PCR (Genexpression für Kollagen)

Im Verlauf der 4-wöchigen Kultivierung der 2-D und 3-D Kulturen wurden nach 7, 14, 21, und 28 Tagen Gewebeproben für die Polymerase-Kettenreaktion aufgearbeitet.

Mit den spezifischen Knorpelzellprimern für Kollagen I, Kollagen II und GAPDH als House-Keeping-Gen, sollten die Ergebnisse aus den anderen Untersuchungen unterstützt, bzw. ergänzt werden. Als Positiv-Kontrolle für Kollagen Typ I wurden Fibroblasten und Knorpelzellen in der 2.Passage mitgeführt: Für Kollagen Typ II Knorpelzellen direkt nach der Isolation und als Negativ-Kontrolle Endothelzellen.

Die Zellen wurden mit Trizol lysiert und anschließend die RNA und DNA isoliert und photometrisch gemessen. In allen Proben konnte RNA und DNA nachgewiesen werden. Die Intaktheit der RNA wurde in einem 1,5 %igem Agarosegel überprüft. Zu erwarten wären zwei Banden, eine 18S und eine 28S RNA-Bande. Diese Banden konnten nur für die Proben der 7 Tage Werte und für die Kontrollen nachgewiesen werden. Weiterverarbeitet und umgeschrieben zu c-DNA wurden nur die Proben mit intakter RNA, also die nach 7 Tagen gewachsenen Gewebe aus der 2-D und 3-D Kultur, sowie alle oben aufgeführten Kontrollen. Nach der PCR und dem Auftrag der Proben auf ein Gel, konnten für das House-Keeping Gen GAPDH in allen aufgetragenen Proben positive Banden beobachtet werden. In der PCR zur Kollagen Typ I Expression waren sowohl die 2-D und 3-D Kulturen der 7 Tage Werte als auch die mitgeführten Kontrollen positiv. Die Kollagen Typ II Expression konnte in allen Proben nachgewiesen werden, mit Ausnahme der Kontrolle der porcinen Rippenknorpelzellen in der 2. Passage (Abb. 19).

Ergebnisse 90

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Abb. 19: PCR, Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren

Bahn 1-2:

Die 2-D Kulturen von 500 000 porcinen Rippenknorpelzellen pro cm² wurden nach 7-tägiger Kultivierung auf die Genexpression von GAPDH, Kollagen I und II überprüft.

Bahn 3-4:

Die 3-D Kulturen von 500 000 porcinen Rippenknorpelzellen in 100 µl flüssiger Matrix pro cm² wurden nach 7-tägiger Kultivierung auf die Genexpression von GAPDH, Kollagen I und II überprüft.

Bahn 5:

Porcine Rippenknorpelzellen wurden nach der Isolation als Kollagen Typ II Positiv-Kontrolle auf die Genexpression von GAPDH, Kollagen I und II überprüft.

Bahn 6:

Porcine Rippenknorpelzellen in der 2. Passage wurden als Kollagen Typ I Positiv-Kontrolle auf die Genexpression von GAPDH, Kollagen I und II überprüft.

Bahn 7:

Porcine Fibroblasten wurden als Kollagen Typ I Positiv-Kontrolle auf die Genexpression von GAPDH, Kollagen I und II überprüft.

Bahn 8: Wasser als Negativ-Kontrolle

5.2.7 Histologie

Analog zu den wöchentlichen Probenentnahmen wurden die 2-D und 3-D generierten Gewebe nach 7, 14, 21 und 28 Tagen in Formalin fixiert, für die Paraffineinbettung vorbereitet und histologisch gefärbt. Als Übersichtsfärbung wurde die HE-Färbung und als Spezialfärbung, zum Nachweis der extrazellulären Matrix Komponenten, die Pentachromfärbung durchgeführt.

HE-Färbung

Auf den histologischen Aufbau von nativem hyalinen Knorpel wurde in Kap. 2.4 ausführlich eingegangen. Die für die Beurteilung wichtigen Parameter sind die isogenen Zellgruppen, die Matrixproduktion und die damit verbundene Knorpellagunenbildung. Als isogene Zellgruppe wird das paarweise Liegen von Zellen bezeichnet, welches ein Zeichen für Zellteilung bzw. -vermehrung ist. Der die Knorpelzelle umgebende weiße Saum im histologischen Bild ist die typische Knorpellagune, die sich durch die Gewebefixierung ausbildet und für eine Matrixsynthese der Zellen steht.

Die Bilder der HE-Färbung aus der 2D-Kultur zeigen deutlich, dass die Knorpelzellen nach 7-tägiger Kultivierung noch sehr eng zusammen liegen, aber schon von synthetisierter Matrix umgeben werden. Die Matrixproduktion nimmt bis zum 21. Tag zu und drängt so die Zellen allmählich auseinander. An den Tagen 14 und 21 sind vermehrt isogene Zellgruppen zu finden. Die Lagunenbildung ist über die gesamte Kulturdauer vorhanden, am stärksten aber zwischen Tag 14 und Tag 21 ausgeprägt.

Ergebnisse 92

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Abb. 20: HE-Färbung, 2-D Kulturverfahren, Vergrößerung 200-fach

Die HE-Färbungen der Paraffinschnitte der 2-D Kulturen aus 500 000 porcinen Rippenknorpelzellen pro cm² nach 7- (Abb. A), 14-(Abb. B), 21- (Abb. C) und 28-tägiger (Abb. D) Kultivierung zeigen Knorpelzellen, die in den für sie typischen Lagunen und isogenen Zellgruppen vorkommen. Nach 7-tägiger Kulturdauer werden die Zellen durch die produzierte ECM langsam auseinander gedrängt und liegen vereinzelt.

Im Gegensatz zur 2-D Kultur liegen die Zellen in der 3-D Kultur von Kulturbeginn an vereinzelt, da durch die flüssige Matrix ein größerer Verteilungsraum zur Verfügung steht. Deutlich ist die Matrixproduktion nach 7 Tagen mit Zunahme bis zum 21 Tag zu erkennen. Die neusynthetisierte Matrix grenzt sich von der flüssigen Matrix durch eine intensivere Blaufärbung ab und umgibt die Zellen kreisförmig. In der 2. und 3.

Kulturwoche sind vermehrt isogene Zellgruppen und eine ausgeprägte

A B

C D

Lagunenbildung vorhanden. Nach 28 Tagen sind die Zellstrukturen noch sichtbar, aber scheinbar nicht mehr intakt, da die Zellkerne den Hämalaunfarbstoff kaum annehmen.

Abb. 21: HE-Färbung, 3-D Kulturverfahren, Vergrößerung: 200-fach

Die HE-Färbungen der Paraffinschnitte der 3-D Kulturen aus 500 000 porcinen Rippenknorpelzellen in 100 µl flüssiger Matrix pro cm² nach 7- (Abb. A), 14-(Abb. B), 21- (Abb. C) und 28-tägiger (Abb. D) Kultivierung zeigen Knorpelzellen, die in den für sie typischen Lagunen und isogenen Zellgruppen. Durch die flüssige Matrix liegen die Zellen von Kulturbeginn an weniger dicht als in der 2-D Kultur. Die flüssige Matrix stellt sich in der HE-Färbung grau bis blass blau dar, im Gegensatz zu der intensiver blau gefärbten, die Zellen kreisförmig umgebenden neusynthetisierten Matrix.

B

D C

A B

Ergebnisse 94

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Pentachrom

Die Pentachromfärbung ist eine aufwendige Mehrfachfärbung. Der Farbstoff Safran färbt mineralisiertes Knochengewebe und kollagene Fasern leuchtend gelb, mineralisierten Knorpel grün-blau und nicht-mineralisierten Knorpel rötlich-gelb.

Leuchtend hellblau färben sich die Glucosaminoglykane durch den Farbstoff Alcianblau. Osteoid wird über den Farbstoff Fuchsin dunkelrot gefärbt.

Sowohl in der 2-D als auch in der 3-D Kultur färben sich die gezüchteten Gewebe über den gesamten Kulturzeitraum grün-blau an. Dies deutet auf eine beginnende Mineralisation des Knorpels hin. Die folgenden Bilder entstanden in der dritten Kulturwoche.

Abb. 22: Pentachromfärbung, Vergleich zwischen 2-D und 3-D Kulturverfahren, Vergrößerung: 200-fach

Die Pentachromfärbungen der Paraffinschnitte der 2-D Kulturen aus 500 000 porcinen Rippenknorpelzellen pro cm² (Abb. A) und der 3-D Kulturen aus 500 000 porcinen Rippenknorpelzellen in 100 µl flüssiger Matrix pro cm² ( Abb. B) zeigen nach 21-tägiger Kultivierung Knorpelzellen, die in den für sie typischen Lagunen und isogenen Zellgruppen vorkommen. Die blau-grüne Farbe der ECM in der Pentachromfärbung deutet auf eine beginnende Mineralisation des Knorpels hin, die später in eine Kalzifikation übergehen kann.

A B