3. Material und Methoden
3.2. Methoden
3.2.8. Infektionsversuch mit den PCBUS
3.2.8.3. Untersuchung der Überstände auf das Vorhandensein von
Die Durchführung der ELISA erfolgte, je nach verwendetem Kit, nach den Angaben des Herstellers. Durch Vorversuche wurde die Verdünnung der Probenüberstände ermittelt, die nötig war, um ein auswertbares Ergebnis der Messung zu erhalten.
Daneben sollten auch die Zeitpunkte ermittelt werden, zu denen ein Anstieg der Konzentration des jeweiligen Immunmediators zu erwarten war.
Tabelle 7: Verdünnung der Proben und gewählte Zeitpunkte der ELISA der untersuchten Immunmediatoren; Untersuchung der Überstände des Infektionsversuchs (Kapitel 3.2.8.2)
Immenmediator Verdünnung des
Probenüberstandes Untersuchungszeitpunkte
IL-1ß 1:10 1, 4 und 6 Stunden
TNF-α unverdünnt 4, 6 und 24 Stunden
PGE2 1:10 1, 4 und 6 Stunden
Tabelle 8: Verdünnung der Proben und gewählte Zeitpunkte der ELISA der untersuchten Immunmediatoren; Untersuchung der Überstände des Infektionsversuchs mit Testsubstanzen (Kapitel 3.2.8.2.1)
Immenmediator Verdünnung des
Probenüberstandes Untersuchungszeitpunkte
IL-1ß 1:10 6 Stunden
IL-6 1:10 6 Stunden
Material und Methoden
42 3.2.8.4. Statistische Auswertung
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte mit Angabe der Mittelwerte (MW) ± der Standardabweichung (SD) bzw. über Boxplots und min/max Whiskers und Darstellung aller Einzelwerte. Die statistische Auswertung wurde mit dem Programm GraphPadPrism (Version 8.0.1, GraphPad Software, Inc.) durchgeführt. Bei den Versuchen wurden die Ergebnisse der Kontrollgruppen des jeweiligen Messzeitpunktes mit denen der infizierten/stimulierten Gruppe im Hinblick auf signifikante Unterschiede mithilfe des Kruskal-Wallis-Test verglichen.
Die Konzentrationsbestimmung der Zytokine erfolgte in pg oder ng pro ml und wurde nach Wiegen der getesteten PCBUS in pg oder ng pro PCBUS umgerechnet. Die Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % galt als signifikant, wobei in den Abbildungen Signifikanzen von ≤ 0,01 und ≤ 0,001 besonders gekennzeichnet sind.
Ergebnisse
43
4. Ergebnisse
4.1. Schneidetechnik
Die Schneidetechnik mittels Dermatom wurde im Rahmen einer Masterarbeit in der hiesigen Arbeitsgruppe von PETRY 2017 etabliert. Die Gewinnung und Kultivierbarkeit der PCBUS konnte durch Modifikationen der Waschschritte sowie Anpassung der Kultivierungsbedingungen optimiert werden. Dies wurde durch längere, zuverlässigere Inkubationszeiten möglich, was durch Vitalitätsparameter bestätigt werden konnte.
Dies machte die Generierung der PCBUS reproduzierbar.
4.2. Vitalitätsbestimmung der PCBUS mittels MTT-Assay
Zur Vitalitätsprüfung der generierten PCBUS wurde der MTT-Assay durchgeführt.
Abbildung 9 zeigt die Vitalität über den Zeitraum von 0 bis 13 Tagen. Eine Messung nach 10 Tagen wurde nicht durchgeführt. Die Negativkontrolle stellte ein 30-minütiger, durch Triton-X behandelter PCBUS dar. Nach Betrachtung dieser Ergebnisse wurde eine Grenze von 70 % der Vitalität im Vergleich zum Zeitpunkt 0 Stunden (6 Stunden nach Schlachtung) festgelegt. Daraus folgte, dass bei allen für Versuche eingeplanten PCBUS eine Vitalität von 70 % bis zum Ende des jeweiligen Versuchs gegeben sein musste. Die Ergebnisse wurden je an mindestens sieben PCBUS von 4 Eutern getestet.
Die Versuchsdauer betrug bei den durchgeführten Versuchen 96 Stunden. Über diesen Zeitraum wurde die Vitalität der PCBUS parallel untersucht. Für den MTT-Assay wurden dabei fünf PCBUS pro Durchführung verwendet. Abbildung 10 zeigt die Vitalität der PCBUS, welche für Infektionsversuche verwendet wurden. Dabei ist festzuhalten, dass die in den Versuch eingebundenen PCBUS zum Zeitpunkt des Versuchsendes eine Vitalität oberhalb von 70 % aufwiesen.
Ergebnisse
44
Abbildung 9: Durch einen MTT-Assay ermittelte Vitalitätsprofile der PCBUS Die gepunktete rote Linie markiert die Vitalitätsgrenze von 70 %. Der erste schwarze Balken stellt die Negativkontrolle dar. Vitalitätsprofil je mindestens 7 PCBUS von 4 Eutern über einen Zeitraum von 13 Tagen nach Gewinnung (n=4 Euter, mind. 7 PCBUS pro Euter und Messzeitpunkt);
n.u.: nicht untersucht; Darstellung der Mittelwerte + Standardabweichung
Abbildung 10: Durch einen MTT-Assay ermittelte Vitalitätsprofile der PCBUS Die Vitalität der in den Infektionsversuchen verwendeten PCBUS bis zum Versuchsende nach 4 Tagen;
Vitalitätsprofil je mindestens 5 PCBUS von 6 Eutern; Darstellung der Mittelwerte + Standardabweichung
Ergebnisse
45
4.3. Histologische Untersuchung
4.3.1. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) der PCBUS
Zur Beurteilung der Dicke der PCBUS und deren Morphologie wurden HE-gefärbte Schnitte lichtmikroskopisch untersucht. Die Dickenmessungen mittels computergestützter Software ergaben, dass die Dicke der PCBUS um 15 % vom Sollwert von 250 µm abwichen (Abbildung 11).
Zudem wurden einige PCBUS für die Beurteilung der Morphologie in Paraffin eingebettet und HE gefärbt.
Abbildung 12 zeigt die typische histologische Morphologie eines Rindereuters. Es sind mehrere mit Proteinresten gefüllte Alveolen zu erkennen, die durch Epithelzellen zum Lumen abgegrenzt werden. Im interstitiellen Bindegewebe verlaufen intralobuläre Milchgänge.
Abbildung 11: Histologischer Schnitt eines PCBUS (HE-Färbung); Dickenmessung in µm;
Vergrößerung 20x
Ergebnisse
46
Abbildung 12: Histologischer Schnitt eine PCBUS (HE-Färbung); der mit a) gekennzeichnete Pfeil zeigt auf eine mit Proteinresten gefüllte Alveole; Pfeil b) zeigt interstitielles Bindegewebe;
Vergrößerung 10x
a)
b)
Ergebnisse
47
4.4. Stimulation der PCBUS
Die Ergebnisse sind in Abbildung 13 zu sehen und zeigen die Expression von PGE2
durch die stimulierten PCBUS.
Die PGE2-Konzentration bei allen stimulierten PCBUS stieg über die drei Untersuchungszeitpunkte fortlaufend an. Eine höchst signifikante Erhöhung der PGE2-Konzentration zeigte sich bei den mit LPS (O111:B4) sowie PGN stimulierten PCBUS gegenüber der Negativkontrolle nach einer Stimulationszeit von 6 Stunden.
Bereits nach einer Stimulationszeit von 3 Stunden zeigte sich ein höchst signifikanter Anstieg der PGE2-Konzentration der PCBUS, welche mit der Kombination aus PGN und LPS stimuliert wurden, im Vergleich zur Negativkontrolle. Über die gesamte Versuchsdauer ist kein Anstieg der PGE2-Konzentration bei der Negativkontrolle zu erkennen.
Abbildung 13: PGE2-Freisetzungsprofil in ng/PCBUS nach Stimulation durch PGN, LPS (O111:B4) und der Kombination beider Substanzen; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchgeführt an je 4 PCBUS von 2 Eutern;
Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001
Ergebnisse
48
4.5. Ergebnisse des artifiziellen Infektionsgeschehens
4.5.1. Gram-Färbung der PCBUS
An sechs mit S. aureus (ATCC®29213, Rd5) sowie E. coli (ATCC®25922, 4520/11/18) infizierten PCBUS wurde eine Gram-Färbung zur Detektion der im Versuch eingesetzten Bakterien durchgeführt. Zu allen Untersuchungszeitpunkten konnten jeweils grampositive und gramnegative Bakterien nachgewiesen werden. In den PCBUS, die nur mit dem Nährmedium inkubiert wurden, konnten durch die Färbung keine Bakterien sichtbar gemacht werden (Abbildung 16).
Exemplarisch ist in Abbildung 14 ein mit E. coli 4520/11/18 infizierter gram-gefärbter PCBUS bei einer 100-fachen Vergrößerung abgebildet. Es sind mehrere rot gefärbte Stäbchen zu erkennen. Dabei fällt auf, dass die rot gefärbten Stäbchen besonders oft im Bereich des interstitiellen Bindegewebes zu finden sind. Bei der gewählten Färbemethode ist diese Anfärbung charakteristisch für gramnegative Stäbchen. Dies ließ daher die Vermutung zu, dass in dem untersuchten PCBUS die in dem Versuch eingesetzten E. coli Bakterien zu sehen sind. Bestätigt wurde diese Vermutung durch die Durchführung einer mikrobiologischen Untersuchung des Versuchsüberstandes.
Die Auswertung der über Nacht gewachsenen Kolonien mittels Bunter Reihe zeigte, dass es sich bei den untersuchten Bakterien zu 99,9 % um E. coli handelte.
Abbildung 15 zeigt einen gram gefärbten PCBUS nach Infektion mit S. aureus Rd5, bei einer 100-fachen Vergrößerung. Besonders in der Grenzregion des Gewebes sind dunkelviolette, in Gruppen angeordnete Kokken zu erkennen. Die spezifische Farbe ist bei dieser Art der Färbung ein Indiz für grampositive Bakterien. Auch in diesem Fall wurde nach einer Anzucht der Bakterien aus dem Versuchsüberstand über Nacht eine Bunte Reihe durchgeführt, die mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit zeigte, dass es sich bei den untersuchten Bakterien um S. aureus handelte.
Ergebnisse
49
Abbildung 14: Gram-Färbung eines PCBUS nach Infektion mit E.coli 4520/11/18; der Pfeil zeigt beispielhaft auf ein gram-negativ gefärbtes Stäbchen; 100x Öl
Abbildung 15: Gram-Färbung eines PCBUS nach Infektion mit S. aureus Rd5; der Pfeil zeigt beispielhaft auf eine gram-positive Kokke; 100x Öl
Ergebnisse
50
Abbildung 16: Gram-Färbung eines PCBUS in Nährmedium, ohne Zugabe von Bakterien; 100x Öl
Ergebnisse
51 4.5.2. Freisetzung von IL-1ß
Abbildung 17 zeigt die IL-1ß-Konzentrationen der mit den Stimulanzien inkubierten PCBUS.
Die IL-1ß-Konzentrationen lagen über den gesamten Versuchszeitraum von 6 Stunden deutlich unterhalb der mit Bakterien infizierten PCBUS. Hier ist am IL-1ß-Freisetzungsprofil der mit PGN-stimulierten PCBUS zu erkennen, dass ein mäßiger Anstieg von 1 bis 6 Stunden vorliegt. Die IL-1ß-Konzentrationen der LPS-stimulierten PCBUS lagen bei allen untersuchten Zeitpunkten auf einem ähnlichen Konzentrationsniveau, sodass kein Anstieg über die Zeit zu erkennen ist.
Die IL-1ß-Freisetzung bei den mit der Kombination aus beiden Substanzen stimulierten PCBUS ist nach 1 Stunde am höchsten und fällt im zeitlichen Verlauf ab.
In Abbildung 18 ist das IL-1ß-Freisetzungsprofil nach der Infektion der PCBUS mit den jeweiligen Bakterienstämmen von E. coli (ATCC®25922 und 4520/11/18) und in Abbildung 19 von S. aureus (ATCC®29213 und Rd5) in pg/PCBUS zu sehen. Die beschriebenen Signifikanzen sind immer auf die jeweilige Kontrolle des betrachteten Messzeitpunktes bezogen.
Bereits nach 1 Stunde ist ein höchst signifikanter Anstieg der IL-1ß-Konzentration der mit E. coli ATCC®25922 infizierten PCBUS zu sehen. Dieser hoch signifikante Anstieg ist ebenfalls zu den Messzeitpunkten von 4 und 6 Stunden zu erkennen. Der Anstieg der IL-1ß-Freisetzung der mit dem Mastitisisolat infizierten PCBUS ist bereits nach 1 Stunde hoch signifikant und steigt über den Untersuchungszeitraum stetig an.
Über den untersuchten Zeitraum von 1 bis 6 Stunden ist ein Anstieg der IL-1ß-Konzentration der S. aureus infizierten PCBUS zu erkennen. Dabei ist die IL-1ß-Konzentration durch die Infektion der PCBUS durch das klinische Mastitisisolat (Rd5) über den gesamten Zeitverlauf höher als die IL-1ß-Konzentration der PCBUS, welche mit dem ATCC®-Stamm des S. aureus infiziert wurden.
Zu allen betrachteten Zeitpunkten lag die Konzentration von IL-1ß der mit Nährmedium inkubierten PCBUS unterhalb der mit Bakterien infizierten PCBUS.
Ergebnisse
52 4.5.3. Freisetzung von PGE2
Abbildung 17 zeigt die PGE2-Konzentration in ng/PCBUS der mit den Stimulanzien inkubierten PCBUS zu den Zeitpunkten 4, 6 und 24 Stunden.
Ein Anstieg der PGE2-Konzentration über die Zeit ist bei allen zugegebenen Stimulanzien nicht erkennbar. Hoch signifikante Anstiege der PGE2-Konzentration sind nach 4 Stunden bei den mit LPS sowie den mit der Kombination beider Stimulanzien inkubierten PCBUS zu sehen. Nach 6 Stunden ist bei den beiden Stimulationen ein hoch signifikanter Unterschied erkennbar.
Abbildung 18 zeigt das PGE2-Freisetzungsprofil nach der Infektion der PCBUS mit den jeweiligen Bakterienstämmen von E. coli (ATCC®25922 und 4520/11/18) und Abbildung 19 von S. aureus (ATCC®29213 und Rd5) in ng/PCBUS. Die beschriebenen Signifikanzen sind immer auf die jeweilige Kontrolle des betrachteten Messzeitpunktes bezogen.
Bei den PCBUS, die mit dem Referenzstamm des E. coli (ATCC® 25922) infiziert wurden, war zu den untersuchten Messzeitpunkten kein Unterschied in der freigesetzten PGE2-Konzentration zu erkennen. Ein signifikanter Konzentrationsunterschied von PGE2 gegen die Kontrolle war allerdings nach dem ersten Messzeitpunkt nach 4 Stunden gegeben. Dies ist aber auf die abfallende Konzentration der Kontrolle zum Zeitpunkt von 4 Stunden zurückzuführen. Eine abfallende Konzentrationsmenge an PGE2 war nach 6 Stunden festzustellen. Auch hier kann festgehalten werden, dass das PGE2-Freisetzungsprofil bei dem E. coli-Stamm 4520/11/18 ähnlich dem des E. coli-Referenzstammes (ATCC®25922) verläuft, allerdings in einem niedrigeren Konzentrationsbereich.
Die mit S. aureus ATCC® 29213 infizierten PCBUS zeigten bis zum Zeitpunkt von 4 Stunden eine ansteigende Freisetzung an PGE2. Zum Zeitpunkt von 4 Stunden war die PGE2-Konzentration signifikant erhöht. Eine hoch signifikante Erhöhung war auch nach 6 Stunden gegeben. Ein ähnliches PGE2-Freisetzungsprofil, allerdings in gesamtheitlich niedrigeren Konzentrationen, war bei der Infektion der PCBUS mit dem klinischen Mastitisisolat Rd5 des S. aureus zu beobachten. Eine Signifikanz der PGE2-Konzentration gegenüber der Kontrolle war erst nach 6 Stunden gegeben.
Ergebnisse
53 4.5.4. Freisetzung von TNF-α
Abbildung 17 zeigt die TNF-α-Konzentration der mit den Stimulanzien inkubierten PCBUS zu den Zeitpunkten 4, 6 und 24 Stunden.
Ein Anstieg der TNF-α-Konzentration über die Zeit ist bei allen zugegebenen Stimulanzien nicht erkennbar. Erst nach 24 Stunden ist bei allen drei Stimulationsansätzen eine darstellbare TNF-α-Konzentration möglich. Ein hoch signifikanter Anstieg der TNF-α-Konzentration im Gegensatz zu der Kontrolle ist nach 24 Stunden bei den mit LPS stimulierten PCBUS zu sehen.
In Abbildung 18 ist das TNF-α-Freisetzungsprofil nach der Infektion der PCBUS mit den jeweiligen Bakterienstämmen von E. coli (ATCC®25922 und 4520/11/18) sowie in Abbildung 19 von S. aureus (ATCC®29213 und Rd5) in pg/PCBUS zu sehen. Die beschriebenen Signifikanzen sind immer auf die jeweilige Kontrolle des betrachteten Messzeitpunktes bezogen.
Bei den PCBUS, welche mit dem Referenzstamm des E. coli infiziert wurden, zeigten sich keine Konzentrationsunterschiede von TNF-α zu den jeweiligen Messzeitpunkten.
Ein signifikanter Unterschied der TNF-α-Konzentration im Bezug zur Kontrolle ist zum ersten Messzeitpunkt von 4 Stunden zu sehen. Ein Anstieg über die untersuchte Zeit ist bei den mit dem Mastitisisolat des E. coli infizierten PCBUS zu erkennen. Höchst signifikante Unterschiede sind nach 4 und 24 Stunden festzustellen.
Ein Anstieg der TNF-α-Freisetzung der S. aureus ATCC® 29213 infizierten PCBUS ist erst nach 24 Stunden zu sehen; dieser ist signifikant. Bei den PCBUS, welche mit dem klinischen Mastitisisolat infiziert wurden, ist kein Konzentrationsunterschied zu den Zeitpunkten 4 und 6 Stunden zu sehen, gleichwohl ein hoch signifikanter Unterschied in der TNF-α-Freisetzung nach 4 Stunden zu erkennen. Nach 24 Stunden ist ein signifikanter Unterschied der TNF-α-Konzentration der PCBUS, welche mit dem Referenzstamm infiziert wurden und ein hoch signifikanter Unterschied der mit dem Mastitisisolat infizierten PCBUS zu erkennen.
Ergebnisse
54
Abbildung 17: Freisetzungsprofile der Immunmediatoren IL-1ß, TNF-α und PGE2 nach Stimulation der PCBUS mit PGN S. aureus, LPS (O111:B5) und der Kombination aus beiden Substanzen;
Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001
Ergebnisse
55
Abbildung 18: Freisetzungsprofile der Immunmediatoren IL-1ß, TNF-α und PGE2 nach Infektion der PCBUS mit E. coli ATCC®25922 und 4520/11/18; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchführung an 6 Eutern je 4 PCBUS;
Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Ergebnisse
56
Abbildung 19: Freisetzungsprofile der Immunmediatoren IL-1ß, TNF-α und PGE2 nach Infektion der PCBUS mit S. aureus ATCC®29213 und Rd5 ; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchführung mit je 4 PCBUS von 6 Eutern;
Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Ergebnisse
57
4.6. Untersuchung von Testsubstanzen zur Beeinflussung des Infektionsgeschehens
4.6.1. Freisetzung von IL-1ß und IL-6
Abbildung 20 zeigt das Freisetzungsprofil von IL-1ß und IL-6 nach der Infektion der PCBUS mit S. aureus Rd5 und der Behandlung mit dem Florfenicol nach 6 Stunden.
Es ist zu erkennen, dass die ausgeschüttete IL-1ß-Konzentrationsmenge bei allen behandelten PCBUS weit niedriger ist als die der nur mit Bakterien infizierten PCBUS.
Hoch signifikant sind die Unterschiede bei den zugegebenen Florfenicol-Konzentrationen 4 µg/ml und 10 µg/ml, unabhängig von der Vorinkubation.
Im Freisetzungsprofil von IL-6 sind keine signifikanten Unterschiede zur Inkubation der PCBUS mit Bakterien zu sehen. Tendenziell ist eine abfallende IL-6-Konzentration bei zunehmender Florfenicolkonzentration in der Gruppe ohne Vorinkubation zu erkennen.
Abbildung 20: IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS 6 Stunden nach Zugabe von
S. aureus Rd5 und der Behandlung von Florfenicol in den Konzentrationen 1, 4 und 10 µg/ml; Ohne Vorinkubation steht für eine zeitgleiche Zugabe der Bakteriensuspension und der Testsubstanz Florfenicol; mit Vorinkubation steht für die Inkubation der PCBUS mit Florfenicol 24 Stunden vor der Bakterienzugabe; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Legende der Symbole: *** p ≤ 0,001
Ergebnisse
58
In Abbildung 21 ist die IL-1ß- sowie IL-6-Freisetzung nach der Infektion der PCBUS und der Zugabe von Meloxicam nach 6 Stunden zu sehen.
Bei einer Zugabe der Konzentration von 35 µg/ml Meloxicam lag die IL-1ß-Konzentration niedriger als die der nur mit Bakterien infizierten PCBUS. Auch hier war kein Unterschied zwischen der IL-1ß-Expression der PCBUS bei der 24-stündigen Vorinkubation mit Meloxicam im Gegensatz zu der gleichzeitigen Gabe der Testsubstanz und der Bakteriensuspension zu erkennen. Ein ähnliches Bild ist bei der Expression von IL-6 zu erkennen. In beiden Zytokinfreisetzungsprofilen sind keine signifikanten Unterschiede zu der Bakteriengruppe zu erkennen.
Abbildung 21: IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS 6 Stunden nach der Bakterienzugabe von S. aureus Rd5 und der Behandlung von Meloxicam in den Konzentrationen 0,35, 3,5 und 35 µg/ml; Ohne Vorinkubation steht für eine zeitgleiche Zugabe der Bakteriensuspension und der Testsubstanz Meloxicam; mit Vorinkubation steht für die Inkubation der PCBUS mit Meloxicam 24 Stunden vor der Bakterienzugabe; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Legende der Symbole: *** p ≤ 0,001
Ergebnisse
59
Abbildung 22 zeigt das IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS und der Zugabe von Mepyramin. Dabei lag die IL-1ß- sowie IL-6-Konzentration bei allen Behandlungen im Bereich der nur mit Bakterien infizierten PCBUS. Bei keiner zugegebenen Konzentration des Mepyramins sind signifikante Unterschiede zu sehen.
Abbildung 22: IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS 6 Stunden nach der Bakterienzugabe von S. aureus Rd5 und der Behandlung von Mepyramin in den Konzentrationen 30, 100 und 300 µg/ml; Ohne Vorinkubation steht für eine zeitgleiche Zugabe der Bakteriensuspension und der Testsubstanz Mepyramin; mit Vorinkubation steht für die Inkubation der PCBUS mit Mepyramin 24 Stunden vor der Bakterienzugabe; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Legende der Symbole: *** p ≤ 0,001
Diskussion
60
5. Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein In-vitro-Modell etabliert, welches für die Untersuchung der Wirksamkeit von neuen Therapeutika zur Verfügung stehen soll und dabei das 3R-Prinzip im Sinne des Tierschutzes berücksichtigt.
5.1. Herkunft des Probenmaterials
Die bovinen Euter stammten von geschlachteten Milchkühen aus dem Schlachthof in Minden-Lübbecke. Mehrere Studien zeigten bereits, dass Schlachtmaterial zur Untersuchung von unterschiedlichen Fragestellungen mit reproduzierbaren Ergebnissen genutzt werden kann (DE LANGE et al. 1992; KIETZMANN et al. 1993;
BÄUMER u. KIETZMANN 2000).
Die Euter wurden bereits vor Ort adspektorisch und palpatorisch untersucht und nur die für gesund befundenen Euter für den Transport in das Labor ausgesucht. Die erste Überprüfung der Euter vor Ort wurde immer durch dieselbe Mitarbeiterin mit langjähriger Berufserfahrung vorgenommen. Im Labor selbst wurde zusätzlich mit der ermelkbaren Milch des vermeindlich gesunden Euters der Calfifornia-Mastitis-Test (CMT) durchgeführt. Anhand dieser Examinierungen war allerdings nicht zu erkennen, ob in dem vorliegenden Organ eine subklinische Entzündung vorlag, das Tier wegen einer systemisch vorliegenden Erkrankung geschlachtet wurde, in welchem Laktationsstadium das Euter vorlag oder wie alt das Rind war. Ein Vorbericht war bei dieser Art der Materialgewinnung nicht gegeben.
5.2. Gewinnung der PCBUS und histologische Untersuchung
Wenn die in 5.1 genannten Untersuchungen auf ein gesundes Euter hindeuteten, wurde das Gewebe zur Probengewinnung genutzt. Beim Schneiden des Eutergewebes wurde erkennbar, dass jedes Euter eine andere Gewebestruktur und Konsistenz aufwies. Diese Erkenntnis korrelierte zumeist mit der Größe des jeweiligen Euters. Kleine Euter enthielten dabei wenig Milch, das Gewebe war im Allgemeinen derb und überwiegend mit bindegewebigen Septen durchzogen. Das Gewebe von großen Eutern hingegen war eher weich und zeigte größtenteils drüsenartige Anteile sowie ein hohes Milchaufkommen. Die durch Palpation und Adspektion festgestellten
Diskussion
61
Unterschiede zeigten, dass sich die Kühe, von denen die Euter stammten, zum Zeitpunkt der Schlachtung in unterschiedlichen Laktationsstadien befanden. Daher war es wichtig, die Methode der Gewinnung der PCBUS immer an das vorliegende Gewebe anzupassen. Die verschiedenen Laktationsstadien und die Unterschiede der im Euter enthaltenen Milchmenge erforderten beispielsweise eine Anpassung der Anzahl an Waschschritten.
Versuche von PETRY (2017) haben gezeigt, dass sich Eutergewebe mittels eines Dermatoms, welches zum Abtragen von Hautarealen in der Dermatologie eingesetzt wird, schneiden lässt. Bei weichen Geweben wurde die Klinge des Dermatoms schneller stumpf und musste häufiger gewechselt werden, um das Gewebe so schonend wie möglich schneiden zu können.
Die histologischen Ergebnisse der Dickenbestimmung mittels computergestützter Software dieser Arbeit bestätigen, dass eine gute Reproduzierbarkeit in Hinblick auf die Schnittdicke gegeben ist. Dies ist wichtig, da die Gewebedicke Einfluss auf deren Kultivierbarkeit sowie Nährstoffversorgung haben kann. MARTIN et al. (1996) zeigten bei Lungenpräzisionsschnitten, dass diese bei einer Schnittdicke von 250 µm besser mit Sauerstoff sowie Nährstoffen versorgt werden als die Lungenpräzisionsschnitte von DANDURAND et al. (1993) bei einer Dicke von 500–1000 µm.
Das zusätzliche Ausstanzen des dünnen Eutergewebes ermöglichte das Arbeiten mit einer standardisierten Schnittfläche. Dabei wurde der Durchmesser der Biopsiestanzen von 6 mm gewählt, da bei größer gewählten Durchmessern häufiger auch unterschiedlich große Milchgänge in der ausgestanzten Fläche lagen. Dies hätte eine zusätzliche Variabilität der untersuchten Gewebemenge zur Folge gehabt, die bei einer Biopsiestanzengröße von 6 mm umgangen werden konnte. Um einen möglichst großen, zusammenhängenden Zellverbund untersuchen zu können, sollten die ausgestanzten PCBUS nicht kleiner als 6 mm sein.
Ein großer Vorteil dieser Methode ist die große Anzahl an zu generierenden PCBUS.
Ein großer Vorteil dieser Methode ist die große Anzahl an zu generierenden PCBUS.