SDS-Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Westernblot 60

Kulturbedingungen verhält sich die Synthese der ECM-Proteine der Knorpelzellen unterschiedlich. Zur Charakterisierung der einzelnen ECM-Komponenten wurden Faserproteine, wie Kollagen Typ I, II und III sowie zur Kontrolle des Besiedlungserfolges zelluläre Proteine, wie Vimentin und GAPDH untersucht.

Extraktion des Knorpelgewebes

Die Gewebeproben aus dem Vergleich der 2-D und 3-D Kulturverfahren wurden gewogen und bis zur Probenaufarbeitung bei –80 °C eingefroren. Aus den Besiedlungsversuchen des komplexen 3-D Kulturverfahrens wurden Gewebestanzen mit einem Durchmesser von 8 mm entnommen, gewogen und bei –80 °C gelagert.

Als Positiv-Kontrollen dienten aufgearbeitete native Gewebe, die Sehne als Kollagen Typ I Kontrolle und die Rippe als Kollagen Typ II Kontrolle. Für GAPDH und Vimentin wurden Fibroblasten vom Schwein als Kontrollen eingesetzt. Die Kollagen Typ III Kontrolle war ein aufgereinigtes Protein, welches käuflich zu erwerben ist.

Rezept:

Extraktionspuffer 4 M GuCl 50 mM Tris

pH 7,5

Zum Nachweis der ECM-Kollagene ist eine spezielle Probenextraktion nötig (HOEMANN et al. 2002). Zu Beginn wurden die bei –80 °C gelagerten Proben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann mit dem Biopulverisator in feinstes Pulver zerkleinert. Die pulverisierten Proben wurden mit 1 ml Extraktionspuffer versetzt. Das optimale Puffer-Proben-Verhältnis lag bei 20-40 mg Probe zu 1 ml Extraktionspuffer. Das Proben-Puffergemisch wurde bei 4 °C für 30 min geschüttelt.

Anschließend erfolgte eine Zentrifugation mit 15 000 g für 10 min bei 4 °C. In den Überständen befindet sich das gelöste Protein.

Proteinbestimmung nach Bradford

Das Gesamtprotein wurde mit der photometrischen Methode nach Bradford bestimmt und dient als Bezugsgröße der späteren Ergebnisse.

Zur Erstellung einer Standardreihe wurden aus einer 1 mg/ml BSA Stammlösung 2 µl, 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl jeweils in 800 µl H2O Gesamtvolumen verdünnt und dann mit 200 µl Bradford Reagenz versetzt, um nach photometrischer Messung mit den Extinktionswerten eine Standardmesskurve zu erhalten.

Das im Bradfordreagenz enthaltene Coomassie Brilliant Blue bindet im saueren Milieu an die Proteine und bewirkt eine Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm auf 595 nm. Die Absorptionszunahme bei 595 nm ist ein Maß für die Gesamtproteinkonzentration der Lösung.

Aus den Überständen der Extraktionen wurden 50 µl abgenommen und mit 800 µl H2O und 200 µl Bradford Reagenz versetzt. Die Gesamtproteinkonzentration sollte 8 µg nicht überschreiten, damit in einem möglichst genauen Messbereich des Photometers gemessen wird und im linearen Bereich der Eichkurve abgelesen werden kann. Nach Zugabe des Bradford Reagenz musste jede Probe sofort

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gevortext werden. Eine Messung sollte innerhalb der nächsten 30 min bei einer Wellenlänge von 595 nm erfolgen. Anhand der Standardkurve wurde die Proteinkonzentration der Proben bestimmt.

Protein-Fällung

Im Anschluss an die Proteinbestimmung erfolgte eine Fällung der Proteine.

Rechnerisch wurde die Menge an Extraktionsvolumen bestimmt, der 25 µg Protein entsprachen. Durch die Zugabe des 5-fachen Volumens an 100 %igem Ethanol wurden die Proben über Nacht bei –20 °C gefällt. Anschließend wurde mit 3300 rpm für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Danach erfolgte eine erneute Aufnahme des Pellets in 75 %igem Ethanol mit einer anschließenden Zentrifugation für 10 min bei 13 000 rpm und 4 °C. Der Überstand wurde verworfen und das proteinhaltige Pellet luftgetrocknet, in 25 µl 8 M Harnstoff aufgenommen und bei –20 °C gelagert.

SDS-Page

Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-Page) trennt Moleküle entsprechend ihrem Molekulargewicht in einem Gel unter Einfluss eines elektrischen Feldes auf. Das Gel ist ein Kunstharzgemisch aus Acryl-/Bisacrylamid, welches nach der Polymerisation ein dreidimensionales Netzwerk bildet und durch diese Struktur wie ein Molekularsieb wirkt. Dies bedingt eine schnelle Wanderung kleiner Moleküle und eine langsame Wanderung großer Moleküle. Die Wanderung erfolgt diskontinuierlich, weil das Gel aus einem Sammel- und einem Trenngel besteht. Das Sammelgel ist großporig und hat einen niedrigeren pH-Wert als das Trenngel.

Nachdem Spannung angelegt ist, wandern im Sammelgel Chloridionen aus dem Elektrophoresepuffer als Leitionen vorweg, gefolgt von den Probeproteinen und Glycinionen. An der Grenze zum Trenngel werden die Glycinionen durch den höheren pH-Wert und die größere Spannung umgeladen und überholen die Probenproteine, wodurch diese konzentriert werden. Dies bewirkt eine schärfere Bandentrennung im Trenngel.

Rezept:

Elektrophoresepuffer (20-fach) 104,6 g MOPS

60,6 g Tris-Base 10 g SDS 3 g EDTA

ad 500 ml Aqua-bidest, pH 7,7

Die Proben wurden vor dem Auftragen bei 70 °C mit LDS (Lithium-Dodecyl-Sulfat) denaturiert, um die sekundäre und tertiäre Struktur der Proteine zu entfalten und eine Auftrennung ausschließlich nach Größe und nicht nach Ladung zu gewährleisten.

Parallel zu den Propenproteinen wurde auch ein Größenmarker aufgetragen, an dem sich die Größe der aufgetrennten Proteine bestimmen lässt.

Zur Vorbereitung der Elektrophorese wurde zunächst die Probenverdünnung ausgerechnet. Das Harnstoff-Aliquot, dessen Proteinkonzentration pro µl bekannt war, wurde mit LDS Sample Buffer (4-fach konzentriert), Reducing Agent (10-fach konzentriert) und H2O verdünnt. Dabei wurden 10 µg Protein in max. 20 µl Volumen aufgenommen. Anschließend erfolgte ein Denaturierungsschritt bei 70 °C über 10 min. Die Gelkammer wurde zusammengebaut, das Gel eingesetzt, der Gel-Kamm entfernt und die vorhandenen Taschen sowie die Kammer mit NuPaAGE^® MOPS SDS Elektrophoresepuffer (1-fach) gespült und gefüllt. Danach wurden die Proben und der Größenmarker aufgetragen, die Elektroden an die Kammer angeschlossen und die Elektrophorese bei 200 Volt gestartet. Beendet wurde sie nach ca. 1 Stunde, wenn die Bromphenolblaufront den unteren Rand des Gels erreicht hatte.

Westernblot

Im Westernblot werden die Proteinbanden des Gels mittels Elektrophorese auf eine PVDF Membran übertragen. Die Proteine wandern in einem elektrischen Feld von der Kathode zur Anode und bleiben auf ihrem Weg an der PVDF-Membran haften, da diese eine hohe Affinität für Proteine aufweist. Die Detektierung und Visualisierung der Proteine auf der PVDF Membran erfolgt später über spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen.

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Rezepturen:

Blotpuffer (10-fach) PBST

60 g Tris 100 ml PBS 10-fach

30 g Glycin 1 g Tween

ad 1000 ml Aqua-bidest 10 g Magermilchpulver

ad 1000 ml Aqua-bidest

Blotpuffer (gebrauchsfertig) 50 ml Blotpuffer 10-fach 100 ml Methanol

350 ml Aqua-bidest

kurz vor Gebrauch 200 ml Methanol zusetzen

Die Faserplatten der Westernblotapparatur und die Schwämmchen wurden einige Minuten in Blotpuffer eingelegt, um die Luft aus den Poren zu entfernen. Das Gel der SDS-Page und auf die gleiche Größe zugeschnittenes Filterpapier wurden ebenfalls mit Blotpuffer gespült. Die PVDF-Membran wurde zugeschnitten und das „Sandwich“

wie in folgender Reihenfolge dargestellt zusammengesetzt:

Abb. 14: Aufbau der Blotkammer

Die PVDF-Membran wurde kurz vor Gebrauch 30 sek. in Methanol eingelegt. Jede Schicht des Sandwichs wurde vor dem Zusammensetzen mit 3-5 ml Blotpuffer benetzt. Nach dem Auflegen des letzten Filterpapiers ist es wichtig die Luftblasen zu entfernen. Zum Blotten wurde die Blot-Kassette in die Gelelektrophoresekammer eingesetzt, es ist darauf zu achten, dass die graue Seite der Kassette zur Kathode zeigt. Das Blotten erfolgte bei 30 Volt konstanter Spannung für 90 min. Nach Ablauf der Elektrophorese wurde das Sandwich auseinandergebaut die Membran mit PBST gespült und 2 Stunden in PBST mit 5 % Magermilchpulveranteil bei Raumtemperatur inkubiert. Die im Milchpulver enthaltenen Proteine lagern sich an die noch freien Bindungsstellen der Membranoberfläche und verhindern so später unspezifische Antikörperreaktionen.

Antiköpervermittelte Chemiluminescenz

Die auf die PVDF-Membran übertragenen Proteinbanden wurden zur Identifizierung mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Ein gegen das nachzuweisende Antigen gerichteter Primärantikörper bindet an das Protein auf der PVDF-Membran.

Ein spezifisch gegen den Primärantikörper gerichteter Sekundärantikörper bildet mit dem Primärantikörper einen Komplex. Da der Sekundärantikörper mit dem Enzym Peroxidase gekoppelt ist, welches ein angebotenes Substrat umsetzt und eine Chemiluminescenz-Reaktion katalysiert, lassen sich die Proteinbanden auf einem Fotofilm sichtbar machen.

Die Membranen wurden in einer Plastikschale mit PBST 3 mal für 10 min geschwenkt, um ungebundene Milchpulverreste zu beseitigen. Darauf folgend wurde der Primärantikörper abhängig von der Herstellerempfehlung und eigenen Tests mit PBST verdünnt, die Membran mit 6-8 ml der Verdünnung in Plastikfolie eingeschweißt und über Nacht bei 4 °C geschwenkt. Nach der Inkubation erfolgten 2 Spülschritte mit PBST mit je drei aufeinanderfolgenden Einwirkzeiten von 10 min in PBST. Zur Sekundärantikörperreaktion wurde selbiger optimal mit PBST verdünnt und die Membran in einer Schale in 10 ml der Verdünnung für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C geschwenkt. Danach erfolgte wieder ein Waschschritt in PBST. Zur Visualisierung der Antigen-Antikörperkomplexe wurde die

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Membran 1 min in Western Blotting Detection Reagenz, einem Gemisch aus Detektionslösung 1 und Detektionslösung 2, im Verhältnis 1:1 inkubiert.

Die an den Sekundärantikörper gekoppelte Peroxidase katalysiert bei diesem Substrat die Chemiluminescenz-Reaktion, so dass die unterschiedliche Chemiluminescenzintensität der Proteinbanden digital mit der Image Station von KODAK erfasst werden konnten. Die Auswertungen erfolgten semiquantitativ, dass heisst, die Intensitäten der Proteinbanden wurden untereinander in Verhältnis gesetzt.