantation von Zellen oder in-vitro generierter Ersatzgewebe.
Die aus Biopsien gewonnenen, idealerweise autologen Knorpelzellen haben den Vorteil, dass sie beim Empfänger keine Immunsuppression notwendig machen.
In der Klinik wird diese Technik als autologe Chondrozyten Transplantation (ACT) bei Gelenkknorpeldefekten eingesetzt (VISNA et al. 2004). Die aus den Biopsien gewonnenen Zellen werden in-vitro unter zweidimensionalen Kulturbedingungen vermehrt und bei ausreichend hoher Zellzahl auf einer dreidimensionalen Matrix kultiviert und anschließend implantiert.
Die Herausforderung in der Knorpelzellkultivierung liegt darin, die Zellen so zu kultivieren, dass sie ein Gewebe bilden, welches der natürlichen Knorpelzusammensetzung ähnlich ist. Die konventionelle zweidimensionale Zellkultur primärer ausdifferenzierter Chondrozyten führt zu Veränderungen im Zellmetabolismus und der Zellmorphologie (DESHMUKH et al. 1976). Dieser Prozess wird als Dedifferenzierung bezeichnet. Der Verwandlungsgrad steigert sich mit der Länge der Kulturdauer oder der Höhe der Passagezahlen. Charakteristisch sind eine hohe Zellproliferation (Hyperproliferation), eine sich ändernde Zellform von rund zu spindelförmigen Zellen und Störungen im Zellmetabolismus.
Die Chondrozyten sezernieren unter diesen Kulturbedingungen minderwertigen Knorpel, der als Dedifferenzierungsmarker genutzt wird. Es findet eine Verschiebung der Kollagentypenproduktion von Typ II zu Typ I und Typ III statt (STARK et al. 1998, S.163-168 u. MARLOVITS et al. 2004). Ebenfalls kommt es zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Grundsubstanz, gekennzeichnet durch einen verminderten Aggrecan- oder GAG-Gehalt (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2004).
Zur Unterdrückung des Dedifferenzierungsprozesses ist es notwendig, den in-vitro kultivierten Zellen eine ihren physiologischen Bedingungen ähnliche Umgebung zu
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bieten. Das Spektrum reicht von der optimalen Nährstoff- bzw. Sauerstoffversorgung, über Zell-Zellkontakte bis zu Zell-Matrix-Kontakten (GOESSLER et al. 2004). Also die Gestaltung einer komplexen dreidimensionalen Zellkultur. Die unterschiedlichen dreidimensionalen Kultivierungsmethoden sind in Kapitel 2.3.2 beschrieben. Die Abbildung 6 zeigt morphologisch sichtbar dedifferenzierte spindelförmig wachsende Knorpelzellen unter 2-D Monolayerkulturbedingungen. Im Gegensatz dazu ist den Knorpelzellen in der 3-D Kultur in Abbildung 7 die ursprünglich runde Zellmorphologie erhalten geblieben.
Da die Zusammensetzung der Knorpelmatrix auch eine Reaktion auf die Art und Stärke der mechanischen Belastungen im Säugetierorganismus ist, werden Zellkulturen heute während ihrer Entwicklung im Labor mechanisch belastet, um so einen funktionellen Gewebeersatz zu erhalten (ALTMAN et al. 2002).
Oftmals sind aufgrund zu geringer Ausgangszellzahlen, durch dass nur begrenzt zur Verfügung stehende Biopsiematerial Zellvermehrungen unter zweidimensionalen Bedingungen notwendig. Anschließend werden die dedifferenzierten Zellen bei ausreichend hoher Zellzahl in ein dreidimensionales Kultursystem überführt. Die Grundidee der Rückdifferenzierung der Zellen über die räumliche Anordnung und das Angebot bestimmter Bestandteile der ECM konnte bisher noch nicht belegt werden (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2004).
Die Überprüfung des generierten Gewebes auf „Knorpelähnlichkeit“ kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Geeignete Methoden sind die Auswertung der Anordnung und Morphologie der Zellen in der Matrix, Analysen der Genexpression für die verschiedenen Kollagentypen, Analysen der Faserproteine, Analysen der biochemischen Zusammensetzung der Matrix (z. B. GAG-Gehalt) sowie die Überprüfung der mechanischen Festigkeit.
Abb. 6:
2-D Kultur,
porcine Knorpelzellen, Durchlichtmikroskopie, Vergrößerung: 100-fach
Abb. 7:
3-D Kultur,
porcine Knorpelzellen in flüssiger Matrix,
Durchlichtmikroskopie, Vergrößerung: 100-fach
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2.6 Ziel dieser Arbeit
Langfristiges Ziel ist es, mit den Methoden des Tissue Engineering einen Luftröhrenersatz zu konstruieren. Das Konzept besteht aus der getrennten In-vitro- Kultivierung der verschiedenen Zelltypen der Luftröhre aus autologen Zellquellen. Als Trägermaterialien für die Zellen sollen biologische azellularisierte Gewebe vom Schwein dienen, die nach Rebesiedlung wieder zu einem Organersatz zusammengefügt werden sollen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einem Teilaspekt dieses Vorhabens, der Kultivierung von Chondrozyten. In diesem Rahmen soll in- vitro ein Knorpelgewebe generiert werden, dass der anatomischen Form nativer Luftröhrenspangen entspricht und deren mechanische Eigenschaften aufweist, um eine tubuläre flexible Matrix zu stabilisieren.
Unter in-vitro Kulturbedingungen, im Besonderen in der 2-D Kultur, neigen Knorpelzellen wie in Kapitel 2.5 beschrieben sehr schnell und früh zur Dedifferenzierung. Sie hyperproliferieren, verändern ihre Zellform von rund zu spindelförmig und synthetisieren minderwertigen Knorpel ohne mechanische Festigkeit (DESHMUKH et al. 1976). Im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Verfahren wie der ACT, ist das Ziel dieser Arbeit, der Aufbau einer dreidimensionalen Kultivierungsmethode zur Zellvermehrung, um so den Schritt der zweidimensionalen Zellkultur mit den negativen Folgen der Dedifferenzierung zu überspringen. Als Besiedlungsgrundlage diente eine von uns entwickelte biologische flüssige Matrix (WALLES et al. 2004), die die Zellen von Kulturbeginn an zur Kollagen Typ II Produktion anregen und mit zunehmender Kulturdauer eine Verfestigung der Matrix bewirken soll. Durch die zu Anfang flexible Formgestaltung der Matrix wäre der Einsatz auch in anderen Anwendungsbereichen denkbar.
Wesentliche experimentelle Bestandteile dieser Arbeit sind die Optimierung des Herstellungsverfahrens der flüssigen Matrix und die Entwicklung sowie Testung der drei nachfolgend genannten Techniken zur dreidimensionalen Knorpelzellkultivierung.
1. Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren 2. Einfaches 3-D Kulturverfahren
3. Komplexes 3-D Kulturverfahren
Der Besiedlungserfolg der durchgeführten Experimente wurde qualitativ mit einem Vitalitätstest an den kultivierten Zellen überprüft. Zur Charakterisierung der ECM diente der Nachweis von Kollagen I, II und III auf Protein- und von Kollagen I und II auf Genexpressionsebene sowie dem Gehalt an Glucosaminoglykanen. Parallel wurde der histologische Aufbau der generierten Gewebe und die Stoffwechselaktivität der Zellen überprüft.
Bei dem Erhalt eines knorpeligen Konstruktes war vorgesehen, die Chondrozyten in Spangenform auf einer flexiblen, tubulären, vaskularisierten Matrix anzusiedeln und nach einer in-vitro Kultivierungsphase diesen Organersatz im Großtiermodell Schwein experimentell zu testen.
Als vaskularisierte Matrix sollte die im Labor entwickelte BioVaM® (SCHULTHEISS et al. 2004) eingesetzt werden.
Abb. 8: Die BioVam®
Eine biologisch vaskularisierte Matrix, die unter Erhalt des Gefäßsystems präpariert wurde. Zur Visualisierung der Gefäßstrukturen wurden diese mit Toluidinblau angefärbt.
Material 30
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3 Material
3.1 Tiere
Die Tierversuche zur sterilen Entnahme der Gewebe wurden nach §8 Abs. 1 des Tierschutzgesetzes BGB 1. IS. 01484 von der Bezirksregierung Hannover genehmigt. Auf die Einhaltung der Empfehlung des National Institut of Health (USA) zum Umgang mit Versuchstieren wurde geachtet („guide for the care and use of laboratory animals“, 1996). Verwendet wurden ca. 25 kg schwere Schweine der Deutschen Landrasse.
3.2 Chemikalien
Aceton J.T. Baker
3-Aminopropyltreithoxy-silan SIGMA
Agarose ultraPure LIFE TECHNOLOGIES
Albumin Fraktion V, bovine SIGMA
Alcianblue SIGMA
Ammonium Hydroxide SIGMA
Ampuwa® FRESENIUS KABI
Anilinblau MERCK
Aprotinin SIGMA
Ascorbinsäure SIGMA
Azokarmin SERVA
Biocoll (Ficoll) Separatine Solution BIOCHROM AG
Bradford Reagenz BIO-RAD
Brilliant Crocein CHROMA
Bromphenolblau-Pufferlösung PROMEGA
Cell Titer 96®AQueous One Solution Reagent PROMEGA
Chloroform 100% J.T. BAKER
Collagen Type X, nach Bernstein und Taub Type III Sigma
Collagenase A (0,180 U/mg) ROCHE
Collagenase Type II (317 U/mg) WORTHINGTON Corbit-Balsam HECHT
Cystein MERCK DEPC (Diethyl Pyrocarbonat) SIGMA
DMMB (Dimethylmethylenblau-Hydrochlorid) APPLICHEM Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) MERCK
DMSO (Dimethylsulfoxid) MERCK
dNTP (2’-Desoxynucleosid 5’-Triphosphat
Tetrasodiumsalz) Set 1 ROTH
ECLTM Blotting Detection Reagents AMERSHAM BIOSCIENCES
EDTA Titriplex III MERCK
Eosin, gelblich SIGMA
Eisessig J. T. BAKER
Ethanol 100%, vergällt J.T. BAKER
Ethidiumbromid SIGMA
Formaldehyd 3,5-3,7 %, netral gepuffert FISCHAR Gelatine Typ A: From porcine skin SIGMA
Glycerol Approx. 99% SIGMA
Glycin zur Analyse MERCK
Harnstoff MERCK
Härris Hämatoxylinlösung (Papanicolaou) MERCK
HCl 1M MERCK
Histoclear BAKER
Isopropanol 100% ROTH
LIVE/DEAD Viability Assay KIT MOLECULAR PROBES Magermilchpulver (sprühgetrocknet) LASANA
Methanol J.T. BAKER
Meyer’s Hämalaunlösung MERCK
MOPS (3-[N-Morpholino] Propanesulfonicacid) SIGMA
Natriumazid ROCHE
Natriumchlorid (NaCl) MERCK
Natriumdesoxycholat SIGMA
Natriumdihydrogenphoshat (NaH2PO4) MERCK Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) MERCK
Material 32
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Natrium-Orthovanadat 100Mm SIGAM
Nebacetin® siccum YAMANOUCHI
NP 40-Nonidet® P40 Substitute FLUKA
NuPAGE® LDS Sample Buffer INVITROGEN NuPAGE® MOPS SDS Elektrophoresepuffer INVITROGEN
NuPAGE® Reducing Agent INVITROGEN
Orange G FLUKA
Paraplast KENDALL
Papain, from Papaya Latex SIGMA
PercollTM AMERSHAM
BIOSCIENCES Phosphat Buffered Saline Tablets SIGMA
Phosphorwolframsäure MERCK
PMSF-Phenylmethylsulfonylfluoride BOEHRINGER MANNHEIM
Poly(vinylalcohol) PVA SIGMA
Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range BIO-RAD
RED TaqTM DNA Poymerase SIGMA
RNasin® PROGMEGA
Saffron du Gatinais SIGMA
Säurefuchsin CHROMA
SDS/Natriumlaurylsulfat ROTH
Smart LadderTM 1000-10000 bp für DNA EUROGENTEC Smart Ladder SV 100-1000 bp für RNA EUROGENTEC
Sodiumpyrophosphat SIGMA
SuperScript TM Reverse Transkriptase INVITROGEN Tissue-Tek® O.C.T. TM Compound SAKURA
Tris (hydroxymethyl)- aminomethan (Tris-Base) MERCK Tris (hydroxymethyl)- aminomethan-hydrochlorid MERCK
TRIzol®Reagent INVITROGEN
Trypan blue solution SIGMA
Trypsin/EDTA 10-fach konzentriert
(0,05% Trypsin/0,02% EDTA) PAA
Tween-20® ROTH
Xylol J.T.BAKER
3.3 Zellkuluturmedien, Zusätze und Lösungen
BGJb Medium Fitton-Jackson Modification, w/L-Glutamine US BIOLOGICAL DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Media) GIBCO
Ham’s F-12 Nutrient Mixture INVITROGEN
Waymouth Medium MB INVITROGEN
Fötales Kälberserum (FCS) GIBCO
Cat. No.: 10270-106 Lot. No.: 40G2186K
Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml; 100 µg/ml) BIOCHROM
Ascorbinsäure SIGMA
3.4 Knorpelzellkulturmedium BGJb
450 ml BGJb Medium
50 ml FCS (10 % [V/V]), hitzeinaktiviert)
5 ml Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) DMEM
450 ml DMEM
50 ml FCS (10 % [V/V], hitzeinaktiviert)
5 ml Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) 0,025 g Ascorbinsäure
Waymouth
450 ml Waymouth
50 ml FCS (10 % [V/V], hitzeinaktiviert)
5 ml Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) 0,025 g Ascorbinsäure
Material 34
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HAM
450 ml HAM
50 ml FCS (10 % [V/V], hitzeinaktiviert)
5 ml Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) 0,025 g Ascorbinsäure
DMEM/HAM 225 ml DMEM 225 ml HAM
50 ml FCS (10 % [V/V], hitzeinaktiviert)
5 ml Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) 0,025 g Ascorbinsäure
Stoppmedium 450 ml DMEM
100 ml FCS (10% [V/V]), hitzeinadtiviert)
5 ml Penicillin/Streptomycin (100 IE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) Trypsin/EDTA
100 ml Trypsin/EDTA (10-fach) 900 Aqua bidet.
3.5 Antikörper und Seren
Primärantikörper
Mouse anti Pig Collagen Type I (Clone COL-1) SIGMA Mouse anti Rabbit GAPDH (Clone 6C5) ADVANCED
IMMUNO CHEMICAL Mouse anti Pig Vimentin (Clone V9) DAKO CYTOMATION Rabbit anti Human Collagen Type II (Clone R1039) ACRIS
Sekundärantikörper
Donkey anti Rabbit, Peroxidase-linked AMERSHAM BIOSCIENCES
Sheep anti Mouse, HRP-linked AMERSHAM
BIOSCIENCES 3.6 Primer
Collagen I s (5’-AGG AGT TGT TGG ACC ACA GG-3’) ras (5’-TCC CTT CAA TCC ATC CAG AC-3’) Collagen II s (5’-ATC TGG CTT CCA GGG ACT T-3’)
ras (5’-ATA CCA GCA GCT CCC CTC T-3’) GAPDH s (5’-GAT TCC ACC CAT GGC AAT-3’)
ras (5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’) 3.7 Verbrauchsmaterial
Biopsy Punch, 5 mm, 6 mm, 8 mm STIEFEL
Deckgläschen (15 x 15 mm; 24 x 60 mm) MENZEL-GLASER
Einmalkanülen gelb BRAUN Melsung AG
Einmalkanülen grau BRAUN Melsung AG
Einmalspritze 10 ml zweiteilig BRAUN Melsung AG Einmalspritze 20 ml zweiteilig BRAUN Melsung AG Einmalspritze 50 ml mit Kanüle, Perfuser BRAUN Melsung AG Eppendorfreaktionsgefäße Eppendorf Falconröhrchen 15 ml (steril) GREINER Falconröhrchen 50 ml (steril) GREINER Filtrierpapier, 595,5; D=185 mm SCHLEICHER &
SCHUELL Filterpapier, Chromatography Paper 3MM CHR Whatman® WHATMAN
INTERNATIONAL LTD Flaschensterilfilter 0,2 µm, 150 ml NALGENE® BRAND
PRODUCTS
Material 36
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Handschuhe puderfrei (steril) BIOGEL
Kleenextuch zweilagig KIMBERLY-CLARK
Kryoröhrchen Nunc TM NALGE NUNC
Microtest Plate 96-Well NALGE NUNC
Mullkompresse Gazin® 10 x 20 cm 12-fach LOHMANN RAUSCHER NuPage® Bis-Tris-Gel 4-12 % Gradientengel INVITROGEN Objektträger (ca. 76 x 26 mm; geschnitten/Mattrand) MENZEL-GLASER
OP-Abdecktuch 37,5 x 45 cm KLINIDRAPE
OxoPlate 24-Well PRESENS
Petrischale verschiedene Größen BECTON DICKINSON Pipettenspitzen farblos 0,1-10 µl (Typ Eppendorf) ROTH
Pipettenspitzen gelb 10-100 µl (Typ Eppendorf) ROTH Pipettenspitzen blau 100-1000 µl (Typ Eppendorf) ROTH Pumpenschlauch mit Reiter
( für WATSON & MARLOW-Pumpe) Nr. 978.0279.00 LANDGRAF PVDF (Polyvinylidene Difluoride)-Membran BOEHRINGER-
MANNHEIM Silikonschlauch transparent 6 mm x 10m ROTH
Silikonschlauch LANDGRAF
Skalpell mit Griff Figur 21 (steril) FEATHER Spritzenfilter Rotilabo, 0,22 µm, steril ROTH Universalschnellbinder SAPI SELCO®
Untersuchungshandschuhe puderfrei KIMBERLY CLARK Zellkulturflasche Easy Flask 25 cm2 / 75 cm2 / 175 cm2
mit Filterkappen (steril), 24 Well Plates NALGE NUNC
Zellsieb 40 µm (Falcon®-Cellstrainer) BECTON DICKINSON
3.8 Laborgeräte
Eismaschine ZIEGRA
Elektronische Präzisionswaage, MC 210 S SARTORIUS Elektrophoreseapparatur POWER PAC 300 BIO-RAD
ELISA-Reader MR5000 DYNATECH
Entwässerungsautomat TP1020 LEICA
Gefriermikrotom, HM 500 OM MICROM
Gelkammer SUB-Cell GT BIO-RAD
Gelkammer für SDS-Page EI 9001-X Cell II Mini Cell NOVEX
Heizplatte OMNIBLAB JÜRGENS
Heiz-Thermo-Mixer, HTMR-133 HLC
Image Station 440CF KODAK
Laminar Flow, Lamin Air® HB2472 HERAEUS
Magnetrührer JANKE & KUNKEL
Mikroskop, CK 2 OLYMPUS
Mikroskop mit Floureszenzeinrichtung, BX40 OLYMPUS
Mikroskop, Eclipse, TE 300 NICON
Mikrotom 2040 REICHERT JUNG
Mikrowelle MW 4270E HTS
PH-Meter, Microprocessor pH539 WTW
Pumpe, IPC ISMATEC
SDR2 ANALOG 24 channel Sensor Dish Reader PRESENS
Schüttler, IKA-Vibrax-VXR, Typ VX8 JANKE & KUNKEL
Schüttelwasserbad, 1083 GFL
Schwenker, Polymax 1040 HEIDOLPH Elektro KG
Streckwasserbad HI1210 LEICA
Universaldrehvorrichtung (Rollator) HERAEUS
UV-Leuchttisch 28ME HEROLAB
Vortexer, REAX 2000 HEIDOLPH Elektro KG
Vortexer, REAX I HEIDOLPH Elektro KG
Wärmeschrank, Heracell 240 HERAEUS
Wärmeschrank, Cytoperm 2 HERAEUS
Material 38
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Westernbloteinsatz für Gelkammer X Cell II NOVEX
Zählkammer nach Neubauer OMNILAB
Zentrifuge, Megafuge 2.0 R HERAUS
Zentrifuge, Multifuge 3S-R HERAEUS Zentrifuge, Biofuge fresco HERAEUS Microtiterpipetten
Eppendorf Research 0,5-10 µl EPPENDORF Eppendorf Research 10-100 µl EPPENDORF Eppendorf Research 100-1000 µl EPPENDORF
Gilson 100 µl GILSON
Gilson 200 µl GILSON
4 Methodik
4.1 Säule 1: Zellen
4.1.1 Isolation primärer Knorpelzellen
Rezepturen:
Verdaulösung Knorpelzellmedium 200 µl Penicillin/ Streptomycin 50 ml FCS
0,04 g Collagenase Typ II (317 U/mg) ad 500 ml BGJb Medium ad 20 ml BGJb Medium
Stoppmedium PBS
100 FCS 2 PBS Tabletten ad 400 ml Aqua-
5 ml Penicillin/ Streptomycin bidest ad 500 ml BGJb
Transport- und Spüllösung (PBS/PS+N) 5 ml Penicillin/ Streptomycin
50 ml Nebacitin ad 500 ml PBS
Zur Zellgewinnung wurden, so steril wie möglich, Luftröhren-, Ohr- und Rippenknorpel aus einem Schwein entnommen und in PBS/PS+N transportiert. Die weitere Aufarbeitung des Materials erfolgte unter der sterilen Werkbank. Zu Beginn wurde die Adventitia und Mucosa der Trachea abpräpariert und der Rippenknorpel von noch anhaftenden Binde- und Muskelgewebe befreit. Die Lagerung des Ohres erfolgte in Braunol. Zur Zellisolation wurde der Ohrknorpel mit dem Skalpell freigelegt. Die Gewebe wurden nun in einer Petrischale mit dem Skalpell in 1x1 mm große Stückchen zerkleinert. Anschließend wurden die Gewebe bis zu einer Füllhöhe von 10 ml in ein Falcon gegeben und mit 20 ml der Verdaulösung versetzt. Die Verdauungszeiten wurden in den Vorversuchen zur Knorpelzellisolation variiert und lagen in einem Bereich von 5-14 Stunden. Die Inkubationen erfolgten unter ständiger
Methodik 40
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Bewegung im Schüttelwasserbad bei einer Temperatur von 37 °C. Die Collagenase bewirkt ein Herauslösen der Knorpelzellen aus der sie umgebenden extrazellulären Matrix. Nach Ablauf der Verdauungszeit wurde die Suspension der verflüssigten Gewebestückchen durch einen gelben Zellfilter (100 µl) in ein 50 ml Falcon filtriert, um größere Gewebereste zu entfernen. Zum Abstoppen der enzymatischen Aktivität der Collagenase wurde dem Filtrat die doppelte Menge Stoppmedium zugesetzt.
Durch eine anschließende Zentrifugation der Lösung bei 1600 g für 10 min bei 4 °C wurden die Knorpelzellen pelletiert und nach Resuspendierung mit BGJb Medium erneut wie oben zentrifungiert und wieder, je nach Pelletgröße, in 5-10 ml BGJb Medium resuspendiert.
4.1.2 Zellzahlbestimmung
Rezept:
Trypanblau-Lösung 5ml Trypanblau
ad 50 ml PBS
Aus der Zellsuspension wurden 10 µl entnommen und mit 90 µl Trypanblau-Lösung in einem 1,5 ml Eppendorfhütchen verdünnt. Das Trypanblau dringt über die geschädigte Zellmembran nicht vitaler Zellen ein und färbt diese blau an. Aus der Verdünnung wurden 10 µl unter das fixierte Deckgläschen der Neubauer- Zählkammer gegeben. Bei der 100-fachen Vergrößerung wurde der Anteil vitaler Zellen bestimmt und je nach Versuchsansatz in der gewünschten Menge Medium aufgenommen. Hierbei wurden 4 große Eckquadrate der Neubauer-Zählkammer ausgezählt.
Berechnung der Gesamtzellzahl in 1 ml:
Die Kantenlänge eines großen Eckquadrates beträgt 1 mm und der Abstand zwischen Neubauerkammer und Deckgläschen ist 0,1 mm.
Volumen: 0,1 mm x 1 mm2= 0,1 mm3= 0,1 µl 1 dm3= 1 l
1 cm3= 1 ml 1 mm3= 1 µl
Für 1 ml Zellsuspension gilt: 1 ml/0,1 µl= 10 000 Verdünnungsfaktor: 1/10
Anzahl der ausgezählten Quadrate : 4
Zellzahl für 1 ml= (Zellzahl/4) x Verdünnungsfaktor x 10 000 4.2 Säule 2: Matrices
Als Besiedlungsgrundlage für die porcinen Knorpelzellen wurde azelluläres procines Jejunum in Form der Small Intestinal Submucosa (SIS) und der flüssigen Matrix benutzt.
4.2.1 Herstellung der Small Intestinal Submucosa (SIS)
Der in dieser Arbeit angewendete Azellularisierungsprozess stützt sich auf Vorarbeiten der Arbeitsgruppe Mertsching. Es wurde eine modifizierte Dezellularisierung nach Meezan durchgeführt. Diese Dezellularisierungsmethode beruht auf einer Inkubation des Gewebes in einer Natriumdesoxycholat-Natriumazid- Lösung und wurde erstmalig 1975 von MEEZAN und seinen Mitarbeitern beschrieben.
Sie fand in Variationen bereits Anwendung zur Dezellularisierung von Herzklappen (LAUBE et al. 2001) und Aorten (PARNIGOTTO et al. 2000).
Rezepturen:
Transport- und Spüllösung (PBS/PS+N) AZ-Lösung
5 ml Penicillin/ Streptomycin 20 g Natriumdesoxycholat 50 ml Nebacitin 0,5 g Natriumazid
ad 500 ml PBS ad 500 ml Aqua-bidest
