4.5 N ACHWEISMETHODEN
4.5.7 PCR
Gewinnung der Zellen
Die Gewebe aus dem Vergleich zwischen den 2-D und 3-D Kulturverfahren wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren, dann mit dem Biopulverisator unter Stickstoffkühlung pulverisiert und in 750 µl Trizol aufgenommen. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Proben bei –80 °C gelagert. Das Trizol lysiert die Zellen und inaktiviert zelluläre RNasen.
Isolierung von RNA und DNA
Die Trizol-Proben wurden auf Eis aufgetaut und 10-15 min inkubiert, während dieser Zeit setzt sich die Trizolreaktion fort und die Nukleoproteinkomplexe dissoziieren.
Zum Erreichen einer besseren Lösung und Ausbeute an RNA und DNA wurde den Proben 200 µl Chloroform zugesetzt. Die Phasentrennung erfolgte stehend für 2-15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Suspension wurde dann bei 11 300 U/min für 15 min und 4 °C zentrifugiert. Es kommt zur Ausbildung von drei Phasen, einer unteren rosa Phase die Phenol und Proteine enthält, einer mittleren weißen Phase in der sich die DNA befindet und einer oberen wässrigen Phase,die die RNA enthält.
Die RNA- und DNA-Fraktionen wurden abpipettiert und separat in Eppendorfhütchen bei –80 °C gelagert.
Messung der RNA-Konzentration
Die Arbeiten mit RNA-Proben sind mit besonderer Sorgfalt durchzuführen, um eine Kontamination mit RNasen aus der Umwelt zu vermeiden. Es ist auf das Arbeiten an
speziell nur für RNA-Präparation vorgesehenen Arbeitsplätzen mit sterilen Handschuhen und sterilen Materialien zu achten.
Rezept:
H2O DEPC (Diethyl Pyrocarbonat) 100 µl DEPC
ad 1000 ml Aqua-bidest
Zur RNA Präzipitation wurden die Proben mit 500 µl Isopropanol versetzt, geschwenkt und 2-3 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es erfolgte eine Sedimentation der RNA-Salze über einen Zentrifugationsschritt bei 4 °C mit 12 500 U/min für 30 min. Dann wurde das erhaltende Pellet zum Waschen in 1000 µl 70 %igem Ethanol aufgenommen, gevortext und erneut bei 4 °C mit 12 500 U/min für 30 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand möglichst vollständig abgenommen, das Pellet 15-30 min getrocknet und in 50 µl H2O-DEPC resuspendiert. Das DEPC dient der enzymatischen Inhibierung. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch ermittelt. Es wurden 2 µl Probe mit 78 µl Ampuwa® verdünnt und bei 260 nm gegen einen Leerwert gemessen. Das Ergebnis zeigt die RNA-Konzentration in µg/ml an.
Messung der DNA-Konzentration
Rezept:
HMW2-Puffer 37,98 g NaCl (650 mM)
3,72 g EDTA (10 mM) 1,21 g Tris-Base (10 mM)
ad 1000 ml Aqua-bidest
Die DNA-Probe wurde im gleichen Volumen HMW2-Puffer aufgenommen, 1h bei Raumtemperatur geschwenkt und bei 12 500 U/min für 5 min und 4 °C zentrifugiert.
Nach Abnahme der oberen wässrigen Phase folgte die Zugabe des doppelten
Methodik 68
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Volumens 100 %igem Ethanols. Die Proben schwenkten über Nacht und wurden danach bei 12 500 U/min für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Dann wurde der Überstand abpipettiert, das Pellet 15-30 min bei Raumtemperatur getrocknet und in 20-50 µl H2O-DEPC resuspendiert. Die photometrische Messung wurde genauso wie die RNA Messung durchgeführt.
RT-PCR (Reverse Transkription-PCR)
Die RT-PCR dient der In-vitro-Synthese von DNA, deren Basensequenz komplementär zu der isolierten RNA ist. Die auf diese Weise synthetisch hergestellte DNA heißt komplementäre DNA (cDNA). Die RNA wird mit Hilfe von Super Script II Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Diese Methode lässt indirekt eine Aussage über den Expressionszustand einzelner Gene zu, da die genetische Information der RNA genutzt wird, die letztendlich die Information für die Proteinsynthese enthält.
Zuerst wurden 1-2 µl RNA in einem Eppdorfhütchen mit 1 µl Random-Primer versetzt und zur Hybridisierung für 5 min bei 70 °C in den Thermoblock gestellt. Random-Primer sind Gemische aus vielen verschiedenen kurzen Random-Primern, deren Sequenzen häufig in RNA vorkommen. Nach dem Primer-Annealing inkubierte die Probe 5 Minuten auf Eis und wurde mit 1000 U/min bei 4 °C für 30 Sekunden zentrifugiert.
Anschließend wurde sie mit dem Mastermix für RNA versetzt und auf ein Volumen von 25 µl mit H2O DEPC aufgefüllt. Dann erfolgte die Polymerisation für 1 Stunde bei 37 °C, bei der die Super Script II Reverse Transkriptase die Randomprimer mit den Grundbausteinen aus dem Nucleinsäure Mix (dNTP) verlängert. Dadurch entstehen RNA/DNA-Hybride. Das RNasin® fungiert dabei als RNase-Inhibitor. Die erhaltende cDNA wurde sofort für die PCR weiterverwendet oder zur Lagerung bei –20 °C eingefroren.
PCR
Mit der Polymerase-Kettenreaktion können die oben gewonnenen cDNA Segmente vervielfältigt (amplifiziert) werden. Es handelt sich also um eine sehr empfindliche Nachweismethode, mit der sich kleinste Mengen an DNA vermehren und nachweisen lassen. Zwei Oligonucleotide (Primer) mit einer bekannten
komplementären Sequenz der nachzuweisenden DNA werden genau hinter dem Ende der zu amplifizierenden Sequenz positioniert. Zuerst werden die DNA-Stränge durch Erhitzen von einander getrennt und die im Überschuss zugegebenen Primer lagern sich an die zu amplifizierenden Bereiche. Durch Zugabe der thermostabilen Polymerase Taq1 und der vier Desoxynucleosidtriphosphate wird das DNA-Segment selektiv repliziert. Dieser Vorgang wird 25-30mal wiederholt, so dass sich das DNA-Segment leicht isolieren lässt.
Rezept:
Mastermix für 25 µl RNA-Ansatz 1 µl DNTP-Mix
1 µl Primer Sence 1 µl Primer RAS
1 µl c-DNA 2,5 µl PCR Puffer
1,25 µl Red Taq 17,25 µl Ampuwa
Dem Mastermix wurden 2 µl des spezifischen Primers und 1 µl DNA zugesetzt. Der Ansatz wurde auf 25 µl mit Ampuwa® aufgefüllt. Als Positiv-Kontrolle für Kollagen Typ I wurde die DNA von Fibroblasten und Knorpelzellen in der 2. Passage und für Kollagen Typ II die DNA von Knorpelzellen direkt nach der Isolation mitgeführt. Für die Negativ-Kontrolle wurde anstelle des Probenvolumens Wasser pipettiert. Alle Zutaten sind während des Pipettierens auf Eis zu lagern. Die PCR wurde im Thermoblock durchgeführt und beginnt mit der Denaturierung der DNA in Einzelstränge für 45 Sekunden bei 2x 94 °C. Dann erfolgte eine Temperaturabsenkung über 1,5 min für das Primer- Annealing mit anschließender Replikation bei 72 °C für 1,5 min und bei 72 °C für 3 min durch die RedTaqTM Polymerase unter Verwendung der dNTPs. Ein neuer DNA-Strang entsteht, der sich durch 34 weitere Temperaturzyklen dieser Art exponentiell vermehren lässt.
Methodik 70
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Die Annealing Temperaturen der verwendeten Primer:
GAPDH: 55 °C Kollagen I : 53,4 °C Kollagen II: 53 °C
Analyse der PCR-Amplifikate durch Gelelektrophorese
Die PCR-Amplifikate wurden in Bezug auf Größe und Vorkommen durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Spezifität der Primer wurde im Vorfeld von der Arbeitsgruppe Mertsching durch die Sequenzierung der Amplifikate überprüft.
Rezepturen:
Tris-Puffer 25-fach TAE-Laufpuffer 25-fach
121 g Tris-Base 1M Tris-Base pH 8,1
28,6 ml Eisessig 25mM EDTA pH 8,0
18,6 g EDTA
ad 1000 ml Aqua-bidest
Zu Beginn wurde das Gel für die Elektrophorese gegossen. Es wurden in 100 ml 1-fach Tris 1,6 g Agarose gelöst und in der Mikrowelle aufgekocht. Nach dem Abkühlen wurden 5 µl Ethidiumbromid zugesetzt. Das Ethidiumbromid ist stark kanzerogen und mutagen, deshalb muss mit Handschuhen mit Vorsicht gearbeitet werden. Das flüssige 1,6 % Agarosegel wurde in eine Gelkammer gegossen. Nach Beseitigung der Luftblasen wurde ein Kamm eingesetzt, welcher nach Erstarren des Gels wieder entfernt wurde. Die Apparatur wurde in eine Laufkammer gesetzt, selbige mit 1-fach TAE-Laufpuffer befüllt, je 11 µl Probe in die entstandenen Taschen aufgetragen und eine Elektrophorese bei 130 V gestartet. Sobald die Banden am unteren Ende des Gels ankamen, wurde die Elektrophorese gestoppt. Die Größe der Nucleinsäuren-Fragmente wurde im Anschluss mit Hilfe eines Größenmarkers (Ladders) bestimmt, von dem 3 µl in einer separaten Spur aufgetragen wurden.
Die Dokumentation erfolgte unter UV-Beleuchtung, da sich Ethidiumbromid in die Nukleinsäure-Banden interkaliert und unter UV-Licht fluoresziert.