Histologie

Die in-vitro generierten Gewebe und vergleichend dazu die nativen Gewebe wurden histologisch gefärbt. Dadurch wird eine Darstellung der Zellverteilung innerhalb der ECM sowie die Charakterisierung der ECM Komponenten möglich. Neben der

Hämalaun & Eosin Färbung als Übersichtsfärbung wurden Spezialfärbungen, wie die Azan- und die Pentachromfärbung, durchgeführt.

Silanisierung der Objektträger

Eine Beschichtung der Objektträger mit Silan verbessert die Haftung der Gewebeschnitte. Dies geschieht durch eine chemische Reaktion zwischen dem Aminopropylsilan und den Hydroxylgruppen des Glasobjektträgers.

Rezept:

2 %ige Silanlösung

2 ml 3-Aminopropyltriethoxy-Silane ad 200 ml Aceton

Zur Silanisierung inkubierten die Objektträger 5 min in Aceton bei Raumtemperatur.

Anschließend wurden sie für 5 min in die 2 %ige Silanlösung gestellt und 15 min bei fließendem Leitungswasser gespült, kurz in Aqua-bidest getaucht und über Nacht bei 60 °C getrocknet.

Paraffineinbettung

Die einzubettenden Gewebeproben wurden einige Tage in 5 %ig gepuffertem Formalin fixiert. Zur Einbettungsvorbereitung wurden die fixierten Proben in kleine Plastikkassetten gelegt, in denen sie für 3 Stunden unter fließendem Leitungswasser gewässert wurden. Anschließend inkubierten die Proben für jeweils 2 Stunden in den einzelnen Konzentrationen der aufsteigenden Alkoholreihe 50 %, 60 %, 70 % , 96 % und absolutem Ethanol. Aus dem absoluten Alkohol erfolgte eine Überführung und Inkubation der Proben im Xylolersatz Histoclear. Danach wurden die Proben 8 Stunden im 40 °C warmen Paraplast inkubiert, dann in kleine Förmchen gelegt und mit Paraffin übergossen. Nach einer Abkühlungsphase in kaltem Leitungswasser ließen sich die Formen vom Paraffin lösen und die Blöcke wurden am Mikrotom in 3-6 µm dicke Schnitte geschnitten. Die anfallenden Schnitte wurden im 38 °C warmen Wasserbad mit der glänzenden Seite auf der Wasseroberfläche zur Streckung

Methodik 56

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gebracht und mit einem silanisierten Objektträger von der Wasseroberfläche abgenommen.

Hämalaun-Eosin (HE) Färbung

Die HE Färbung ist als klassische Übersichtsfärbung bekannt. Sie färbt mit dem basischen Farbstoff Hämalaun saure Komponenten wie Aminogruppen und Gewebsanteile wie Zellkerne blau an. Das Eosin als saurer Farbstoff färbt basische Komponenten wie Karboxyl- und Nitrogruppen und Zellbestandteile wie Cytoplasma rot an.

Rezept:

Eosin 2 % 2 g Eosin 1-2 Tropfen Eisessig ad 100 ml Auqa-bidest

Die mit Paraffinschnitten versehenden Objektträger wurden bei 60 °C für 30 min im Wärmschrank entparaffiniert. Anschließend erfolgten jeweils zweimal 5-minütige Inkubationen im Xylol und jeweils 2-minütige Inkubationen in den einzelnen Konzentrationen der absteigenden Alkohol-Reihe (100 % Ethanol, 96 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol). Am Ende wurden die Proben in Aqua-bidest überführt. Anschließend erfolgte eine 8-minütigen Inkubation in frisch filtriertem Hämalaun und eine 10-minütige Bläuungsphase unter fließendem Leitungswasser.

An diesen Färbeschritt schloss sich eine 5-minütige Färbung in 2 %igem Eosin an.

Zum Ende durchliefen die Gewebeschnitte die aufsteigende Alkoholreihe und wurden mit Eukitt eingedeckelt.

Azan-Färbung

Die Azanfärbung ist eine Spezialfärbung zur Darstellung kollagener und retikulärer Fasern. Sie eignet sich zur Charakterisierung der ECM-Bestandteile. Der Farbstoff Anillinblau färbt kollagene Fasern, retikuläre Fasern und Schleim leuchtend blau an.

Eine Rotfärbung von Zellkernen und Zellgranulationen bewirkt das Azokarmin und eine Orangefärbung der Erytrozyten das Orange G.

Rezepturen:

Azokarminlösung Wässrige Phosphorwolframsäure 0,1 g Azokarmin G 5 g Phosphorwolframsäure ad 100 ml Aqua-bidest ad 100 ml Aqua-bidest kurz aufkochen und abkühlen auf RT

filtrieren und 1 % Eisessig zugeben

Anilin-Alkohol Essigsäure-Alkohol 1 ml Anilinöl 1 ml Eisessig

ad 100 ml 96 %item Ethanol ad 100 ml 96 %igem Ethanol Anilinblau-Orange G Lösung

0,5 g Anilinblau 2 g Orange G 8 ml Eisessig

ad 100 ml Aqua-bidest

aufkochen, abkühlen, filtrieren

diese Stammlösung 1:1 mit Aqua-bidest verdünnen

Die Gewebeschnitte wurden wie in der HE-Färbung entparaffiniert und über die absteigende Alkoholreihe in Aqua-bidest gebracht. Zu Beginn erfolgte eine Färbung für 15 min in 56 °C warmer Azokarminlösung. Danach wurden die Gewebeschnitte kurz in Aqua-bidest gespült und anschließend in Anilin-Alkohol differenziert bis nur noch die Zellkerne gefärbt waren. Das Anilin wurde 30-60 Sekunden in Essigsäure-Alkohol ausgewaschen. Daran schloss sich eine Beizung von 1-3 Stunden in 5 %iger Phosphorwolframsäure an. Abschließend wurden die Gewebeschnitte in Aqua-bidest gespült und 1-3 Stunden in Anilinblau-Orange G Lösung gefärbt. Nach dem Abspülen des Farbstoffes in Aqua-bidest wurde, wie in der HE-Färbung, mit der aufsteigenden Alkoholreihe und dem Eindeckeln der Objektträger fortgefahren.

Methodik 58

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Pentachrom

Die Pentachromfärbung ist eine aufwendige Mehrfachfärbung zur Darstellung der unterschiedlichen Bindegewebsarten. Die Darstellung der Farbverteilung innerhalb der verschiedenen Gewebekomponenten ist der Tabelle 2 zu entnehmen.

Gewebe Farbstoff Färbung

mineralisiertes

Knochengewebe Safran leuchtend gelb Kollagen Fasern Safran leuchtend gelb mineralisierter Knorpel Safran / Alcianblau blau-grün nicht-mineralisierter

Knorpel Safran rötlich-gelb

Glucosamnioglykane Alcianblau leuchtend hellblau

Osteoid Fuchsin dunkelrot

elastische Fasern Fuchsin rot

Zellkern Eisenhämatoxylin blau-schwarz

Zytoplasma Fuchsin rötlich

Tab. 2: Die Farbverteilung der Pentachrom

Rezepturen:

Alkalischer Alkohol Alcianblau-Lösung 10 ml Ammoniak 1 g Alcianblau ad 100 ml 96%igem Ethanol 1 ml Eisessig

ad 100 ml Aqua-bidest

Saffron du Gatinais 6 g Saffron

ad 100 ml 96 %igem Ethanol

vor Gebrauch in luftdichter Flasche im Brutschrank bei 50 °C für 48 Stunden extrahieren

Brilliant Crocein-Säurefuchsin

Lösung A Lösung B

0,1 g Brilliant Crocein 0,1 g Säurefuchsin in 0,5 ml Eisessig in 0,5 ml Eisessig ad 100 ml Aqua-bidest ad 100 ml Aqua-bidest Gebrauchslösung

8 Teile der Lösung A mit 2 Teilen der Lösung B mischen Weigerts Eisenhämatoxilin

Lösung A Lösung B

1 g Hämatoxilin 1,16 g Eisenchlorid ad 100 ml 96%igem Ethanol 1 ml 25 %ige Salzsäure reifen lassen bis die Farbe rotbraun ist ad 100 ml Aqua-bidest Gebrauchslösung

Lösung A und B 1:1 mischen nur 8 Tage haltbar

Methodik 60

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Zu Beginn der Färbung erfolgten, wie in den zuvor beschriebenen Färbungen die Entplastung und die Inkubationen in der absteigende Alkoholreihe, um die Schnitte ins wässrige Medium zu überführen. Daran schloss sich eine 10-minütige Färbung im Alcianblau und eine 5-minütige Spülung mit Leitungswasser an. Anschließend erfolgte ein Färbungsstabilisierungsschritt in alkalischem Ethanol für 60 Minuten.

Danach wurden die Gewebeschnitte für 10 Minuten unter fließendem Leitungswasser gewässert und für weitere 10 Minuten in Weigerts Eisenhämatoxylin gefärbt.

Anschließend wurde eine Wässerung für 15 Minuten in Leitungswasser, eine Färbung in Brilliant Crocein-Säurefuchsin für 15 Minuten und eine kurze Spülung in 0,5 %iger Essigsäure durchgeführt. Dann wurden die Gewebeschnitte 20 Minuten in 5 %iger Phosphorwolframsäure differenziert, jeweils 2 Minuten in 0,5 % Essigsäure und in 100 %igem Ethanol gespült, um sie dann 60 Minuten in Saffron du Gatinais zu färben. Am Ende der Färbung erfolgte die Entwässerung und Eindeckelung der Gewebeschnitte in Eukitt.

4.5.6 SDS-Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Westernblot