Bovine Euterpräzisionsschnitte als Modell des frühen Infektionsgeschehens einer Mastitis

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Bovine Euterpräzisionsschnitte als Modell des frühen Infektionsgeschehens einer Mastitis

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Viviane Filor

Essen

Hannover 2019

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

2. Gutachter: Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede

Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2019

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Für meine Eltern

in Liebe und Dankbarkeit

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Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ... 1

2. Literatur ... 3

2.1. Motivation dieser Arbeit ... 3

2.1.1. Resistenzproblematik ... 3

2.2. In-vitro-Modelle ... 5

2.2.1. Isoliert perfundierte Organe ... 6

2.2.2. Gewebepräzisionsschnitte (precision cut tissue sclices, PCTS) ... 7

2.3. Anatomischer Aufbau der bovinen Milchdrüse ... 9

2.3.1. Mastitis des Rindes ... 11

2.3.2. Immunkompetenz des Euters – Zelluläre Abwehrmechanismen ... 13

2.3.3. Entzündungsmediatoren ... 14

2.4. Bisherige In-vitro-Methoden zur Untersuchung der bovinen Milchdrüse ... 18

2.5. Zielsetzung der Arbeit ... 19

3. Material und Methoden ... 20

3.1. Material ... 20

3.1.1. Chemikalien ... 20

3.1.2. Geräte ... 21

3.1.3. Allgemeine Materialien ... 22

3.1.4. Materialien aus dem Labor der Sicherheitsstufe 2 ... 23

3.1.5. Verwendete Agar und Bouillon ... 23

3.1.6. Verwendete Medien, Antibiotika und Zusätze ... 23

3.1.7. Zusammensetzung der Medien, Puffer und Lösungen ... 24

3.1.8. Verwendete Bakterienstämme ... 24

3.1.9. Verwendete Arzneimittel ... 24

3.1.10. ELISA ... 25

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Inhaltsverzeichnis

II

3.1.11. Vitalitätstest ... 25

3.1.12. Stimulanzien ... 25

3.2. Methoden ... 26

3.2.1. Versuchsübersicht ... 26

3.2.2. Herkunft des Probenmaterials ... 26

3.2.3. Gewinnung der PCBUS mittels Dermatom ... 27

3.2.4. Vitalitätsbestimmung der PCBUS mittels MTT-Assay ... 28

3.2.5. Überprüfung auf Verkeimung ... 29

3.2.6. Histologische Untersuchung der PCBUS ... 29

3.2.6.1. Herstellung der Paraffinschnitte mittels Mikrotom ... 30

3.2.6.2. Hämatoxylin-Eosin- und Gram-Färbung ... 30

3.2.7. Stimulation der PCBUS ... 33

3.2.8. Infektionsversuch mit den PCBUS ... 34

3.2.8.1. Verwendete Bakterien ... 34

3.2.8.1.1. Staphylococcus aureus ... 34

3.2.8.1.2. Escherichia coli ... 34

3.2.8.2. Durchführung des Infektionsversuchs ... 35

3.2.8.2.1. Untersuchung von Testsubstanzen zur Beeinflussung des Infektionsgeschehens... 38

3.2.8.3. Untersuchung der Überstände auf das Vorhandensein von Immunmediatoren mittels Ezyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ... 41

3.2.8.4. Statistische Auswertung ... 42

4. Ergebnisse ... 43

4.1. Schneidetechnik ... 43

4.2. Vitalitätsbestimmung der PCBUS mittels MTT-Assay ... 43

4.3. Histologische Untersuchung... 45

4.3.1. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) der PCBUS ... 45

4.4. Stimulation der PCBUS ... 47

4.5. Ergebnisse des artifiziellen Infektionsgeschehens ... 48

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Inhaltsverzeichnis

III

4.5.1. Gram-Färbung der PCBUS ... 48

4.5.2. Freisetzung von IL-1ß ... 51

4.5.3. Freisetzung von PGE2 ... 52

4.5.4. Freisetzung von TNF-α ... 53

4.6. Untersuchung von Testsubstanzen zur Beeinflussung des Infektionsgeschehens ... 57

4.6.1. Freisetzung von IL-1ß und IL-6 ... 57

5. Diskussion ... 60

5.1. Herkunft des Probenmaterials ... 60

5.2. Gewinnung der PCBUS und histologische Untersuchung ... 60

5.3. Vitalitätsbestimmung der PCBUS ... 62

5.4. Stimulation der PCBUS ... 64

5.5. Etablierung des artifiziellen Infektionsgeschehens ... 64

5.5.1. Eingesetzte Infektionsdosis ... 65

5.6. Untersuchte Immunmediatoren des Infektionsversuches ... 66

5.6.1. Beeinflussung der Immunreaktion infizierter PCBUS durch verschiedene Testsubstanzen ... 69

5.7. Variabilität der Ergebnisse ... 70

5.8. Schlussfolgerung ... 71

6. Zusammenfassung ... 74

7. Summary... 76

8. Literaturverzeichnis ... 78

9. Anhang ... 101

9.1. Publikationsverzeichnis ... 101

9.2. Danksagung ... 102

(8)

Abkürzungsverzeichnis

IV Abkürzungsverzeichnis

Ø Durchmesser, Durchschnitt

°C Grad Celsius

® eingetragenes Warenzeichen

% Prozent

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

Aqua bidest. Aqua bidestillata

bzw. beziehungsweise CMT California-Mastitis Test E. coli Escherichia coli

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay et al. et alii, et aliae

FKS fetales Kälberserum

g Gramm

h Stunde

KBE Koloniebildende Einheiten IL-1ß Interleukin-1ß

IL-6 Interleukin-6

l Liter

LB-Bouillon Luria-Bertani-Bouillon LPS Lipopolysaccharide LTA Lipoteichonsäuren

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Abkürzungsverzeichnis

V

mm Millimeter

mg Milligramm

MHK Minimale Hemmstoffkonzentration

min Minute

ml Milliliter

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid

ng Nanogramm

PBS Phosphate buffered saline

PGN Peptidoglykan

PGE2 Prostaglandin E2

pH pH-Wert

RPMI Roswell Park Memorial Institue Medium S. aureus Staphylococcus aureus

TNF-α Tumor-Nekrosefaktor-α TXA2 Thromboxan-A2

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VI

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Einleitung

1

1. Einleitung

In Anbetracht der bedrohlichen, globalen Problematik der Antibiotikaresistenzen ist eine Intensivierung der Forschung auf dem Gebiet der bakteriellen Infektionskrankheiten unumgänglich (WHO 2015).

Es ist daher wichtig, ein breites Spektrum von Möglichkeiten zu prüfen, welche die Wirksamkeit von antibakteriellen Wirkstoffen auch für die Zukunft sicherstellen. Hierzu zählen neben der Optimierung des Einsatzes dieser Wirkstoffe auch die Prüfung neuer Pharmaka und Behandlungsoptionen. So sollen Möglichkeiten untersucht werden, die das Abwehrgeschehen des Organismus gegen Krankheitserreger unterstützen. All diese Untersuchungen und insbesondere jene, die ein „proof of concept“ darstellen, können und dürfen größtenteils nicht im In-vivo-Experiment an Tieren durchgeführt werden, da sie als Infektionsversuche im Regelfall mit erheblichem Leid der Tiere verbunden sind. Eine Recherche bei PubMed ergab am 23.09.2019 unter dem Suchbegriff „animal study, infection“ 137.737 Treffer. Beruhend auf dieser Annahme, dass in jeder der aufgerufenen Arbeiten zehn Tiere für einen Infektionsversuch verwendet wurden, läge die Zahl von in Infektionsversuchen verwendeten Tieren bereits bei über 1 Million.

Pharmakologisch wirksame Substanzen konnten in den letzten Jahrzehnten schon in vielen In-vitro-Studien erfolgreich untersucht werden (BRENDEL et al. 1987;

KIETZMANN et al. 1993; VIETMEIER et al. 2007). Eine wichtige Rolle nimmt dabei das Modell der Gewebepräzisionsschnitte ein. Durch diese Art der Probengewinnung ist es möglich, aus dem Gewebe eines einzelnen Tieres eine Vielzahl an Probenmaterial zu generieren und somit unterschiedliche Therapieansätze an einem einheitlichen Gewebe zu testen. Neben pharmakologischen Studien (VIETMEIER et al. 2007; BARTON et al. 2010) konnte die Methode der Gewebepräzisionsschnitte bereits auch in Studien der Infektionsmedizin erfolgreich angewendet werden (MENG et al. 2015).

Für die folgende Arbeit wurde versucht, das In-vitro-Modell der Gewebepräzisionsschnitte auf bovines Eutergewebe zu übertragen. Die Entzündung der bovinen Milchdrüse ist eine der bedeutendsten Krankheiten des adulten Rindes.

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Einleitung

2

Dabei handelt es sich um eine behandlungsintensive Erkrankung, die für die Landwirte mit hohen finanziellen Verlusten und für das Tier mit erheblichen Schmerzen verbunden ist. Durch die Etablierung von Euterpräzisionsschnitten im Zusammenhang mit In-vitro-Modellen wird dem Forschungsbedarf zur Untersuchung neuer Therapieansätze für die Einsparung von Antibiotika sowie der Reduzierung von Tierversuchen und damit dem Tierschutz Rechnung getragen.

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Literatur

3

2. Literatur

2.1. Motivation dieser Arbeit

2.1.1. Resistenzproblematik

Die bedrohliche, global bestehende Resistenzproblematik ist durch die Weltgesundheitsorganisation (WHO 2015) und nationale Strategiepapiere (DART 2020) eindrucksvoll dokumentiert. Dabei wird ein Zusammenhang zwischen der Antibiotikaresistenz im Human- und Veterinärbereich und auch in der Umwelt sowie im Lebensmittelsektor (ROBINSON et al. 2016) deutlich. Erforderliche Schritte zur Bekämpfung des Problems der globalen Antibiotikaresistenzen sind der fachgerechte Einsatz von Antibiotika, höhere Investitionen zur Bekämpfung von Infektionen sowie eine bessere Prävention (WHO 2015; DART 2020).

Die ineffektive Verwendung von Antibiotika stellt bei der Entstehung von resistenten Bakterien ein Problem dar (FREIRE-MORAN et al. 2011; ROCA et al. 2015). Für die Tiermedizin sind daher in Deutschland seit 2011 pharmazeutische Unternehmen und Großhändler auf Basis des Arzneimittelgesetztes (§ 47 Abs. 1c AMG) dazu verpflichtet, die Abgabe der Arzneimittel mit antimikrobiellen Wirkstoffen (Antibiotika) einer zentralen Registerstelle zu melden. Um die jährlichen Abgabemengen von Arzneimitteln in der Tiermedizin zu registrieren, wurde 2010 die Verordnung über das datenbankgestützte Informationssystem über Arzneimittel des Deutschen Instituts für Medizinische Dokumentation und Information (DIMDI-Arzneimittelverordnung) verabschiedet. Die dort erhobenen Daten werden vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) ausgewertet. Im Gegensatz zum Vorjahr wurden im Jahr 2018 1,5 % weniger antibakteriell wirksame Substanzen durch Tierärzte mit einer tierärztlichen Hausapotheke bezogen, wobei die Abgabe einzelner Antibiotikaklassen stark schwankt. Seit Beginn der Erfassung im Jahr 2011 ist die Abgabe der Antibiotika bis zum Jahr 2018 um mehr als 55 % zurückgegangen (WALLMANN 2019).

Investitionen in die Entwicklung neuer Antibiotika sind durch die zunehmende Regulierung und Einschränkung der Nutzung von Antibiotika für pharmazeutische Unternehmen unattraktiv geworden (CECCHINI et al. 2015). In Anbetracht der

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Literatur

4

drängenden Resistenzproblematik (DART 2020) hat die Suche nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten daher besondere Relevanz (DEUTSCHE AKADEMIE DER NATURFORSCHER LEOPOLDINA 2013).

In Zulassungsverfahren für Arzneimittel, die bei Menschen oder Tieren Anwendung finden sollen, müssen Studien zur Qualität, Wirksamkeit und Unbedenklichkeit durchgeführt werden; letztere werden am Tier durchgeführt. Auf nationaler Ebene ist jedoch im Tierschutzgesetz festgehalten, dass Tierversuche nur durchgeführt werden dürfen, wenn sie zu diesem Zweck unerlässlich sind und die Erkenntnisse durch andere Methoden nicht erlangt werden können (TierSchG § 7a).

Die Europäische Union (EU) verabschiedete erstmals 1986 spezifische Rechtsvorschriften für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Richtlinie 86/609/EWG). Diese wurde 2010 durch die Richtlinie 2010/63/EU erneuert.

Der Grundsatz des 3R-Prinzips sowie die Förderung der Entwicklung und Validierung von Alternativen zu Tierversuchen sind somit durch eine EU-Rechtsvorschrift verankert.

Das 3R-Prinzip wurde von William Russel und Rex Burch 1959 unter dem Titel „The Principles of Humane Experimental Technique“ erstmals veröffentlicht. Es beschreibt die 3R-Prinzipien der experimentellen wissenschaftlichen Arbeit mit Tieren. Das Prinzip des Reduzierens (reduce) legt fest, dass weniger Tiere zum Erhalt gleicher Informationsmenge eingesetzt oder mehr Informationen aus der gleichen Tieranzahl gezogen werden müssen. Das Prinzip des Verfeinerns (refine) soll den Tierschutz für die in experimentellen Verfahren eingesetzten Tiere verbessern, um potenzielle Schmerzen, Leiden oder Schäden zu minimieren. Zudem sollen Tierversuche ersetzt (replace) werden, sofern es möglich ist, die gleichen wissenschaftlichen Erkenntnisse durch Alternativen zu erzielen.

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Literatur

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2.2. In-vitro-Modelle

Eine Intensivierung der Forschungstätigkeit auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten ist in Anbetracht der Resistenzproblematik für Mensch und Tier bezüglich der Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe unverzichtbar (WHO 2015, EU-COMMISSION 2017).

Für die Untersuchung von Forschungsfragen der Physiologie oder Pathophysiologie werden bereits verschiedene wissenschaftliche Ansätze verwendet, deren Spektrum von Zellkulturen einerseits bis hin zu In-vivo-Experimenten andererseits reicht. Die Vorteile der zellkulturbasierten Forschung sind vielfältig. Dazu können Primärzellen genutzt werden, die direkt aus einem Organismus isoliert werden. Eine Zellpopulation ist sehr homogen, wenn sie aus dem gleichen Individuum und Gewebe stammt. Bei Zelllinien handelt es sich um immortalisierte Zellen, die sich unbegrenzt teilen können.

Experimente können in einer streng kontrollierten und replizierbaren Umgebung durchgeführt werden (HUYNH et al. 1991). Die Kosten sind im Vergleich zu Tierexperimenten niedrig, so dass eine Vielzahl an Replikaten möglich ist. Dies ist bei Ex-vivo- oder In-vivo-Versuchen aufgrund höherer Kosten, der mangelnden Gewebeverfügbarkeit und ethischer Fragen nur selten zu erreichen (DANIEL et al.

2018). Ein Nachteil von Zellkulturexperimenten ist die Isolierung von Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und der daraus resultierende Mangel an entsprechenden physiologischen Zell-Zell-Kontakten und Mediatoren des Gewebes (CARON et al.

2012). Dagegen spiegeln In-vivo-Experimente das komplexe physiologische Umfeld der Zellverbände am besten wider und werden daher in den späteren Phasen der klinischen Forschung eingesetzt, um frühere Schlussfolgerungen aus In-vitro-Studien zu bestätigen (DANIEL et al. 2018). Es ist zu beachten, dass es auch deutliche individuelle Unterschiede zwischen genetisch ähnlichen Tieren gibt, die eine Erforschung an einer großen Anzahl von Tieren und damit lange und teure Versuchsaufbauten erfordern, die das Wohlbefinden der Tiere stärker beeinträchtigen (GRUBER et al. 2004). Es gilt also, eine Lücke zwischen Zellkultur- und Tierversuchen durch Ex-vivo- und In-vivo-Modelle zu schließen oder zumindest zu verkleinern.

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Literatur

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Um die Wirkungsprinzipien neuer pharmakologisch wirksamer Substanzen zu untersuchen und Tierversuche gemäß des 3R-Prinzips zu reduzieren, kann bereits auf verschiedene Ex-vivo- und In-vitro-Modelle zurückgegriffen werden.

2.2.1. Isoliert perfundierte Organe

Das Ex-vivo-Modell isoliert perfundierter Organe wurde bereits für diverse Fragestellungen in der Human- und Veterinärmedizin genutzt (HEBB u. LINZELL 1951; ROMANOFF et al. 1962; BULLETTI et al. 1987). Dabei können sowohl physiologische Prozesse untersucht (HELLEWELL u. PEARSON 1983; ARAKI et al.

2005), wichtige Erkenntnisse für die Transplantationsmedizin gewonnen (SCHÖN et al. 2001; CYPEL et al. 2008), als auch pathophysiologische Abläufe analysiert werden (KÖHRMANN et al. 1994; PATAN-ZUGAJ et al. 2014).

Das im Folgenden skizzierte Beispiel soll zeigen, wie die Entwicklung von In-vitro-Modellen zur Erkenntnisgewinnung der oben genannten Beispiele beitragen sowie zur Bearbeitung pharmakologischer Fragestellungen genutzt werden kann und wie Tierversuche reduziert werden können. PETERSEN et al. (1939) beschrieben erstmals den Prozess der Milchejektion eines bovinen Euters durch Untersuchungen eines isoliert perfundierten bovinen Euters. In den folgenden Jahrzehnten konnte das Modell des isoliert perfundierten Rindereuters durch Modifikationen und Erkenntnisgewinne anderer Untersuchungen zu isoliert perfundierten Organen (DE LANGE et al. 1992) auch zur Ermittlung der perkutanen Medikamentenaufnahme genutzt werden (KIETZMANN et al. 1993). Dabei mussten KIETZMANN et al. (1993) nicht auf Versuchstiere zurückgreifen, sondern konnten ihre Studien an bovinen Eutern von Schlachttieren durchführen. Nur einige Jahre später wurde das Ex-vivo-Modell mit Material aus Schlachttieren auch zur Darstellung entzündlicher Prozesse (BÄUMER u.

KIETZMANN 2000) oder zur Gewebeverteilung lokal und „systemisch“ applizierter Therapeutika (EHINGER u. KIETZMANN 2000; EHINGER et al. 2006) genutzt.

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Literatur

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2.2.2. Gewebepräzisionsschnitte (precision cut tissue sclices, PCTS)

Auf Grund der Thematik dieser Arbeit wird der Fokus verstärkt auf die In-vitro-Modelle der Gewebepräzisionsschnitte gelegt.

Bereits im 19. Jahrhundert beschäftigte man sich mit der Isolation von Organstrukturen, um sie durch experimentelle Verfahren untersuchen zu können (BERNARD 1856). 1923 führten WARBURG u. MINAMI (1923) erstmals Versuche an vitalen Tumorschnitten durch, die mit Rasiermessern auf eine einheitliche Dicke geschnitten wurden. Gewebepräzisionsschnitte werden von vielen Forschern als In- vitro-Modell zur Untersuchung von physiologischen sowie pathophysiologischen Vorgängen verwendet, da sie im Wesentlichen lebensfähige Organexplantate definierter Größe sind, die ex vivo kultiviert werden können. Alle vorkommenden Zelltypen bleiben dabei im natürlichen Zellverbund und interzelluläre sowie Zell-Matrix- Interaktionen bleiben intakt (DE GRAAF et al. 2010).

Der folgende Abschnitt soll die Weiterentwicklung der Gewebepräzisionsschnitte darstellen und zeigen, dass dieses In-vitro-Modell eine Möglichkeit bietet, eine Vielzahl an Fragestellungen speziesübergreifend bearbeiten zu können.

Eine Technik, die die Gewinnung von Gewebepräzisionsschnitten reproduzierbar macht, das Gewebe weniger traumatisiert und die Zeit der Generierung von Gewebsschnitten reduziert, wurde von KRUMDIECK et al. (1980) entwickelt.

BRENDEL et al. (1987) zeigten, dass Serienschnitte in nahezu identischer Dicke hergestellt und unter Zellkulturbedingungen inkubiert werden konnten. PLACKE u.

FISHER (1987) haben zur besseren Untersuchung von Weichgeweben, wie beispielsweise der Lunge, eine Befüllungstechnik mit Agarose entwickelt, welche eine ganzheitliche Darstellung der Organstruktur ermöglichte. DANDURAND et al. (1993) veröffentlichten eine Studie zur Untersuchung von Bronchokonstriktionen bei Lungenschnitten bei einer Schnittdicke von 500–1000 µm. Nur drei Jahre später zeigten MARTIN et al. (1996), dass bei einer geringeren Schnittdicke (250 µm) die zu untersuchenden Lungenpräzisionsschnitte besser mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden und über 72 Stunden vital in Kultur zu halten sind. Immer wieder weiterentwickelte Techniken machten es möglich, Gewebepräzisionsschnitte

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Literatur

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speziesübergreifend von Leber (OLINGA et al. 1997; LERCHE-LANGRAND u.

TOUTAIN 2000; MATE et al. 2019), Lunge (MARTIN et al. 1996; WOHLSEN et al.

2003), Niere (STRIBOS et al. 2017; CARRANZA-TORRES et al. 2019), Milz (JAMES et al. 1996), Prostata (PARRISH et al. 2002) sowie Darm (VAN DE KERKHOF et al.

2006; KRIMMLING et al. 2017), Gehirn (PAI u. RAVINDRANATH 1991), Herz (BULL et al. 2000; WANG et al. 2015) und einigen Tumortypen (KERN et al. 2006;

PARAJULI u. DOPPLER 2009) anzufertigen und auf unterschiedlichste Fragestellungen hin zu untersuchen. Die Vielfalt der untersuchten Organe durch die bloße Weiterentwicklung von etablierten Techniken zeigt, dass es möglich ist, Gewebepräzisionsschnitte von unterschiedlichen Organen anzufertigen.

Dass Präzisionsschnitte auch für pharmakologische Studien in der Veterinärmedizin genutzt werden können, zeigten über Jahre verschiedene Arbeitsgruppen (BRENDEL et al. 1987; WOHLSEN et al. 2001; VIETMEIER et al. 2007). BARTON et al. (2010) zeigten zum Beispiel auch nach der Modelletablierung von VIETMEIER et al. (2007), dass die Untersuchung pharmakologischer Substanzen auch an kleinsten anatomischen Strukturen möglich ist.

Da In-vivo-Experimente im Bereich der Infektionsmedizin in der Regel mit erheblichen Schmerzen, Leiden und Schäden für die Tiere verbunden sind, ist es im Sinne des Tierschutzes günstig, In-vitro-Modelle im Bereich der Gewebspräzisionsschnitte auch für Infektionsversuche zu nutzen. MENG et al. (2015) haben Lungenpräzisionsschnitte von Schweinen herstellen und diese mit Streptococcus suis infizieren können. Zudem gelang ihnen auch die Ko-Infektion mit Schweineinfluenzaviren und Streptococcus suis. Sie konnten so die Adhäsion, Kolonisation und Invasion der Pathogene in dem Gewebe untersuchen. Auch von der Rinderlunge konnten Präzisionsschnitte hergestellt und mit einem In-vitro-Infektionsmodell kombiniert werden. Dabei wurden Lungenpräzisionsschnitte dazu verwendet, die Interaktion zwischen dem Wirt und Mykoplasmen in vitro zu untersuchen (WELDEAREGAY et al. 2019). Neben der Untersuchung infektiöser Prozesse und toxikologischer Wirkungsweisen von Substraten konnten auch Immunreaktionen untersucht werden (GORIS et al. 2009;

TEMANN et al. 2017).

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Literatur

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2.3. Anatomischer Aufbau der bovinen Milchdrüse

Die bovine Milchdrüse ist phylogenetisch eine Hautdrüse. Sie ist in der Leistengegend angelegt und setzt sich aus vier Drüsenkomplexen vom tubuloalveolären Typ mit septaler bindegewebiger Lobolierung zusammen. Oberflächlich wird die bovine Milchdrüse von äußerer Haut überzogen. Als Halteapparat dient eine Abspaltung der Rumpffaszien. Das Ausführungsgangsystem setzt sich aus drei Abschnitten zusammen (Alveolen, Milchgänge und Milchzisternen) und mündet peripher in der Zitze (LIEBICH 2004). Der schematische Aufbau der bovinen Milchdrüse ist in Abbildung 1 zu sehen.

Abbildung 1: Querschnitt durch das bovine Euter. Beschriftung: a Ductus papillaris, b Pars papillaris sinus lactiferi, c Pars glandularis sinus lactiferi, f Drüsengewebe, g Fett- und Bindegewebe;

(ELLENBERGER u. BAUM 1974)

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Literatur

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Die Alveolen und proximalen Abschnitte der Milchgänge sind von einschichtigem Drüsenepithel ausgekleidet, welches zur Sekretion von Milchkomponenten befähigt ist. Durch exprimierte Toll-like-Rezeptoren (TLR) sind die Epithelzellen der Milchdrüse in der Lage, Pathogenmuster von Erregern zu erkennen (PETZL et al. 2018) und Zytokine und Chemokine zu sezernieren (STRANDBERG et al. 2005; LAHOUASSA et al. 2007). Dies führt zu einer ersten Immunantwort, der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten, die in entzündetes Gewebe einwandern (BANNERMAN et al. 2004).

Damit tragen sie auch zur Immunabwehr des Organs bei.

Die distalen, größeren Milchgänge sowie die Milchzisternen sind von zweischichtigem Epithel ausgekleidet und nicht mehr zur Sekretion fähig. Die Blut-Euter-Schranke, die eine Verbindung der äußeren Umgebung und dem Organparenchym darstellt, wird in den Alveolen von Epithel-, Myoepithelzellen, der Basalmembran und dem Gefäßendothel der Kapillaren gebildet (Abbildung 2).

Abbildung 2: Mikroanatomischer Aufbau der Alveolen (modifiziert nach LIEBICH 2004)

Die Zitze als Ausführungsöffnung des Mammakomplexes bildet die Schnittstelle mit der äußeren Umwelt. Anatomisch ist sie daher mit Schutzmechanismen zur äußeren Umgebung ausgestattet. Als motorischer Schutz fungieren zirkulär-spiralig angeordnete Muskelfaserbündel (Musculus sphincter papillae). Diese können zum aktiven Verschluss des Zitzenkanals beitragen und sind an der Zirkulation von Blut und

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Literatur

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Lymphe im Kapillarnetz beteiligt. Am Übergang von Zitzenzisterne und Strichkanal liegt die Fürstenberg’sche Rosette, die den Verschluss des Musculus sphincter papillae verstärkt, da ihre Schleimhautfalten dicht aufeinandergedrückt werden (MOSIMANN u. KOHLER 1990). Der Zitzenkanal selbst ist von einem mehrschichtigen Plattenepithel ausgekleidet, welches eine poröse und unregelmäßige Struktur aufweist und den Zitzenkanal passiv durch einen Keratinpfropf verschließen kann (RAINARD u. RIOLLET 2006). Durch die Struktur der Keratinschichten wird die Adsorption von Mikroorganismen im Zitzenkanal begünstigt und kann so einem laktogen-aszendierenden Eintrag von Mikroorganismen entgegenwirken. Zudem enthalten die Keratinschichten mehrere antiinfektive Substanzen (Phospholipide, kationische Proteine, freie Fettsäuren), die Mikroorganismen biochemisch abwehren sollen (TREECE et al. 1966; HIBBITT et al.

1969).

2.3.1. Mastitis des Rindes

Bei der Entzündung der Milchdrüse (Mastitis) handelt es sich um eine schmerzhafte und behandlungsintensive Erkrankung, die wirtschaftlich eine der wichtigsten Infektionskrankheiten bei Rindern darstellt (SEEGERS et al. 2003; HALASA et al.

2007; SCHUKKEN et al. 2011). Die Infektion findet in vielen Fällen laktogen über die Zitze statt (MIELKE u. SCHUTZ 1994). Häufige Pathogene für eine bovine Mastitis sind Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) (PETZL et al.

2018). Je nach Art des Erregers fällt das Krankheitsbild der bovinen Mastitis dabei unterschiedlich aus.

E. coli gehört als gram-negativer Erreger zur Spezies der Enterobacteriaceae. Dieser kommt als natürlicher Bewohner im Darm bei Mensch und Tier vor, kann aber auch pathogen wirken (JÄGER 2006). Bei hohem Keimdruck kann E. coli beispielsweise beim Melkvorgang auf das Euter gelangen, aufgenommen werden und eine intramammäre Infektion des Organs auslösen (BLOWEY u. EDMONDSON 2010). In der Regel wird durch diesen Erreger eine klinisch ausgeprägte Mastitis ausgelöst, die mit sichtbaren Veränderungen der Milch, Schwellungen des Euters und damit verbundenen Schmerzen für das Tier einhergeht. Des Weiteren kann es zu einem systemischen Entzündungssyndrom kommen, welches die Kuh stark beeinträchtigt.

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Literatur

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Die Tiere können Festliegen, Fieber, eine erhöhte Atemfrequenz, Pansenparese sowie Diarrhoe zeigen. Schließlich kann dies zum Tod des Tieres führen (BURVENICH et al.

2003). Im Krankheitsverlauf erfolgt eine massive Freisetzung von Endotoxinen (Lipopolysaccharide, LPS), die sich an den Zellwänden der gram-negativen Bakterien befinden (YU et al. 2017). LPS ist an der Zellwand mit einem lipophilen Membranmarker (Lipid A) verbunden, der nach außen einen hydrophilen Oligosaccharidarm führt. Durch Epithelzellen ausgeschüttete Zytokine und Chemokine rekrutieren neutrophile Granulozyten an den Ort der Entzündung und sollen dort die Vermehrung des Erregers unterdrücken (BURVENICH et al. 2003; BANNERMAN et al. 2004).

S. aureus ist ein gram-positiver Umweltkeim, der bei Mensch und Tier als Kommensale der Haut und Schleimhaut vorkommt (BHUNIA 2018). Die Infektion der Milchdrüse des Rindes mit diesem Keim ist häufig für eine subklinische Mastitis verantwortlich, die keine Entzündungszeichen des Euters aufweist, wodurch das Risiko der Ausbreitung in der Herde jedoch hoch ist. Die Elimination von S. aureus aus dem Eutergewebe ist schwierig, da die Bakterien in der Lage sind, sich an das Euterepithel zu binden, zu internalisieren, dadurch zu überleben und sich dann zu vermehren (ALEKSEEVA et al. 2013; BOUCHARD et al. 2013; PETON u. LE LOIR 2014). Dies führt zu einer hohen somatischen Zellzahl in der Milch, vermindert die Milchmenge und verringert ihre Qualität (PETZL et al. 2016; GÜNTHER et al. 2017). Immunstimulierende Wirkungen der gram-positiven Bakterien gehen unter anderem von Peptidoglykan, dem Hauptbestandteil der Zellwand, mit immunstimulierender Wirkung aus (CLEVELAND et al. 1996; ALMEIDA et al. 2018).

Mastitiden sind für das Tier schmerzhafte Krankheiten, die behandelt werden müssen, um den Tierschutz zu gewährleisten (§17 TierSchG). Eutererkrankungen werden weltweit zum Großteil mit Antibiotika behandelt (POL u. RUEGG 2007; VIORA et al.

2014; KUIPERS et al. 2016). Da die Heilungsraten dabei teilweise niedrig sind, Rückstände in die Milch gelangen und bakterielle Resistenzen gefördert werden können, ist ein Entwicklungsbedarf alternativer und innovativer Behandlungskonzepte dringend gegeben (POL u. RUEGG 2007; HALASA et al. 2009). So versuchten beispielsweise WALLIS et al. (2019) pathogene, durch S. aureus gebildete Biofilme

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Literatur

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durch protektive Biofilme von Laktobazillen zu zerstören und zu ersetzen, was in vitro auch erste Erfolge zeigte.

2.3.2. Immunkompetenz des Euters – Zelluläre Abwehrmechanismen

Die bovine Milchdrüse ist gegen äußere Pathogene durch das Zusammenspiel der angeborenen und adaptiven Immunabwehr geschützt.

Das angeborene Immunsystem ist als erste Verteidigungslinie dazu fähig, die frühen Stadien der Infektion zu erkennen und darauf zu reagieren (SORDILLO et al. 1997;

HOFFMANN et al. 1999). Das adaptive Immunsystem reagiert dagegen langsamer auf neue Infektionserreger (STELWAGEN et al. 2009), schützt das Euter aber effektiver gegen bereits bekannte Pathogene (RIOLLET et al. 2002). Im weiteren Verlauf wird in Bezug auf die Thematik dieser Arbeit auf das angeborene Immunsystem eingegangen.

Durch mehrere intrazelluläre Signalkaskaden kommt es zu einer akuten Hochregulation der angeborenen Immunabwehr und damit zu einer vermehrten Freisetzung von Mediatoren, beispielsweise von Adhäsionsmolekülen und Zytokinen (BANNERMAN et al. 2004; AKIRA et al. 2006). Ein Teil des angeborenen Immunsystems stellen Makrophagen dar. Als im Blut befindliche Monozyten wandern diese in fast alle Gewebe des Körpers ein und differenzieren zu großen, einkernigen Makrophagen. Sie stellen die größte Immunzellpopulation in der gesunden bovinen Milchdrüse dar (DÜVEL 2010). Makrophagen sind in der Lage, Pathogene, die über Toll-like-, CD 14-, Mannose- und Scavenger-Rezeptoren erkannt werden, zu phagozytieren und diese als antigen-präsentierende Zellen zu präsentieren (RAINARD u. RIOLLET 2006). Nachdem pathogene Bestandteile erkannt sind, setzen die Zellen proinflammatorische und zytotoxische Stoffe frei (PAAPE et al. 2003). Die freigesetzten Chemokine lassen polymorphkernige neutrophile Granulozyten in die Milchdrüse einwandern, weshalb diese bei einer Mastitis die vorherrschende Zellpopulation im entzündeten Gewebe darstellen (PAAPE et al. 2003). Auch die eingewanderten Zellen sind in der Lage, Pathogene zu phagozytieren. PAAPE et al.

(2003) stellten heraus, dass die Phagozytose durch neutrophile Granulozyten die effektivste Abwehr gegen bakterielle Infektionserreger im Euter seien. Die Schwere und die Dauer einer Mastitis ist von der Anzahl und Aktivität der eingewanderten

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Literatur

14

neutrophilen Granulozyten abhängig (RAINARD u. RIOLLET 2006). Weitere Zelltypen des angeborenen Immunsystems stellen die B- und T-Lymphozyten dar.

B-Lymphozyten können die Erreger über membranständige Antikörper erkennen, verarbeiten und über antigene Epitope und MHC-II (major histocompatibility complex II) den T-Helferzellen präsentieren. T-Lymphozyten können dann wiederum B-Lymphozyten zur Proliferation anregen, die sich zu antikörperpräsentierenden Plasmazellen oder Gedächtniszellen differenzieren (SORDILLO et al. 1997). Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten, deren Anzahl und Verteilung im Gewebe vom Laktationsstadium abhängt (SHAFER-WEAVER u. SORDILLO 1997), stellen B-Lymphozyten trotz des Laktationsstadiums und dem Fortschreiten der Infektion einen relativ konstanten Anteil der präsenten Zellen dar (RIOLLET et al. 2002; PAAPE et al. 2003). Für die Elimination intrazellulärer Antigene sind auch natürliche Killerzellen von Bedeutung. Allerdings ist ihre immunregulatorische Funktion im Euter nicht hinreichend geklärt (HOEK et al. 2009).

Studien von SHAFER-WEAVER u. SORDILLO (1996) haben jedoch gezeigt, dass natürliche Killerzellen die Fähigkeit haben, gram-positive sowie gram-negative Bakterien abzutöten.

2.3.3. Entzündungsmediatoren

Zytokine sind wasserlösliche, regulatorische Proteine, die während eines entzündlichen Prozesses freigesetzt werden. Sie haben eine hohe Affinität zu ihren Rezeptoren und sind daher in der Lage, bereits bei Konzentrationen im femtomolaren Bereich biologische Reaktionen auszulösen (HALL et al. 1989). Sie rekrutieren zirkulierende Leukozyten zum Ort der Entzündung, wo diese die eingedrungenen Erreger eliminieren können. Zytokine und Chemokine interagieren während eines Entzündungsprozesses in einem komplexen System und können als Stimulatoren und Inhibitoren das Entzündungsgeschehen beeinflussen. Je nach Zelltyp und Interaktion mit anderen Zytokinen variiert dabei das Spektrum der induzierten Gene (GOUWY et al. 2005). Hauptgruppen der Zytokine sind die Interferone, Interleukine, kolonie-stimulierende Faktoren und Tumornekrosefaktoren (SORDILLO u.

STREICHER 2002). Im Folgenden wird auf die Zytokine Interleukin-1ß (IL-1ß), Interleukin-6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) sowie den

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Literatur

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Entzündungsmediator Prostaglandin E2 (PGE2) eingegangen, die in eigenen Untersuchungen gemessen wurden.

IL-1ß gehört zu den proinflammatorischen Zytokinen und kann durch Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, Endothel- und Epithelzellen sowie Fibroblasten freigesetzt werden (BARKSBY et al. 2007) Dies geschieht, wenn die Zellen beispielsweise mit viralen, parasitären oder bakteriellen Stimuli konfrontiert werden.

Auch eine erhöhte Konzentration von TNF-α, IL-12 führt zur Sezernierung von IL-1ß.

Die Produktion anderer Zytokine kann durch IL-1ß induziert werden, wie zum Beispiel TNF-α und IL-6. Dadurch wird wiederum seine eigene Produktion autokrin und parakrin verstärkt, aber auch seine Wirkung durch die Ausschüttung der anderen Zytokine verstärkt (BANNERMAN 2009). Durch IL-1ß werden das Gefäßendothel und Lymphozyten aktiviert, was zur verbesserten Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten beiträgt. Außerdem vermitteln sie die Produktion von Akuten- Phase-Proteinen und wirken pyrogen (PRUITT u. MOLDAWER 1995; DINARELLO 1996).

IL-6 wird unter anderem von Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, neutrophilen Granulozyten sowie Endothelzellen sezerniert. Der Stimulus hierfür kann von Viren oder Bakterien, aber auch von IL-1ß sowie TNF-α ausgehen (LOWRY 1995; BIFFL et al. 1996). Es zählt zu den pro- sowie antiinflammatorisch wirksamen Zytokinen. Durch die Ausschüttung von IL-6 kommt es zu einer Hemmung der IL-1ß-sowie der TNF-α-Freisetzung. So wirkt es entzündungshemmend. IL-6 ist außerdem an der Aktivierung der Akuten-Phase-Proteine beteiligt und wirkt zudem pyrogen (MOSHAGE 1997).

Makrophagen, polymorphkernige neutrophile Granulozyten und Epithelzellen sind in der Lage, TNF-α zu sezernieren (ANGELINI et al. 2005). Lokal bewirkt TNF-α die Aktivierung von Endothelzellen und die Rekrutierung von Leukozyten zum Ort der Entzündung (BROUCKAERT u. FIERS 1996). Zu den systemischen Effekten von TNF- α gehören die Einleitung von Fieber und die Steigerung der Proteinsynthese der Akuten-Phase-Proteine. Obwohl diese lokalen und systemischen Effekte für die angeborene Immunabwehr des Wirtes gegen Infektionen von Vorteil sind, ist TNF-α

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Literatur

16

mit gesteigerten Entzündungsreaktionen verbunden. Insbesondere hat sich gezeigt, dass TNF-α einen Schock, Gewebeschäden, Gefäßleckagen, Multiorganversagen und dysregulierte Koagulopathie verursachen kann (TRACEY u. CERAMI 1994; LOWRY 1995).

PGE2 gehört zu den Eicosanoiden, welche aus der gemeinsamen Vorstufe, der Arachidonsäure gebildet werden. Dies geschieht durch Cyclooxigenasen (COX), Enzyme mit zwei katalytischen Aktivitäten. Unter physiologischen Bedingungen kommt es zum Beispiel in den Endothelien, der Magenschleimhaut und der Niere zur Aktivierung von COX-1 und wirkt dort antithrombogen, zytoprotektiv oder steigert die renale Durchblutung (MONCADA et al. 1976; WHITTLE 1980). Durch die Freisetzung von Zytokinen durch Entzündungsreize wird die COX-2-Synthese in Zellen, wie beispielsweise Makrophagen induziert, was im Weiteren zur Freisetzung von Prostaglandinen führt (Abbildung 3). Über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren kann PGE2 seine proinflammatorische Wirkung entfalten. Es wirkt zum Beispiel am Hypothalamus und induziert Fieber. TAJIMA et al. (2008) zeigten, dass durch LPS, induziert in der frühen Phase des Infektionsgeschehens, eine Hochregulation der mRNA-Expression von COX-2 stattfindet und dadurch der Gehalt an PGE2 und PGD2

steigt.

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Literatur

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Abbildung 3: Zusammenhang der Bildung von Eicosanoiden durch COX-1 und COX-2 unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen (modifiziert nach MITCHELL et al. 1993)

physiologischer Stimulus

pathophysiologischer Stimulus

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Literatur

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2.4. Bisherige In-vitro-Methoden zur Untersuchung der bovinen Milchdrüse

EBNER et al. (1961) gelang es, aus kultiviertem bovinen Drüsengewebe Epithelzellen auswachsen zu lassen und deren Wachstum zu charakterisieren. Die Kultivierung von primären bovinen Eutergewebszellen wurde von MACKENZIE et al. (1982) entwickelt.

Seitdem haben Studien die Abläufe der Laktationsphysiologie, die Funktion der einzelnen Zellpopulationen oder auch immunologische Vorgänge anhand primärer Euterepithelzellen untersucht (HU et al. 2009; GÜNTHER et al. 2011; JEDRZEJCZAK u. SZATKOWSKA 2014; WELLNITZ et al. 2016; GÜNTHER et al. 2017).

HUYNH et al. (1991) etablierten eine immortalisierte Zelllinie von Euterepithelzellen (Mammary Alveolar Cell-Large T-antigen, MAC-T). Dazu wurden Plasmide des Simian Virus-40 (SV-40) in das Genom der Zellen eingebracht. Dies machte es möglich, morphologische und physiologische Eigenschaften der bovinen Euterepithelzellen in einer Zelllinie zu untersuchen. Im Laufe der Jahre wurde diese Zelllinie vorrangig dazu genutzt, den Einfluss verschiedener Wachstumshormone und die Interaktion der Zellen mit Pathogenen zu untersuchen (ZHOU et al. 2008; ALMEIDA et al. 2018). Je nach Fragestellung kann eine andere Zelllinie boviner Euterepithelzellen mit spezifischen Eigenschaften genutzt werden. So untersuchten ZAVIZION et al. (1996) anhand der Zelllinie BME-UV die Proliferation und Differenzierung von Milchdrüsenepithelzellen.

Im Zellverband wurden Untersuchungen zu physiologischen sowie pathophysiologischen Fragestellungen des Euters bisher größtenteils an Explantatkulturen durchgeführt. Dabei wurde das zu kultivierende Gewebe zumeist von Hand mit einer Schere oder einem Skalpell gewonnen, wobei die Größe der einzelnen Explantate stark variieren konnten (BACH et al. 1996; MAGRO et al. 2017).

MAGRO et al. (2017) generierten dabei Eutergewebestücke einer Größe von 2 mm³ mit einem Skalpell und stimulierten sie mit LPS, LTA und S. aureus. Die Ergebnisse zeigten, dass die Stimulation des präparierten Gewebes mit LPS und S. aureus zu einem signifikanten Anstieg der IL-6-Konzentration im Gegensatz zur Kontrolle führte.

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Literatur

19

2.5. Zielsetzung der Arbeit

Thema dieser Arbeit war es, ein In-vitro-Modell zu etablieren, um das frühe Infektionsgeschehen einer bakteriell bedingten bovinen Mastitis untersuchen und den Einfluss verschiedener, pharmakologisch wirksamer Arzneimittel betrachten zu können. Das Modell soll dazu beitragen, alternative Therapieansätze zu entwickeln, dadurch den Einsatz von Antibiotika zur Behandlung der bovinen Mastitis zu verringern und zusätzlich zur Reduzierung von Tierversuchen genutzt werden. In den vergangenen Jahrzehnten konnte die Entwicklung verschiedener In-vitro-Modelle zeigen, dass diese in verschiedensten Untersuchungen zur Erkenntnisgewinnung genutzt werden können.

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Material und Methoden

20

3. Material und Methoden 3.1. Material

3.1.1. Chemikalien

Aceton Sigma-Aldrich, Steinheim

Bovine Serum Albumin (BSA) Fraktion V IgG frei

Sigma-Aldrich, Steinheim

Calciumchlorid-Dihydrat Merck KgAa, Darmstadt

D-Glukose-Monohydrat Merck KgAa, Darmstadt

Entellan^® Merck KgAa, Darmstadt

Eosin G Merck KgAa, Darmstadt

Ethanol CG Chemikalien, Laatzen

Essigsäure 0,1 % AppliCem GmbH, Darmstadt

Isopropanol Sigma, Steinheim

Kaliumdihydrogenphosphat Merck KgAa, Darmstadt

Kaliumchlorid Merck KgAa, Darmstadt

Magnesiumchlorid-Hexahydrat Merck KgAa, Darmstadt

Methanol (ultra-Gradient HPLC Grade) J.T. Baker, Avanter Performance Materials Poland S.A., Gliwice, Polen

Meyers Hämalaun-Lösung Merck KgAa, Darmstadt

Natriumchlorid Merck KgAa, Darmstadt

Saccharose Merck KgAa, Darmstadt

Salzsäure (rauchend 37 %) EMSURE^® Merck KgAa, Darmstadt

Schwefelsäure 2N H2SO4 Merck KgAa, Darmstadt

Tris-HCl Merck KgAa, Darmstadt

Triton^® X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim

Trypanblau Sigma-Aldrich, Steinheim

Xylol VWR VWR International GmbH,

Hannover

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21 3.1.2. Geräte

Autoklav Schlumbohm Medizin-Labor-

Technologie GmbH, Hamburg Brutschrank Hera Cell 150 Thermo Fisher, Braunschweig

Dermatom Zimmer U.K. Ltd., Swindon, United

Kingdom

Feinwaage Sartorius Lab Instruments GmbH Et.

Co.KG, Göttingen

Gefrierschrank Bauknecht, Stuttgart

Hybridisierungsinkubator 7601 GFL Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel

Magnetrührgerät MR 3001 k OMNILAB, Gehrden Invers-Mikroskop Axiovert 25 Zeiss, Jena

Kühlschrank Liebherr Comfort, Biberach an der Riß

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide Sigma-Aldrich, Steinheim

Orbitalshaker SO3 Stuart Scientific, Stone, United Kingdom Paraffin-Streckbad GFL Jürgens Zeiss, Jena

Photometer Microplatereader MRX Dynatech, Denkendorf

pH-Meter: pH 320 WTW, Weilheim

Pipetten (0,5–10 µl, 10–100 µl, 100–1000 µl, 1000–5000 µl)

Eppendorf, Hamburg Sterilbank (TL-2248) Heraeus Laminar

Air

Heraeus, Waltham, USA

Thermoplatte (OTS 40) Medite Medizintechnik, Burgdorf

Vortex: Reax top Heidolph, Schwabach

Waage Scaltec OMNILAB, Gehrden

Waschpipette Eppendorf, Hamburg

Wasserbad WNB, Memmert, Schwabach

WPA CO8000 Cell Density Meter Biochrom, Cambridge, United Kingdom

(32)

22 3.1.3. Allgemeine Materialien

Alufolie Roth, Karlsruhe

Biopsie-Stanze (6 mm) Pfm Produkte für die Medizin AG, Köln Chirurgisches Einmal-Skalpell Größe 10 Braun Aesculap AG, Tuttlingen

Deckgläschen Roth, Karlsruhe

Dermatomklinge Zimmer United Kingdom Ltd.,

Swindon, United Kingdom

Faltenfilter 150 mm Whatman, Dassel

Falcon (15 ml und 50 ml) Greiner Bio-One, Frickenhausen

Küvetten Roth, Karlsruhe

Küvettenhalter Roth, Karlsruhe

Messschieber (Pocket Thickness Gage) Mitutoyo Deutschland GmbH, Neuss Mikrotiterplatte (96 Well, Vitalitäts-Test) Sarstedt, Nümbrecht

Mikrotom-Klinge (S 35) Feather, Japan

Multiwellplatten (24, 96-Well) Greiner Bio-One, Frickenhausen

Objektträger Carl Roth GmbH + Co.KG,

Braunschweig Petrischale (60 mm) SPL Life Sciences,

Pinzette, chirurgisch und anatomisch Hauptner Instrumente GmbH, Dietlikon, Schweiz

Pipettenspitzen (0,5–10 µl, 10–100 µl, 100–1000 µl, 1000–5000 µl)

Eppendorf, Hamburg Reaktionsgefäße (1,5 ml) Eppendorf, Hamburg

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23

3.1.4. Materialien aus dem Labor der Sicherheitsstufe 2

Bunsenbrenner Fuego SCS basic RF WLD-TEC GmbH, Göttingen

Densimatengefäß Kimble Chase, New Jersey, USA

Einweg-Impfösen VWR International GmbH, Hannover

Pipetten (0,5–10 µl, 10–100 µl, 100–1000 µl, 1000–5000 µl)

VWR International GmbH, Hannover RapID^™ ONE System Remel Europe Ltd., Kansas, USA RapID^™ STAPH PLUS System, Remel Europe Ltd., Kansas,USA Spatel T-Form, steril/s VWR International GmbH, Hannover Vernichtungsbeutel 400 x 780 mm Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht Wattestäbchen, Holz, 15 cm, steril Heinz Herenz Medizinbedarf GmbH,

Hamburg

3.1.5. Verwendete Agar und Bouillon

Columbia-Agar mit 7 % Schafblut Oxoid Deutschland GmbH, Wesel Brain-Heart-Infusion-Bouillon Oxoid Deutschland GmbH, Wesel

LB-Medium Sifin Institut für Immunpräparate und

Nährmedium GmbH, Berlin

3.1.6. Verwendete Medien, Antibiotika und Zusätze

Amphotericin B (250 µg/ml) PAA, Laboratories GmbH, Pasching Fetales Kälberserum

(Superior; FKS)

Biochrom AG, Berlin

Gentamicin (10 mg/ml) PAA Laboratories GmbH, Pasching Penicillin/Streptomycin

(10 mg/ml)

Merck Biochrom GmbH, Berlin RPMI-1640 Medium Merck Biochrom GmbH, Berlin

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24

3.1.7. Zusammensetzung der Medien, Puffer und Lösungen

PBS; sterilisiert 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l NaPO4, 0,2 g/l KH2PO4

 in Aqua bidest., pH 7,4 mit HCl/ NaOH

Haltungsmedium RPMI-1640 Medium + 10 % Fetales Kälberserum + 1 % Amphotericin B + 1 % Penicillin/Streptomycin + 15 µg/ml Gentamicin

Nährmedium RPMI-1640 Medium + 10 % Fetales Kälberserum

3.1.8. Verwendete Bakterienstämme Referenzkeim,

Staphyloccocus aureus ATCC^29213

American Type Culture Collection, Manasses, USA

Klinisches Mastitisisolat, Staphyloccocus aureus Rd5

Abteilung Biochemie des Forschungszentrums für neu

auftretende Infektionen und Zoonosen (RIZ), Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover Referenzkeim,

Escherichia coli ATCC^25922

American Type Culture Collection, Manasses, USA

Klinisches

Mastitisisolat Escherichia coli 4520/11/18

Diagnostische Abteilung des Instituts für Mikrobiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

3.1.9. Verwendete Arzneimittel

Florfenicol Cayman Chemical Company, Ann

Arbor, USA

Meloxicam Cayman Chemical Company, Ann

Arbor, USA Pyrilamine maleate salt (Mepyramine

maleate)

Sigma-Aldrich, Steinheim

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25 3.1.10. ELISA

Bovine Interleukin 1 beta Reagent Kit

Invitrogen, Thermo Fisher Scientific,

Bovine IL-6 DuoSet^® ELISA DuoSet^® ELISA Development Systems, R&D Systems, Minneapolis, USA

Prostaglandine E2 Express ELISA Kit

Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA Bovine TNF-alpha DuoSet^®

ELISA

DuoSet^® ELISA Development Systems, R&D Systems, Minneapolis, USA

3.1.11. Vitalitätstest

Ameisensäure-Propanol-Lösung 5 % Ameisensäure, 95 % Propanol MTT-Lösung (50 mg MTT) 14 mg 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyl-terazolium Bromid in 2 ml TKM-Puffer lösen

in 18 ml Haltungsmedium überführen

TKM-Puffer 6,08 g/l TRIS-HCl,

85,576 g/l Saccharose, 1,86 g/l KCl, 1,018 g/l MgCl2 *6H2O

in Aqua bidest., pH 7,6 mit NaOH

3.1.12. Stimulanzien

Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4

Sigma-Aldrich, Steinheim Lipopolysaccharides from Escherichia coli

O55:B5

Sigma-Aldrich, Steinheim Peptidoglykan Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich, Steinheim

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3.2. Methoden

3.2.1. Versuchsübersicht

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Versuchsmodells zur Untersuchung des frühen Infektionsgeschehens einer bakteriell bedingten bovinen Mastitis sowie deren Beeinflussung mit verschiedenen pharmakologisch wirksamen Substanzen – letztlich, um dazu beizutragen, eine Verringerung des Einsatzes von Antibiotika zur Behandlung der bovinen Mastitis zu erreichen.

Diese Zielsetzung bedingte die folgenden Arbeitsschritte dieser Dissertation:

1. Gewinnung boviner Euterpräzisionsschnitte 2. Vitalitätstest der Euterpräzisionsschnitte

3. Histologische Untersuchung der Euterpräzisionsschnitte 4. Stimulation der Euterpräzisionsschnitte

5. Infektionsversuche an den Euterpräzisionsschnitten mit S. aureus- und E. coli-Stämmen

6. Untersuchung des Einflusses von Testsubstanzen auf das Infektionsgeschehen 7. Untersuchung der Probenüberstände auf die Freisetzung von

Immunmediatoren mittels ELISA 3.2.2. Herkunft des Probenmaterials

Das Material zur Gewinnung der Euterpräzisionsschnitte stammte von Eutern von Schlachtrindern des Schlachthofes in Minden-Lübbecke. Die Eutergesundheit wurde noch vor Ort mittels Adspektion des Organs sowie der ermelkbaren Milch und durch Palpation des Euters ermittelt. Zum Schlachtzeitpunkt befanden sich die Euter in unterschiedlichen Laktationsstadien. Die für gesund befundenen Organe wurden mit einer heparinisierten Tyrode-Lösung gespült und auf direktem Weg in das Labor des Instituts transportiert. Die Generierung der Euterpräzisionsschnitte (precision cut bovine udder slices, PCBUS) startete ca. 4 Stunden nach der Schlachtung.

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27

3.2.3. Gewinnung der PCBUS mittels Dermatom

Nach Eintreffen des Euters im Labor wurde mit der ermelkbaren Milch jedes Euterviertels der CMT zur Ermittlung der Zellzahl durchgeführt. Aus einem für gesund befundenen Euterviertel wurde mittels steriler Skalpellklinge ein ca. 10 x 10 x 3 cm großer Bereich aus dem Drüsengewebe geschnitten. Dabei wurde darauf geachtet, dass in dem Gewebe möglichst wenige, kleine Milchgänge sowie Gefäße verliefen und das herauspräparierte Gewebe ebenmäßig war.

Das Dermatom wurde auf eine Schnittdicke von 250 µm eingestellt und mit mäßigem Druck über das herauspräparierte, auf einer Platte fixierte Drüsengewebe geführt. Das dermatomisierte Gewebe wurde mit einer atraumatischen Pinzette behutsam in ein mit ca. 25 ml sterilem Phosphat-Puffer (PBS; pH=7,4) gefülltes Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wurden die gewonnenen Schnitte in einer Sterilwerkbank in eine Petrischale mit ca. 5 ml sterilem PBS verbracht, um daraufhin in weitere saubere Petrischalen überführt und erneut mit 5 ml sterilem PBS gewaschen zu werden. Dieser Vorgang wurde so oft wiederholt, bis keine Milch mehr aus den Schnitten austrat und der Phosphatpuffer klar blieb. Dafür waren in der Regel 4–6 Waschschritte nötig.

Sobald das gewünschte Ergebnis erreicht wurde, konnten die Schnitte in einer neuen Petrischale flach ausgebreitet und mit Hilfe von Biopsiestanzen (6 mm) in kleine, gleich große Stücke verarbeitet werden (Abbildung 4).

Aus einem Euterviertel lassen sich durch diese Methode über 100 PCBUS generieren.

Abbildung 4: a) Drüsengewebe des Euters nach dem Dermatomisieren mit einer Schichtdicke von 250 µm in einer Petrischale mit sterilem PBS; b) Drüsengewebe nach dem Ausstanzen; c) gewonnene PCBUS mit einem Durchmesser von 6 mm

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28

Die Euterpräzisionsschnitte wurden anschließend in eine 24-Multiwellplatte überführt und mit 500 µl einer Antibiotika-Waschlösung für 15 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei 130 Umdrehungen/Minute inkubiert. In zwei weiteren Waschschritten wurde die Antibiotika-Waschlösung aus der 24-Multiwellplatte abgenommen und erneut 500 µl Antibiotika-Waschlösung hinzugegeben. Anschließend wurde diese Waschlösung verworfen, woraufhin zwei Waschgänge mit 500 µl Haltungsmedium für 10 Minuten durchgeführt wurden. Die Kultivierung der PCBUS erfolgte in einer neuen 24-Multiwellplatte mit 1000 µl Haltungsmedium im Brutschrank bei 37°C und mit 5 % CO2-Begasung.

3.2.4. Vitalitätsbestimmung der PCBUS mittels MTT-Assay

Der erste Mediumwechsel nach Generierung der PCBUS erfolgte nach 24 Stunden.

Alle weiteren Wechsel folgten im Abstand von 48 Stunden. Eine Kontrolle der Vitalität fand mittels MTT-Assay statt, durch welchen sich der Vitalitätszustand der PCBUS über die Zeit des Versuchs ermitteln ließ.Der MTT-Assay wurde in modifizierter Form in Anlehnung an das Protokoll nach LAMBERMONT et al. (2014) durchgeführt. Dazu wurde die MTT-Substanz in TKM-Puffer gelöst und in einem Verhältnis von 1:10 mit dem Haltungsmedium der PCBUS verdünnt. In je ein Well einer 24-Multiwellplatte wurde ein Euterpräzisionsschnitt gegeben und für 15 Minuten auf dem Orbitalschüttler bei 130 Umdrehungen/Minuten in 1000 µl der MTT-Lösung inkubiert. In vitalen Zellen wird der gelbe Farbstoff durch mitochondriale Dehydrogenasen in Formazan (blau) reduziert. Nach Abnehmen des Überstandes wurden 200 µl Ameisensäure-Propanol-Lösung hinzugefügt, in der die PCBUS für weitere 40 Minuten auf dem Orbitalschüttler inkubierten. So wird das Formazan in Lösung gebracht. Die Lösungen wurden in beiden Arbeitsschritten vor Licht geschützt und die Inkubation im Dunkeln vorgenommen. Nach 40 Minuten wurden 100 µl pro Well entnommen und in je ein Well einer 96-Multiwellplatte überführt. Die Extinktion wurde mit einem Photometer bei 570 nm gemessen (Abbildung 5).Um den Effekt einer Vitalitätsabnahme der Zellen darzustellen, wurden einige PCBUS 30 Minuten vor der Durchführung des MTT-Assay in 1000 µl Triton^®-X 100 bei 37°C und 5 % CO2- Begasung inkubiert. Diese konnten dann als Negativkontrolle dienen. Der MTT-Assay wurde bis zur Beendigung jedes Versuchs täglich im Fünffachansatz durchgeführt. Alle

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29

PCBUS wurden direkt im Anschluss an das Experiment durch das Drücken auf ein Papiertuch von Flüssigkeit befreit und deren Gewicht mit einer Feinwaage bestimmt, um in späteren Experimenten die Ergebnisse auf das jeweilige Gewicht der untersuchten PCBUS beziehen zu können.

Abbildung 5: a) PCBUS nach der 15-minütigen Inkubation mit der MTT-Lösung; b) nach 40-minütiger Inkubation mit der Ameisensäure-Propanol-Lösung; c) 100 µl des Überstandes in einer 96-Multiwellplatte zur Bestimmung der optischen Dichte durch ein Photometer

3.2.5. Überprüfung auf Verkeimung

Zur Überprüfung des Erfolges der Waschschritte bei der Gewinnung der PCBUS aus dem Eutergewebe des Schlachthofes wurde jeweils nach 48 und 96 Stunden eine mikrobiologische Untersuchung durchgeführt. Hierzu wurden 100 µl des Haltungsmediums aus unterschiedlichen Wells auf einem Columbia-Agar mit Schafblut (7 %) ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Der untersuchte Überstand wurde dann als frei von Kontaminationen angesehen, wenn sich kein bakterielles Wachstum gezeigt hatte. Wenn eine Verkeimung der PCBUS vorlag, wurden diese nicht für Versuche verwendet.

3.2.6. Histologische Untersuchung der PCBUS

Die histologische Untersuchung der PCBUS wurde durchgeführt, um die physiologische und pathophysiologische Morphologie beurteilen, Dickenmessungen durchführen und die Adhäsion der zugesetzten Bakterien untersuchen zu können. Es erfolgten eine HE- sowie eine Gram-Färbung. Die Einbettung der PCBUS in Paraffin erfolgte im Anatomischen Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Gram-Färbung wurde von mir mit Unterstützung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover umgesetzt. Die Herstellung der Paraffinschnitte mittels Mikrotom, die HE-Färbung und die Beurteilung der hergestellten histologischen Schnitte wurde von mir im hiesigen Institut durchgeführt.

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30

Nach Infektionsversuchen wurden die PCBUS, welche sowohl mit den E. coli-Stämmen ATCC^® 25992 und 4520/11/45 als auch mit den S. aureus-Stämmen ATCC^® 29213 und Rd5 infiziert worden waren, in eine 48-Wellplatte mit 1 ml 10 %-igen Formalin gegeben, in welchem die PCBUS 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubierten. Die fixierten PCBUS wurden nach einem Standardprotokoll fixiert und in Paraffinblöcke gegossen.

Um die PCBUS für die Dickenmessung einzubetten, wurden diese hochkant in die Einbettschale gestellt. Dabei war es besonders wichtig, dass sie im 90°-Winkel zum Boden standen, um im späteren Verlauf eine zuverlässige Dickenmessung durchführen zu können. Die übrigen PCBUS konnten parallel zum Boden der Einbettschale gelegt werden.

3.2.6.1. Herstellung der Paraffinschnitte mittels Mikrotom

Die in Paraffin eingebetteten PCBUS wurden vor dem Schneiden in den Kühlschrank gelegt und bei 4°C über mindestens 30 Minuten gekühlt. Während dieser Zeit wurde die Klinge des Mikrotoms eingespannt und auf einen Schnittwinkel von 0° eingestellt.

So wurden Paraffinschnitte mit einer Dicke von 4 µm geschnitten.

Nach dem Schneiden wurden die Paraffinschnitte in einem Wasserbad bei 35°C gestreckt, aus diesem durch das Aufziehen auf einen Objektträger herausgeholt und auf einer Thermoplatte bei 40°C getrocknet.

3.2.6.2. Hämatoxylin-Eosin- und Gram-Färbung

Nach dem Trocknen der Paraffinschnitte auf dem Objektträger wurden diese über Nacht bei 60°C inkubiert. Eine Übersicht der Arbeitsschritte der HE-Färbung ist Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 2 zeigt die Schritte der Gram-Färbung auf.

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31

Tabelle 1: Durchführungsschema für die HE-Färbung von Mikrotomschnitten

Schritt Lösung Dauer Vorgang

1 Xylol 2 Minuten Entparaffinieren

3 Ethanol 100 % 2 Minuten Wässern

7 destilliertes Wasser 5 Minuten Wässern

8 filtriertes Hämalaun 8 Minuten Färben

9 salzsaurer Alkohol 2 Sekunden Färbung abstoppen

10 warmes Leitungswasser 5 Minuten Auswaschen

11 Eosin 2 Minuten Färben

12 warmes Leitungswasser 30 Sekunden Auswaschen

13 Ethanol 70 % 20 Sekunden Entwässern

17 Xylol 2 Minuten Entwässern

18 Xylol 2 Minuten Entwässern

19 Entellan^® bis zur Trockenheit Eindecken

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32

Tabelle 2: Durchführungsschema für die Gram-Färbung von Mikrotomschnitten

Schritt Lösung Dauer Vorgang

7 destilliertes Wasser 5 Minuten Wässern

8 Karbolgentiaviolett 3 Minuten Färben

9 Lugol´sche Lösung 2 Minuten Färben

10 konzentrierter Ethylalkohol 1 Minuten Auswaschen

11 Verdünntes Fuchsin 15 Sekunden Gegenfärben

12 warmes Leitungswasser 30 Sekunden Auswaschen

13 Trockenblock 20 Sekunden Trocknung

14 Entellan bis zur Trockenheit Eindecken

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33 3.2.7. Stimulation der PCBUS

Um zu überprüfen, ob die Zellen der generierten PCBUS auf äußere Reize reagieren, wurden sie mit verschiedenen Substanzen stimuliert. Dies geschah im Rahmen von Vorversuchen mit je drei PCBUS von zwei Eutern.

24 Stunden vor der Durchführung des Stimulationsversuchs wurde das Haltungsmedium durch ein Nährmedium (RPMI-1640 Medium mit 10 % FKS) ersetzt, welches keine antimikrobiellen Wirkstoffe enthielt. Die Stimulation der PCBUS erfolgte mit LPS (O111:B4), PGN (Staphylococcus aureus) und einer Kombination beider Substanzen. Als Kontrolle dienten PCBUS, die in Nährmedium ohne Zusatz der oben genannten Stimulanzien inkubierten (Tabelle 3). Jede Substanz wurde auf vier PCBUS gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurde das Stimulationsmedium abgenommen und in einem Reaktionsgefäß gesichert. Danach wurden die PCBUS erneut stimuliert, so dass weitere Probengewinnungen nach 3 und 6 Stunden durchgeführt werden konnten. Alle generierten Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung lichtgeschützt bei –20°C gelagert. Auch hier wurde im Anschluss das Gewicht der PCBUS nach Flüssigkeitsentzug bestimmt.

Tabelle 3: Stimulationsansätze für die PCBUS

Stimulanz Konzentration

LPS (O111:B4) 1 µg/ml

PGN S. aureus 1 µg/ml

Kombination LPS:PGN (50:50) 1 µg/ml LPS (O111 B4) +1 µg/ml PGN

Kontrolle RPMI-1640 Medium + 10 % FKS

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34 3.2.8. Infektionsversuch mit den PCBUS

Bei dem Infektionsversuch wurden die PCBUS 24 Stunden in einem dem Stimulationsversuch (s. Kapitel 3.2.7) ähnlichen Vorgang vor Beginn des Experiments von einem antibiotikahaltigen auf ein antibiotikafreies Haltungsmedium überführt.

Zusätzlich wurden die PCBUS bei diesem Versuchsaufbau mit sterilem PBS gewaschen und in eine neue 24-Wellplatte umgesetzt, um Rückstände antimikrobiell wirksamer Substanzen zu vermeiden. Nach 24 Stunden wurde zur Überprüfung möglicher Kontaminationen eine mikrobiologische Untersuchung (s. Kapitel 3.2.5) durchgeführt. Die Infektionsversuche wurden an Oktaplikaten von sechs Eutern durchgeführt.

3.2.8.1. Verwendete Bakterien 3.2.8.1.1 Staphylococcus aureus

Es wurden zwei S. aureus-Stämme verwendet. Ein Stamm war ein klinisches Feldisolat von einer an Mastitis erkrankten Kuh mit der Bezeichnung Rd5. Dieser wurde von dem Institut für Physiologische Chemie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bereitgestellt. Der andere stammte aus der American Type Culture Collection (ATCC^® 29213).

Um sicherzustellen, dass es sich bei den verwendeten Bakterien auch tatsächlich um S. aureus-Stämme handelte, wurde zur Identifikation eine Bunte Reihe (RapID™ STAPH PLUS System, Remel Europe Ltd., Kansas, USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Für die Infektion wurde Koloniematerial von einer Columbia-Agarplatte mit 7 % Schafblut mit einer sterilen Impföse entnommen und in Trypton-NaCl-Lösung gegeben. Diese wurde dann mittels Photometer auf einen McFarland-Standard von 0,5 (optische Dichte 0,08–0,1 bei 600 nm) eingestellt.

3.2.8.1.2 Escherichia coli

Der ATCC^25922 Stamm des E. coli lag dem hiesigen Institut bereits vor. Das klinischen Mastitisisolat 4520/11/18 des E. coli wurde von der diagnostischen Abteilung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.

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24 Stunden vor Versuchsstart wurden fraktionierte Ausstriche von den jeweiligen Bakterien auf Columbia-Agar mit 7 % Schafblut angefertigt und mittels Bunter Reihe verifiziert, dass es sich um E. coli handelte. Am Versuchstag wurde mit Hilfe einer sterilen Impföse Koloniematerial entnommen und in Trypton-NaCl-Lösung eingerührt.

Mittels eines Photometers konnte bei einer Wellenlänge von 600 nm die Suspension auf eine optische Dichte von 0,08 bis 0,1 eingestellt werden (McFarland-Standard von 0,5). Mit dieser Bakteriensuspension wurde dann der Infektionsversuch durchgeführt.

3.2.8.2. Durchführung des Infektionsversuchs

Am Versuchstag wurden die Schnitte in neue 24-Wellplatten transferiert und mit 500 µl Versuchsmedium inkubiert. In Oktaplikaten wurden die PCBUS eines Euterviertels des Versuchseuters mit den vier in 3.1.8 genannten Bakterienstämmen infiziert. Parallel dazu wurden je acht PCBUS auch mit LPS (O55:B5), PGN und einer Kombination aus beiden Substanzen stimuliert. Als Kontrolle wurden vier PCBUS über denselben Zeitraum (24 Stunden) in 500 µl Haltungsmedium inkubiert. Da die Konzentration der Bakterien in Trypton-NaCl eingestellt und in dieser Form auch auf die PCBUS gegeben wurde, liefen vier Mediumkontrollen mit entsprechender Zusetzung von Trypton-NaCl parallel mit. Der Versuchsaufbau sah vor, dass sich die 500 µl des Versuchsmediums wie im Folgenden beschrieben zusammensetzte: Die Bakteriensuspension des jeweiligen Stammes wurde mit Haltungsmedium verdünnt, so dass ein PCBUS mit einer Infektionsdosis von 2,5 x 10⁷ KBE beimpft wurde. Bei den Stimulationen wurden die gleichen Konzentrationen aufgetragen, wie in Kapitel 3.2.7 angegeben (Tabelle 4).

Um das Kontaminationsrisiko zwischen den Bakterien, aber auch zu den Stimulanzien und den Kontrollen zu minimieren, wurden die PCBUS, kategorisiert nach den jeweiligen Versuchsmedien, in unterschiedlichen 24-Wellplatten inkubiert (Abbildung 6).

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Tabelle 4: Zusammensetzung der Versuchsmedien

Volumen des Haltungsmediums

Volumen der

Zusätze Anzahl der

Ansätze 333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - E. coli

ATCC^® 25922 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - E. coli

4520/11/18 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - S. aureus

ATCC^® 29213 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - S. aureus

Rd5 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Trypton-NaCl 4

500 µl RPMI-1640 - 4

Wenn alle PCBUS mit dem entsprechenden Versuchsmedium versorgt waren, wurden die 24-Wellplatten über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO²-Begasung inkubiert. Der zeitliche Verlauf von der Gewinnung der PCBUS bis zum Versuchsende ist in Abbildung 7 zu sehen.

Tabelle 5 zeigt eine Übersicht über die gewonnenen Proben zu den jeweiligen Probenentnahmezeitpunkten. In kleinen Portionen wurden die Proben direkt nach der Gewinnung bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Überstände dienten im weiteren Verlauf dem Nachweis der Immunmediatoren IL-1ß, IL-6, PGE2 und TNF-α mittels des Enzyme linked immunosorbent assays (ELISA). Neben der Sicherung der Überstände wurden auch die infizierten PCBUS in 10 %-iges Formalin nach Lillie überführt und auf diese Weise für die Einbettung in Paraffinblöcke vorbereitet.