Die Resultate der drei Hauptversuche belegen die in-vitro Kultivierbarkeit von primären, adulten Chondrozyten unter den vorgestellten dreidimensionalen Kulturbedingungen. In den Histologien der generierten Ersatzgewebe konnten knorpelspezifische Merkmale wie Knorpelmatrix, Knorpellagunen und isogene
Diskussion 126
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Zellgruppen nachgewiesen werden. Die im ersten und zweiten Experiment verwendete neuartige flüssige Matrix eignet sich als Besiedlungsgrundlage für die Chondrozyten und stellt eine dreidimensionale formbare Matrix dar, die sich im Laufe der Kultivierung verfestigt. Das letzte Experiment zum komplexen 3-D Kultursystem belegte die Besiedelbarkeit größerer tubulärer Matrices.
In allen drei Experimenten konnte anhand der durchgeführten Nachweismethoden keine ausgeprägte Dedifferenzierung der Zellen, wie sie unter 2-D Monolayer Kulturbedingungen auftritt, festgestellt werden. Dennoch war die Stabilität der generierten Gewebe noch nicht ausreichend, um einen langstreckigen flexiblen Luftröhrenersatz, wie z. B. die BioVam®, während der In- und Exspiration zu stabilisieren. Die mangelnde mechanische Belastbarkeit ist auf die ungenügende biochemische Zusammensetzung des Knorpels zurückzuführen. Die in-vitro Nachahmung knorpelphysiologischer Bedingungen durch die Applikation von mechanischem Stress, den zellulären Kontakt zu ECM-Bestandteilen und dem Angebot von speziellen Wachstumsfaktoren, wie z. B. BMP-2 (NAWATA et. al 2005), könnten zu einer Verbesserung der ECM Zusammensetzung führen. Dies hätte aufwendige Modifikationen im Bereich der Bioreaktortechnologie zur Folge, die mit größeren finanziellen Investitionen verbunden wäre. Es bleibt offen, ob die so generierten Gewebe eine ausreichende Festigkeit erlangen würden.
Parallel könnte deshalb über kostengünstigere Konzeptänderungen nachgedacht werden. So besteht z. B. die Möglichkeit festere synthetische oder biologische Prothesen in Spangenform zu kaufen und diese als Besiedlungsgrundlage für autologe Chondrozyten zu benutzten, oder alternativ das Problem mit einem chirurgischen Ansatz zu lösen. Aufgrund der nicht vorhandenen Durchblutung von Knorpel ist das Gewebe weniger immunogen. Aus diesem Grund wird momentan über die Verwendung von allogenen oder xenogen, kryokonservierten Knorpelspangen zur Stabilisierung einer flexiblen Luftrörhenprothese nachgedacht.
Unter Verwendung spezieller Einfrierprogramme werden die Gewebeschäden, die durch den Einfrierprozess entstehen können, so gering wie möglich gehalten.
7 Zusammenfassung
Bettina Giere
Experimentelle Untersuchungen zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea
Zielsetzung dieser Arbeit war es, mit den Methoden des Tissue Engineering in-vitro Knorpelzellkulturverfahren zur Herstellung einer bioartifiziellen Trachea zu entwickeln. Die Kultivierung primärer Chondrozyten in einer dreidimensionalen biologischen Matrix, idealer weise in Spangenform, sollte der Stabilisierung einer flexiblen Luftröhrenprothese dienen.
Zur Standardisierung der Zellgewinnung, -isolation und -kultivierung von primären adulten Knorpelzellen wurden folgende Vorversuche durchgeführt:
1. Die Effektivität der Zellisolation wurde anhand verschiedener enzymatischer Verdauungszeiten (5h, 8h und 14h) des nativen Knorpelgewebes optimiert.
2. Eine Auswahl der geeigneten Zellquelle wurde über die Darstellung der Stoffwechselaktivität der verschiedenen Knorpelzelltypen (Ohr, Rippe und Trachea) in der 2-D Kultur getroffen.
3. Die als Besiedlungsgrundlage für die Knorpelzellen vorgesehene flüssige Matrix wurde in Besiedlungsversuchen auf ihre Zellverträglichkeit durch die Überprüfung der Zellvitalität getestet.
4. In drei enzymatische Herstellungsverfahren zur Gewinnung der flüssigen Matrix wurden Enzyme und Enzymkonzentrationen variiert und in Besiedlungsexperimenten über 4 Wochen und in Stoffwechselanalysen getestet.
5. Die ideale Besiedlungsdichte für das folgende 1. Hauptexperiment in 3-D Kulturen, bestehend aus Knorpelzellen und flüssiger Matrix, wurde über Stoffwechselaktivität ermittelt.
Zusammenfassung 128
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In drei Hauptexperimenten wurden Verfahren zur dreidimensionalen Knorpelzellkultivierung getestet.
1. Experiment: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren
Vergleichend zur Beobachtung des Dedifferenzierungsverhaltens der Zellen in der flüssigen Matrix und zur Eignung der flüssigen Matrix als 3-D Kultur wurden Knorpelzellen mit und ohne flüssige Matrix über 4 Wochen unter den gleichen Versuchsbedingungen kultiviert. Im wöchentlichen Abstand wurden die Gewebe auf ihre Stoffwechselaktivität, die Glucosaminoglykanproduktion, die Kollagenproduktion und den histologischen Aufbau untersucht. Die flüssige Matrix hätte den Vorteil der freien Formgestaltung und somit wäre eine Nachahmung der Spangenform möglich.
2. Experiment: Einfaches 3-D Kulturverfahren
In den dazu parallel durchgeführten Versuchen zur einfachen 3-D Kultur wurde die Übertragbarkeit der flüssigen Matrix in ein anderes Kultursystem getestet. Es wurden zwei Besiedlungstechniken variiert, die Sandwich- und die Injektions-Besiedlungstechnik. Bei der Sandwichbesiedlung wurde ein Gemisch aus Zellen und flüssiger Matrix zwischen zwei Lagen azellularisiertem Darm (SIS) eingeschlossen und bei der Injektionsbesiedlung wurde das Gemisch zwischen die Lagen einer azellularisiertem Darmwand injiziert. Diese Systeme ermöglichen nach erfolgreicher Besiedlung ein Herausschneiden von Knorpelspangen. Die generierten Gewebe wurden auf Zellvitalität, Stoffwechselaktivität und auf ihre histologische Zusammensetzung hin untersucht.
3. Experiment: Komplexes 3-D Kulturverfahren
In der letzten Experimentserie, dem komplexen 3-D Kulturverfahren, wurden Knorpelzellen direkt auf eine tubuläre flexible Matrix aus azellulärem porcinem Darm (SIS) aufgebracht, um diese im Laufe der Kultivierung zu verfestigen. Die Kultivierung wurde 3 Wochen in einem Bioreaktorsystem mit luminaler Mediumperfusion durchgeführt. Anschließend wurde das generierte Gewebe aufgearbeitet und auf Zellvitalität, Stoffwechselaktivität, Glucosaminoglykan-produktion, Kollagenproduktion und histologische Zusammensetzung hin untersucht.
Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:
Vorversuche
1. Am effektivsten war die Ausbeute vitaler Chondrozyten nach einer 8-stündigen enzymatischen Verdauung des nativen Knorpelgewebes mit 0,2 %iger Kollagenase vom Typ II.
2. In der Stoffwechselaktivität der drei Knorpelzellquellen (Ohr, Rippe und Trachea) konnten keine wesentlichen Unterschiede ermittelt werden. Aufgrund des hohen Kontaminationspotenzials der Zellkulturen durch die Verwendung von Ohrknorpelgewebe wurden die überwiegende Anzahl der Versuche mit Rippenknorpelzellen vorgenommen.
3. In Besiedlungsversuchen der flüssigen Matrix mit Chondrozyten konnte im LIVE/DEAD Viability Assay Kit qualitativ die Vitalität der Zellen belegt werden.
4. Bei der Kultivierung der Chondrozyten in der flüssigen Matrix aus den 3 verschiedenen Herstellungsansätzen, zeigten die Kulturen des Ansatzes unter Verwendung der 0,1 %igen Kollagenase vom Typ II die höchste Stoffwechselaktivität. Dies bezieht sich sowohl auf die Sauerstoffmessung als auch auf den Cell Proliferation Assay. Die Glucosaminoglykanproduktion lag signifikant über dem der anderen beiden Herstellungsansätze (p<0,005).
5. Im Stoffwechselaktivitätstest konnte bei einer Besiedlungsdichte von 500 000 Zellen/cm2 die effektivste metabolische Aktivität ermittelt werden.
Zusammenfassung 130
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Hauptexperimente
1. Experiment: Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren
Das Gewebe der 2-D und 3-D Kulturen war ab dem 14. Kulturtag fest und mit einer Pinzette herausnehmbar. In der Mikroskopie konnte eine runde Zellmorphologie der Chondrozyten in der 2-D und in der 3-D Kultur über 4 Wochen belegt werden. Der Verlauf der Stoffwechselaktivität war in der 2-D Kultur gleich dem Verlauf der 3-D Kultur, doch die Höhe der metabolischen Aktivität lag in der 3-D Kultur unter der der 2-D Kultur (p<0,005). Die Glucosaminoglykansynthese lag in der 3-D Kultur signifikant über der der 2-D Kultur (p=0,002). Im Westernblot konnte für die 2-D und die 3-D Kultur kein Kollagen vom Typ I und III nachgewiesen werden, doch wurde Kollagen vom Typ II nachgewiesen. Mit der PCR war bis zum Tag 7 der Kultivierung eine Kollagen Typ I und II Produktion nachweisbar. Die Auswertung der histologischen Übersichtsfärbungen zeigten knorpelähnliches Gewebe und die Spezialfärbung eine beginnende Mineralisation der ECM.
2. Experiment: Einfaches 3-D Kulturverfahren
Unter Verwendung der Injektions-Besiedlungstechnik gelangen keine erfolgreichen Besiedlungen. Bei der Sandwich-Besiedlungstechnik kam es zu zwei gelungenen Besiedlungen, die sich nicht reproduzieren ließen. In den Besiedlungen hatte sich das Gewebe makroskopisch verfestigt und histologisch konnte knorpelähnliches Gewebe nachgewiesen werden. Die Zellen waren über einen Zeitraum von 6,5 Wochen vital und zeigten mikroskopisch eine runde Zellmorphologie. In der Pentachromfärbung gab es Hinweise auf eine beginnende Mineralisation.
3. Experiment: Komplexes 3-D Kulturverfahren
Nach dreiwöchiger Kultivierung der Chondrozyten auf der tubulären Matrix war makroskopisch eine ECM Synthese sichtbar, eine Verfestigung der Matrix hatte nicht stattgefunden. Die Zellen zeigten eine deutliche Vitalität im Lebend-Tod-Test. Im MTT-Test konnte die Stoffwechselaktivität der Zellen belegt werden, die mit der Glucosaminoglykanproduktion korrelierte. Im Westernblot war keine Kollagen Typ I und III Produktion nachweisbar. Eine Kollagen Typ II Produktion war nur in 2 Bioreaktoren vorhanden.
Mit Hilfe der Ergebnisse aus den Vorversuchen wurde die Knorpelzellgewinnung optimiert, das Herstellungsverfahren zur flüssigen Matrix verbessert und die Versuchsbedingungen für weitere Experimente festgelegt. Mit der Entwicklung der neuartigen, flüssigen Matrix gelang die Etablierung einer 3-D Knorpelzellkultur, die mit den durchgeführten Nachweismethoden keinen Hinweis auf eine ausgeprägte Dedifferenzierung der Zellen ergab.
In der zweiten Versuchsserie zur 3-D Kultivierung im einfachen 3-D Kultursystem konnten zwar Chondrozyten kultiviert werden, aber die Ergebnisse waren nicht reproduzierbar.
Das letzte Experiment zum komplexen 3-D Kulturverfahren im Bioreaktorsystem belegte die Besiedelbarkeit größerer tubulärer Matrices. In allen drei Experimenten war die Stabilität der gezüchteten Knorpelgewebe noch nicht ausreichend, um eine flexible Luftröhrenprothese, wie z. B. die BioVam®, bei der Ex- und Inspiration zu stützen. Es ist noch viel Optimierungsarbeit im Bereich der Bioreaktortechnologie notwendig, um den Zellen eine ihrer physiologischen Umgebung angepasste Atmosphäre zu bieten und so, ein dem nativen Knorpel ähnliches Ersatzgewebe mit ausreichender mechanischer Belastbarkeit zu erhalten.
Mit dieser Arbeit werden erste Schritte zur Entwicklung eines trachealen Organersatzes mit den Methoden des Tissue Engineering für die klinische Anwendung aufgezeigt.
Summary 132
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8 Summary
Bettina Giere
Experimental generation of a bioartificial trachea
The goal of this project was to develop chondrocyte culture techniques for tissue engineering of a bioartificial trachea. The cultivation of primary chondrocytes on a three dimensional biological matrix in brooch shape should stabilise a flexible, tubular tracheal graft.
For the standardisation of cell-harvesting and –cultivation of adult chondrocytes the following pilot studies were performed:
1. Cell isolation was optimized by using different enzymatical digestion times (5h, 8h and 14h) of native tissue.
2. Metabolic characterisation of different chondrocytes sub-types (ear, rip, trachea) cultured in a 2-D culture system was used to determine the adequate cell source.
3. The cell compatibility of the liquid matrix and the applicability as a seeding ground for chondrocytes was checked in culture experiments and LIVE/DEAD vitality assay.
4. Three different production techniques for the generation of liquid matrix by using varying enzymes and there concentrations were determined in culture experiments over 4 weeks by analysing cellular metabolism.
5. The ideal seeding density for the first main experiment was defined by cell metabolism tests in 3-D cultures consisting of chondrocytes and liquid matrix.
In three main experiments three-dimensional chondrocyte culture techniques were tested:
1. Experiment: Comparison of 2-D and 3-D culture techniques
To study the dedifferentiation behaviour of chondrocytes in the liquid matrix and the capability of this matrix to function as a three-dimensional culture system, the cells were cultured with and without liquid matrix over 4 weeks. The tissue was checked weekly for metabolism, glucosamnioglycane production, collagen production and histological formation. The advantage of the liquid matrix is its enabling of reproduction of a brooch.
2. Experiment: Simple 3-D culture technique
The transferability of the liquid matrix into a different culture system was examined.
Two seeding techniques were varied, the sandwich- and the injection-seeding technique. In the sandwich-seeding a mixture of cells and liquid matrix was cultivated between two layers of acellular small bowl-segments (SIS). In the injection-seeding the cell-matrix-suspension was injected into acellular small bowl-wall. Both culture systems allow to cut out cartilage brooches after a successful seeding procedure. In the generated tissue cell vitality, cell metabolism and histological composition were determined.
3. Experiment: Complex 3-D culture technique
Chondrocytes were seeded directly on a flexible tubular matrix generated from acellular porcine small bowl to increase matrix stability over time. Cultivation lasted three weeks in a bioreactor system with luminal medium perfusion. The tissue was characterized by cell vitality tests, cell metabolism tests, glucosaminoglycan assay, collagen verifications and histology.
Summary 134
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The following results were obtained:
Pilot studies
1. The most effective cell yield of vital chondrocytes was obtained after an 8 hour digestion of native cartilage with 0,2 % collagenase of type II.
2. There was no intrinsic difference between the metabolic activity of the three tested chondrocytes sub-types (ear, rip, trachea). Because of the contamination potential of ear tissue most experiments were continued with rip cartilage
3. The LIVE/DEAD viability assay proved the cell vitality cultured in liquid matrix qualitatively.
4. In the culturing experiments chondrocytes cultured in liquid matrix processed with 0,1 % Collagenase type II showed the highest metabolic cell activity in the O2-measurement and in the MTT-test and a significant higher glucosaminolglycan syntheses (p<0,005).
5. In the cell proliferation assay the most effective cellular metabolism activity was reached at a cell density of 500 000 cells/ cm2.
Main experiments
1. Experiment: Comparison of 2-D and 3-D culture techniques
The mechanical stability of tissue from 2-D and 3-D cultures increased over time and facilitated handling with forceps after the 14th culture day. The transmitted light microscopy showed a round cell shape over 4 weeks. The course of the cell metabolism was the same in both culture techniques but the metabolism was lower in the 3-D culture (p<0,005). The glucosaminoglycane production for the 3-D culture system was significantly higher (p=0,02). The Westernblots did not show collagen type I and collagen type III, but collagen type II. The PCR results showed a collagen
type I and II expression on the 7th day. Histological staining confirmed the generation of cartilage-like tissue with mineralization starting to occur.
2. Experiment: Simple 3-D culture technique
Injection seeding technique resulted in no successful seeding. The sandwich seeding technique lead to two successful experiments, but they were not reproducible. The tissue stability was increased macroscopically. Cartilage-like tissue was seen histologically with starting to occur mineralization. The cells were vital over a period of 6,5 weeks and a round cell morphology was proven microscopically.
3. Experiment: Complexe 3-D culture technique
ECM synthesis was apparent on the tubular matrix after three weeks of cultivation, but there was no increase in tissue stability. The cells were viable. The cellular metabolism correlated with a high glucosamnioglycane-production. In the Westernblot there was no evidence for a collagen type I and III production. An inconstant collagen type II synthesis was documented in this experiments.
The pilot studies served to optimize chondrocyte isolation, liquid matrix generation and additional experimental conditions. The development of the liquid matrix enabled the establishment of a three dimensional cell culture system. There was no evidence of a marked chondrocyte dedifferentiation cultured in the liquid matrix using the applied detection methods. The simple 3-D culture technique generated a cartilage-like tissue which was not reproducible in further studies. In the last experiment chondrocytes could be seeded directly on greater tubular matrix. The stiffness of the produced cartilage was not satisfactory enough to stabilize a flexible tracheal graft in all three experiments. Improvement of the bioreactor technology is necessary to afford the a physiological cell environment resulting in a tissue substitution with an adequate mechanical capacity.
This work represents the first steps towards the development of tissue engineered tracheal substitutes for clinical application.
Literaturverzeichnis 136
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9 Literaturverzeichnis
ALTMAN, G., R. HORAN, L. MARTIN, J. FARHADI, P. R. STARK, V. VOLLOCH, J. RICHMOND (2002):
Cell differentaiation by mechanical stress
The FASEB Journal express article. 16(2), 270-2 BADYLAK, S., S. MEURLING, M. CHEN (2000):
Resorbable bioscaffold for esophageal repair in a dog model J Pediatr Surg. 35(7), 1097-103
BAILEY, B., J. KOSOY (1970):
Observations in the development of tracheal posthesis and tracheal transplantation Laryngoscope. 80, 1553-1565
BALDERMAN, C., G. WEINBLATT (1987):
Tracheal autograft revascularization J Thorac Cardiovasc Surg. 94, 434-441
BEALL, A., O. HARRINGTON, D. GREENBERG , G. MORRIS (1962):
Tracheal replacement with heavy Marlex mesh Arch Surg. 84, 390-396
BEHONICK, D., W. ZENA (2003):
A bit of give and take: the relationship between the extracellular matrix and the developing chondrocytes
Mechanisms of Development. 120, 1327-1336 BELSEY, R. (1950):
Resection and reconstruction of the intrathoracic trachea Br J Surg. 38, 200-5
BLANDER, D. S., P. E. ZIMMERN (2000):
Cadaverc fascia lata sling: analysis of five recent adverse outcomes Urology. 56(4), 596-9
BORRIE, J., N. REDSHAW, T. DOBBINSON (1973):
Silastic tracheal bifurcation prothesis with subterminal Dacron suture cuffs J Thorac Cardiovasc Surg. 65, 956-62
BRUNS, J., J. STEINHAGEN (2000):
Der Knorpelschaden als präarthrotische Deformation- Biologische Grundlagen Deutsche Zeitschrift für Sportmedizin, 51(2), 42-47
BUCHER, M., G. ROSEMOND, BURNETT (1951):
Experimental reconstruction of tracheal and bronchial defedts with stainless steel wire mesh
J Thorac Surg. 21, 572-583
BUDDS, J. S., P. R. BELL, R. F. JAMES (1989):
Attachment of indium-111 labelled endothelial cells to pretreated polytetrafluoroethylene vascular grafts
Br J Surg. 76(12), 1259-61
CHEN, C., A. LUMSDEN, J. OFENLOCH (1997):
Phosphorylcholine coating of ePTFE grafts rdeuces neointimal hyperplasia in canine model
Ann Vasc Surg. 11, 74
CHUBINSKAYA, S., K. HUCH, M. SCHULZE, L. OTTEN, M. AYDELOTTE, A.
COLE (2001):
Gene Expression by human Articular Chondrocytes Cultured in Alginate Beads The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49(10),1211-1219
CONLEY, J. (1953):
Reconstruction of the subglottic air passage Ann Otol Rhinol Laryngol. 62, 477-495
CRAIG, R., W. HOLMES, E. SHABART (1953):
Tracheal resection and replacemaent with a prosthesis J Thorac Surg. 25, 384-396
CULL, D., E. LALLY, A. MAIR (1990):
Tracheal reconstruction with polytetrafluoroethylene graft in dogs Ann Thorac Surg. 50, 899-901
DANIEL, R. A., (1948):
The regeneration of defects of the trachea and bronchi. An experimental study J Thorac Surg. 17,335-49
DEMOS, N., H. MITNICK, MCCALLY (1973):
Tracheal regeneration in long-term survivors with silicone prosthesis Ann Thorac Surg. 16, 293-300
DESHMUKH, K., W. G. KLINE (1976):
Charcterization of collagen and its precursors synthesized rabbit-articular-cartilage cells in various culture systems
Eur J Biochem. 69, 117-123
DESHPANDE, R., E. HEINZLE (2004):
On-line oxygen uptake rate and culture viability measurement of animal cell culture using microplates with integrated oxygen sensors
Biotechnology Letters. 26, 763-767 DOWING, LOWDEN (1955):
Ermittlung der Sauerstoffsättigung in Abhängigkeit von der Temperatur bei einem Gesamtdruck der wasserdampfgesättigten Atmosphäre von 760 Torr nach Truesdale J. Appl. Chem. 5, 53
Literaturverzeichnis 138
_____________________________________________________________________________________________________
GIGANT- HUSELSTEIN, C., P. HUBERT, D. DUMAS, E. DELLACHERIE, P.
NETTER, E. PAYAN, J. F. STOLTZ (2004):
Expression of adhesion molecules and collagen on rat chondrocytes seeded into alginate and hyaluronate based 3D biosystems. Influence of mechanical stresses.
Biorheology. 41(3-4), 423-31 GLÜCK, T., A. ZELLER (1881):
Die prophylaktische Resektion der Trachea Arch Klin Chir. 26, 427-36
GOESSLER, U. R., K. HÖRMANN, F. RIEDEL (2004):
Tissue engineering with chondrocytes and function of the extracellular matrix Int J Mol Med.13(4), 505-13
GOUPING, C., S. TAKASHI, U. TAKASHI, H. REI, T. TETSUYA (2003):
Redifferentiation of dedifferentiated bovine chondrocytes when cultured in vitro in a PLAGA-collagen hybrid mesh
FEBS Lett. 542(1-3), 95-9
GREENBERG, D., R. WILLMS (1962):
Tracheal postheses. An experimental study in dogs Arch Otolaryngol. 75, 335-341
GRAU HENRYC (1825-1861):
Anatomie des menschlichen Körpers GRILLO, H. (2003A):
Development of Tracheal Surgery : A Historical Review. Part 1: Techniques of Tracheal Surgery
Ann Thorac Surg. 75, 610-9 GRILLO, H. (2003B):
Development of Tracheal Surgery : A Historical Review. Part 2: Treatment of Tracheal Diseases
Ann Thorac Surg. 75,1039-47 GRILLO, H. (2003C):
Tracheal replacement
J Thorac Cardiovasc Surg. 125(4), 975 GRILLO, H. (2002):
Tracheal Replacement : A Critical Review Ann Thorac Surg. 73,1995-2004
GRILLO, H. (1989):
Notes on the windpipe Ann Thorac Surg. 47, 9-26
GRILLO, H. (1970):
Surgery of the trachea
Curr Probl Surg. 1970 Jul, 3-59 GRILLO, H. (1965):
Circumferential resection and reconstruction of the mediastinal and cervical trachea Ann Surg. 162, 374-88
GRILLO, H., E. DIGNAN, T. MIURA (1964a):
Estensive resection and reconstruction of mediastinal trachea without prosthesis or graft: an anatomical study in man
J Thorac Cardiovasc Surg. 48, 741-9 GRILLO, H., C. MCKHANN (1964b):
The acceptance and evolution of dermal homografts freed of viable cells Transplantation. 2, 48-59
GROVES, P. (1997):
Use of Polyvinyl Alcohol to stabilize binding of sulfated Glucosamionglycans to Dimethylmethylene Blue
Analytical Biochemistry. 245, 247-248
GRUNDMANN, K., B. ZIMMERMANN, H. J. BARRACH, H. J. MERKER (1980):
Behaviour of epihyseal mouse chondrocyte populations in monolayer culture Morphological an immunohistochemical studies
Virchows Arch A Pathol Anat Histol. 389(2), 167-87 HODDE, J. (2002):
Naturally Occurring Scaffolds for Soft Tissue Repair and Regeneration Tissue Engineering. 8(2), 295-308
HOEMANN, C., J. SUN, V. CHRZANOWSKI, D. BUSCHMANN (2002):
A Multivalent Assay to Detect Glycosaminoglycan, Protein, Collagen, RNA, and DNA Content in Milligram Samples of Cartilage or Hydrogel-Based Repair Cartilage
Analytical Biochemestry. 300, 1-10
HUCH, K., J. STÖVE, W. PUHL, K. GÜNTHER (2002)
Vergleichender Überblick über Verfahren zur Kultivierung artikulärer Chondrozyten Review and comparison of culture-techniques for articular chondrocytes
Z Orthop. 140, 145-152
HUTTER, B., G. JOHN (2004):
Evaluation of OxoPlate for Real-Time Assessment of Antibacterial Activities Current Microbiology. 48, 57-61
Literaturverzeichnis 140
_____________________________________________________________________________________________________
ISNER, J., A. PIECZEK, R. SCHAINFELD, R. BLAIR, L. HALEY, T. ASAHARA, K.
ROSENFIELD, S. RAZVI, K. WALSH, J. SYMES (1996):
Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischaemic limb
The Lancet. 348, 370-374
JACKSON, T. L., E. J. O’BRIEN, W. TUTTLE W, J. MEYER (1950):
The experimental use of homogenous tracheal transplants in the restoration of continuity of the tracheobronchial tree
J Thorac Surg. 20, 589-612 JACOBS, J. (1988):
Investigations into tracheal prosthetic reconstruction Laryngoscope. 98, 1239-1245
JOHN, G., I. KLIMANT, C. WITTMANN, E. HEINZLE (2003):
Integrated Optical Sensing of Dissolved Oxygen in Microtiter Plates: A Novel Tool for Microbial Cultivation
Biotechnology and Bioengineering. 81(7), 829-36 JÜLICH (2005):
www.i-s-b-org/fokus/tissue/te.htm KAY, E. (1951):
Tracheal resection and primary anastomosis Ann Otol Rhinol Laryngol. 60, 864-870
KESHISHIAN, J., B. BLADES, E. BEATTIE (1956):
Tracheal reconstruction J Thorac Surg. 32, 707-27
KIM, B.-S., BAEZ C. E., ATALA A. (2000):
Biomaterials for tissue engineering World j Urol. 18, 2-9
KIM, J., S. TSENG (1995):
Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas
Cornea. 14(5), 473-84
KOJI, K., L. BONASSAR, A. ROY, H. MIZUNO, C. JOAQUIN, C. VACANTI (2003):
A composite tissue-engineered trachea using sheep nasal chondrocyte and epithelial
A composite tissue-engineered trachea using sheep nasal chondrocyte and epithelial