Verwendete Arzneimittel - Material und Methoden

3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.9. Verwendete Arzneimittel

Florfenicol Cayman Chemical Company, Ann

Arbor, USA

Meloxicam Cayman Chemical Company, Ann

Arbor, USA Pyrilamine maleate salt (Mepyramine

maleate)

Sigma-Aldrich, Steinheim

Material und Methoden

25 3.1.10. ELISA

Bovine Interleukin 1 beta Reagent Kit

Invitrogen, Thermo Fisher Scientific,

Bovine IL-6 DuoSet^® ELISA DuoSet^® ELISA Development Systems, R&D Systems, Minneapolis, USA

Prostaglandine E2 Express ELISA Kit

Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA Bovine TNF-alpha DuoSet^®

ELISA

DuoSet^® ELISA Development Systems, R&D Systems, Minneapolis, USA

3.1.11. Vitalitätstest

Ameisensäure-Propanol-Lösung 5 % Ameisensäure, 95 % Propanol MTT-Lösung (50 mg MTT) 14 mg

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-terazolium Bromid in 2 ml TKM-Puffer lösen

in 18 ml Haltungsmedium überführen

TKM-Puffer 6,08 g/l TRIS-HCl,

85,576 g/l Saccharose, 1,86 g/l KCl, 1,018 g/l MgCl2 *6H2O Peptidoglykan Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich, Steinheim

Material und Methoden

3.2. Methoden

3.2.1. Versuchsübersicht

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Versuchsmodells zur Untersuchung des frühen Infektionsgeschehens einer bakteriell bedingten bovinen Mastitis sowie deren Beeinflussung mit verschiedenen pharmakologisch wirksamen Substanzen – letztlich, um dazu beizutragen, eine Verringerung des Einsatzes von Antibiotika zur Behandlung der bovinen Mastitis zu erreichen.

Diese Zielsetzung bedingte die folgenden Arbeitsschritte dieser Dissertation:

1. Gewinnung boviner Euterpräzisionsschnitte 2. Vitalitätstest der Euterpräzisionsschnitte

3. Histologische Untersuchung der Euterpräzisionsschnitte 4. Stimulation der Euterpräzisionsschnitte

5. Infektionsversuche an den Euterpräzisionsschnitten mit S. aureus- und E. coli-Stämmen

6. Untersuchung des Einflusses von Testsubstanzen auf das Infektionsgeschehen 7. Untersuchung der Probenüberstände auf die Freisetzung von

Immunmediatoren mittels ELISA 3.2.2. Herkunft des Probenmaterials

Das Material zur Gewinnung der Euterpräzisionsschnitte stammte von Eutern von Schlachtrindern des Schlachthofes in Minden-Lübbecke. Die Eutergesundheit wurde noch vor Ort mittels Adspektion des Organs sowie der ermelkbaren Milch und durch Palpation des Euters ermittelt. Zum Schlachtzeitpunkt befanden sich die Euter in unterschiedlichen Laktationsstadien. Die für gesund befundenen Organe wurden mit einer heparinisierten Tyrode-Lösung gespült und auf direktem Weg in das Labor des Instituts transportiert. Die Generierung der Euterpräzisionsschnitte (precision cut bovine udder slices, PCBUS) startete ca. 4 Stunden nach der Schlachtung.

Material und Methoden

3.2.3. Gewinnung der PCBUS mittels Dermatom

Nach Eintreffen des Euters im Labor wurde mit der ermelkbaren Milch jedes Euterviertels der CMT zur Ermittlung der Zellzahl durchgeführt. Aus einem für gesund befundenen Euterviertel wurde mittels steriler Skalpellklinge ein ca. 10 x 10 x 3 cm großer Bereich aus dem Drüsengewebe geschnitten. Dabei wurde darauf geachtet, dass in dem Gewebe möglichst wenige, kleine Milchgänge sowie Gefäße verliefen und das herauspräparierte Gewebe ebenmäßig war.

Das Dermatom wurde auf eine Schnittdicke von 250 µm eingestellt und mit mäßigem Druck über das herauspräparierte, auf einer Platte fixierte Drüsengewebe geführt. Das dermatomisierte Gewebe wurde mit einer atraumatischen Pinzette behutsam in ein mit ca. 25 ml sterilem Phosphat-Puffer (PBS; pH=7,4) gefülltes Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wurden die gewonnenen Schnitte in einer Sterilwerkbank in eine Petrischale mit ca. 5 ml sterilem PBS verbracht, um daraufhin in weitere saubere Petrischalen überführt und erneut mit 5 ml sterilem PBS gewaschen zu werden. Dieser Vorgang wurde so oft wiederholt, bis keine Milch mehr aus den Schnitten austrat und der Phosphatpuffer klar blieb. Dafür waren in der Regel 4–6 Waschschritte nötig.

Sobald das gewünschte Ergebnis erreicht wurde, konnten die Schnitte in einer neuen Petrischale flach ausgebreitet und mit Hilfe von Biopsiestanzen (6 mm) in kleine, gleich große Stücke verarbeitet werden (Abbildung 4).

Aus einem Euterviertel lassen sich durch diese Methode über 100 PCBUS generieren.

Abbildung 4: a) Drüsengewebe des Euters nach dem Dermatomisieren mit einer Schichtdicke von 250 µm in einer Petrischale mit sterilem PBS; b) Drüsengewebe nach dem Ausstanzen; c) gewonnene PCBUS mit einem Durchmesser von 6 mm

Material und Methoden

Die Euterpräzisionsschnitte wurden anschließend in eine 24-Multiwellplatte überführt und mit 500 µl einer Antibiotika-Waschlösung für 15 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei 130 Umdrehungen/Minute inkubiert. In zwei weiteren Waschschritten wurde die Antibiotika-Waschlösung aus der 24-Multiwellplatte abgenommen und erneut 500 µl Antibiotika-Waschlösung hinzugegeben. Anschließend wurde diese Waschlösung verworfen, woraufhin zwei Waschgänge mit 500 µl Haltungsmedium für 10 Minuten durchgeführt wurden. Die Kultivierung der PCBUS erfolgte in einer neuen 24-Multiwellplatte mit 1000 µl Haltungsmedium im Brutschrank bei 37°C und mit 5 % CO2-Begasung.

3.2.4. Vitalitätsbestimmung der PCBUS mittels MTT-Assay

Der erste Mediumwechsel nach Generierung der PCBUS erfolgte nach 24 Stunden.

Alle weiteren Wechsel folgten im Abstand von 48 Stunden. Eine Kontrolle der Vitalität fand mittels MTT-Assay statt, durch welchen sich der Vitalitätszustand der PCBUS über die Zeit des Versuchs ermitteln ließ.Der MTT-Assay wurde in modifizierter Form in Anlehnung an das Protokoll nach LAMBERMONT et al. (2014) durchgeführt. Dazu wurde die MTT-Substanz in TKM-Puffer gelöst und in einem Verhältnis von 1:10 mit dem Haltungsmedium der PCBUS verdünnt. In je ein Well einer 24-Multiwellplatte wurde ein Euterpräzisionsschnitt gegeben und für 15 Minuten auf dem Orbitalschüttler bei 130 Umdrehungen/Minuten in 1000 µl der MTT-Lösung inkubiert. In vitalen Zellen wird der gelbe Farbstoff durch mitochondriale Dehydrogenasen in Formazan (blau) reduziert. Nach Abnehmen des Überstandes wurden 200 µl Ameisensäure-Propanol-Lösung hinzugefügt, in der die PCBUS für weitere 40 Minuten auf dem Orbitalschüttler inkubierten. So wird das Formazan in Lösung gebracht. Die Lösungen wurden in beiden Arbeitsschritten vor Licht geschützt und die Inkubation im Dunkeln vorgenommen. Nach 40 Minuten wurden 100 µl pro Well entnommen und in je ein Well einer 96-Multiwellplatte überführt. Die Extinktion wurde mit einem Photometer bei 570 nm gemessen (Abbildung 5).Um den Effekt einer Vitalitätsabnahme der Zellen darzustellen, wurden einige PCBUS 30 Minuten vor der Durchführung des MTT-Assay in 1000 µl Triton^®-X 100 bei 37°C und 5 % CO2 -Begasung inkubiert. Diese konnten dann als Negativkontrolle dienen. Der MTT-Assay wurde bis zur Beendigung jedes Versuchs täglich im Fünffachansatz durchgeführt. Alle

Material und Methoden

PCBUS wurden direkt im Anschluss an das Experiment durch das Drücken auf ein Papiertuch von Flüssigkeit befreit und deren Gewicht mit einer Feinwaage bestimmt, um in späteren Experimenten die Ergebnisse auf das jeweilige Gewicht der untersuchten PCBUS beziehen zu können.

Abbildung 5: a) PCBUS nach der 15-minütigen Inkubation mit der MTT-Lösung; b) nach 40-minütiger Inkubation mit der Ameisensäure-Propanol-Lösung; c) 100 µl des Überstandes in einer 96-Multiwellplatte zur Bestimmung der optischen Dichte durch ein Photometer

3.2.5. Überprüfung auf Verkeimung

Zur Überprüfung des Erfolges der Waschschritte bei der Gewinnung der PCBUS aus dem Eutergewebe des Schlachthofes wurde jeweils nach 48 und 96 Stunden eine mikrobiologische Untersuchung durchgeführt. Hierzu wurden 100 µl des Haltungsmediums aus unterschiedlichen Wells auf einem Columbia-Agar mit Schafblut (7 %) ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Der untersuchte Überstand wurde dann als frei von Kontaminationen angesehen, wenn sich kein bakterielles Wachstum gezeigt hatte. Wenn eine Verkeimung der PCBUS vorlag, wurden diese nicht für Versuche verwendet.

3.2.6. Histologische Untersuchung der PCBUS

Die histologische Untersuchung der PCBUS wurde durchgeführt, um die physiologische und pathophysiologische Morphologie beurteilen, Dickenmessungen durchführen und die Adhäsion der zugesetzten Bakterien untersuchen zu können. Es erfolgten eine HE- sowie eine Gram-Färbung. Die Einbettung der PCBUS in Paraffin erfolgte im Anatomischen Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Gram-Färbung wurde von mir mit Unterstützung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover umgesetzt. Die Herstellung der Paraffinschnitte mittels Mikrotom, die HE-Färbung und die Beurteilung der hergestellten histologischen Schnitte wurde von mir im hiesigen Institut durchgeführt.

Material und Methoden

Nach Infektionsversuchen wurden die PCBUS, welche sowohl mit den E. coli-Stämmen ATCC^® 25992 und 4520/11/45 als auch mit den S. aureus-Stämmen ATCC^® 29213 und Rd5 infiziert worden waren, in eine 48-Wellplatte mit 1 ml 10 %-igen Formalin gegeben, in welchem die PCBUS 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubierten. Die fixierten PCBUS wurden nach einem Standardprotokoll fixiert und in Paraffinblöcke gegossen.

Um die PCBUS für die Dickenmessung einzubetten, wurden diese hochkant in die Einbettschale gestellt. Dabei war es besonders wichtig, dass sie im 90°-Winkel zum Boden standen, um im späteren Verlauf eine zuverlässige Dickenmessung durchführen zu können. Die übrigen PCBUS konnten parallel zum Boden der Einbettschale gelegt werden.

3.2.6.1. Herstellung der Paraffinschnitte mittels Mikrotom

Die in Paraffin eingebetteten PCBUS wurden vor dem Schneiden in den Kühlschrank gelegt und bei 4°C über mindestens 30 Minuten gekühlt. Während dieser Zeit wurde die Klinge des Mikrotoms eingespannt und auf einen Schnittwinkel von 0° eingestellt.

So wurden Paraffinschnitte mit einer Dicke von 4 µm geschnitten.

Nach dem Schneiden wurden die Paraffinschnitte in einem Wasserbad bei 35°C gestreckt, aus diesem durch das Aufziehen auf einen Objektträger herausgeholt und auf einer Thermoplatte bei 40°C getrocknet.

3.2.6.2. Hämatoxylin-Eosin- und Gram-Färbung

Nach dem Trocknen der Paraffinschnitte auf dem Objektträger wurden diese über Nacht bei 60°C inkubiert. Eine Übersicht der Arbeitsschritte der HE-Färbung ist Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 2 zeigt die Schritte der Gram-Färbung auf.

Material und Methoden

Tabelle 1: Durchführungsschema für die HE-Färbung von Mikrotomschnitten

Schritt Lösung Dauer Vorgang

1 Xylol 2 Minuten Entparaffinieren

2 Xylol 2 Minuten Entparaffinieren

3 Ethanol 100 % 2 Minuten Wässern

4 Ethanol 96 % 2 Minuten Wässern

5 Ethanol 80 % 2 Minuten Wässern

6 Ethanol 70 % 2 Minuten Wässern

7 destilliertes Wasser 5 Minuten Wässern

8 filtriertes Hämalaun 8 Minuten Färben

9 salzsaurer Alkohol 2 Sekunden Färbung abstoppen

10 warmes Leitungswasser 5 Minuten Auswaschen

11 Eosin 2 Minuten Färben

12 warmes Leitungswasser 30 Sekunden Auswaschen

13 Ethanol 70 % 20 Sekunden Entwässern

14 Ethanol 80 % 20 Sekunden Entwässern

15 Ethanol 96 % 20 Sekunden Entwässern

16 Ethanol 100 % 20 Sekunden Entwässern

17 Xylol 2 Minuten Entwässern

18 Xylol 2 Minuten Entwässern

19 Entellan^® bis zur Trockenheit Eindecken

Material und Methoden

Tabelle 2: Durchführungsschema für die Gram-Färbung von Mikrotomschnitten

Schritt Lösung Dauer Vorgang

1 Xylol 2 Minuten Entparaffinieren

2 Xylol 2 Minuten Entparaffinieren

3 Ethanol 100 % 2 Minuten Wässern

4 Ethanol 96 % 2 Minuten Wässern

5 Ethanol 80 % 2 Minuten Wässern

6 Ethanol 70 % 2 Minuten Wässern

7 destilliertes Wasser 5 Minuten Wässern

8 Karbolgentiaviolett 3 Minuten Färben

9 Lugol´sche Lösung 2 Minuten Färben

10 konzentrierter Ethylalkohol 1 Minuten Auswaschen

11 Verdünntes Fuchsin 15 Sekunden Gegenfärben

12 warmes Leitungswasser 30 Sekunden Auswaschen

13 Trockenblock 20 Sekunden Trocknung

14 Entellan bis zur Trockenheit Eindecken

Material und Methoden

33 3.2.7. Stimulation der PCBUS

Um zu überprüfen, ob die Zellen der generierten PCBUS auf äußere Reize reagieren, wurden sie mit verschiedenen Substanzen stimuliert. Dies geschah im Rahmen von Vorversuchen mit je drei PCBUS von zwei Eutern.

24 Stunden vor der Durchführung des Stimulationsversuchs wurde das Haltungsmedium durch ein Nährmedium (RPMI-1640 Medium mit 10 % FKS) ersetzt, welches keine antimikrobiellen Wirkstoffe enthielt. Die Stimulation der PCBUS erfolgte mit LPS (O111:B4), PGN (Staphylococcus aureus) und einer Kombination beider Substanzen. Als Kontrolle dienten PCBUS, die in Nährmedium ohne Zusatz der oben genannten Stimulanzien inkubierten (Tabelle 3). Jede Substanz wurde auf vier PCBUS gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurde das Stimulationsmedium abgenommen und in einem Reaktionsgefäß gesichert. Danach wurden die PCBUS erneut stimuliert, so dass weitere Probengewinnungen nach 3 und 6 Stunden durchgeführt werden konnten. Alle generierten Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung lichtgeschützt bei –20°C gelagert. Auch hier wurde im Anschluss das Gewicht der PCBUS nach Flüssigkeitsentzug bestimmt.

Tabelle 3: Stimulationsansätze für die PCBUS

Stimulanz Konzentration

LPS (O111:B4) 1 µg/ml

PGN S. aureus 1 µg/ml

Kombination LPS:PGN (50:50) 1 µg/ml LPS (O111 B4) +1 µg/ml PGN

Kontrolle RPMI-1640 Medium + 10 % FKS

Material und Methoden

34 3.2.8. Infektionsversuch mit den PCBUS

Bei dem Infektionsversuch wurden die PCBUS 24 Stunden in einem dem Stimulationsversuch (s. Kapitel 3.2.7) ähnlichen Vorgang vor Beginn des Experiments von einem antibiotikahaltigen auf ein antibiotikafreies Haltungsmedium überführt.

Zusätzlich wurden die PCBUS bei diesem Versuchsaufbau mit sterilem PBS gewaschen und in eine neue 24-Wellplatte umgesetzt, um Rückstände antimikrobiell wirksamer Substanzen zu vermeiden. Nach 24 Stunden wurde zur Überprüfung möglicher Kontaminationen eine mikrobiologische Untersuchung (s. Kapitel 3.2.5) durchgeführt. Die Infektionsversuche wurden an Oktaplikaten von sechs Eutern durchgeführt.

3.2.8.1. Verwendete Bakterien 3.2.8.1.1 Staphylococcus aureus

Es wurden zwei S. aureus-Stämme verwendet. Ein Stamm war ein klinisches Feldisolat von einer an Mastitis erkrankten Kuh mit der Bezeichnung Rd5. Dieser wurde von dem Institut für Physiologische Chemie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bereitgestellt. Der andere stammte aus der American Type Culture Collection (ATCC^® 29213).

Um sicherzustellen, dass es sich bei den verwendeten Bakterien auch tatsächlich um S. aureus-Stämme handelte, wurde zur Identifikation eine Bunte Reihe (RapID™ STAPH PLUS System, Remel Europe Ltd., Kansas, USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Für die Infektion wurde Koloniematerial von einer Columbia-Agarplatte mit 7 % Schafblut mit einer sterilen Impföse entnommen und in Trypton-NaCl-Lösung gegeben. Diese wurde dann mittels Photometer auf einen McFarland-Standard von 0,5 (optische Dichte 0,08–0,1 bei 600 nm) eingestellt.

3.2.8.1.2 Escherichia coli

Der ATCC^25922 Stamm des E. coli lag dem hiesigen Institut bereits vor. Das klinischen Mastitisisolat 4520/11/18 des E. coli wurde von der diagnostischen Abteilung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.

Material und Methoden

24 Stunden vor Versuchsstart wurden fraktionierte Ausstriche von den jeweiligen Bakterien auf Columbia-Agar mit 7 % Schafblut angefertigt und mittels Bunter Reihe verifiziert, dass es sich um E. coli handelte. Am Versuchstag wurde mit Hilfe einer sterilen Impföse Koloniematerial entnommen und in Trypton-NaCl-Lösung eingerührt.

Mittels eines Photometers konnte bei einer Wellenlänge von 600 nm die Suspension auf eine optische Dichte von 0,08 bis 0,1 eingestellt werden (McFarland-Standard von 0,5). Mit dieser Bakteriensuspension wurde dann der Infektionsversuch durchgeführt.

3.2.8.2. Durchführung des Infektionsversuchs

Am Versuchstag wurden die Schnitte in neue 24-Wellplatten transferiert und mit 500 µl Versuchsmedium inkubiert. In Oktaplikaten wurden die PCBUS eines Euterviertels des Versuchseuters mit den vier in 3.1.8 genannten Bakterienstämmen infiziert. Parallel dazu wurden je acht PCBUS auch mit LPS (O55:B5), PGN und einer Kombination aus beiden Substanzen stimuliert. Als Kontrolle wurden vier PCBUS über denselben Zeitraum (24 Stunden) in 500 µl Haltungsmedium inkubiert. Da die Konzentration der Bakterien in Trypton-NaCl eingestellt und in dieser Form auch auf die PCBUS gegeben wurde, liefen vier Mediumkontrollen mit entsprechender Zusetzung von Trypton-NaCl parallel mit. Der Versuchsaufbau sah vor, dass sich die 500 µl des Versuchsmediums wie im Folgenden beschrieben zusammensetzte: Die Bakteriensuspension des jeweiligen Stammes wurde mit Haltungsmedium verdünnt, so dass ein PCBUS mit einer Infektionsdosis von 2,5 x 10⁷ KBE beimpft wurde. Bei den Stimulationen wurden die gleichen Konzentrationen aufgetragen, wie in Kapitel 3.2.7 angegeben (Tabelle 4).

Um das Kontaminationsrisiko zwischen den Bakterien, aber auch zu den Stimulanzien und den Kontrollen zu minimieren, wurden die PCBUS, kategorisiert nach den jeweiligen Versuchsmedien, in unterschiedlichen 24-Wellplatten inkubiert (Abbildung 6).

Material und Methoden

Tabelle 4: Zusammensetzung der Versuchsmedien

Volumen des Haltungsmediums

Volumen der

Zusätze Anzahl der

Ansätze 333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - E. coli

ATCC^® 25922 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - E. coli

4520/11/18 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - S. aureus

ATCC^® 29213 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Bakteriensuspension - S. aureus

Rd5 8

333 µl RPMI-1640 166 µl Trypton-NaCl 4

500 µl RPMI-1640 - 4

Wenn alle PCBUS mit dem entsprechenden Versuchsmedium versorgt waren, wurden die 24-Wellplatten über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO²-Begasung inkubiert. Der zeitliche Verlauf von der Gewinnung der PCBUS bis zum Versuchsende ist in Abbildung 7 zu sehen.

Tabelle 5 zeigt eine Übersicht über die gewonnenen Proben zu den jeweiligen Probenentnahmezeitpunkten. In kleinen Portionen wurden die Proben direkt nach der Gewinnung bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Überstände dienten im weiteren Verlauf dem Nachweis der Immunmediatoren IL-1ß, IL-6, PGE2 und TNF-α mittels des Enzyme linked immunosorbent assays (ELISA). Neben der Sicherung der Überstände wurden auch die infizierten PCBUS in 10 %-iges Formalin nach Lillie überführt und auf diese Weise für die Einbettung in Paraffinblöcke vorbereitet.

Material und Methoden

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Generierung der Proben während des Infektionsversuchs

Abbildung 7: Zeitverlauf des Infektionsversuchs; an jedem aufgeführten Zeitpunkt wurde ein Vitalitätstest durchgeführt; nach 48 und 72 Stunden wurde mit 100 µl des Überstandes eine mikrobiologische Untersuchung durchgeführt; der Blitz markiert die Beimpfung der PCBUS mit Bakterien in Anlehnung an den Versuchsablauf des Kapitels 3.2.8.2

Material und Methoden

Tabelle 5: Übersicht der Probenentnahmezeitpunkte und Probenmenge. Für die histologischen Untersuchungen wurde zu jedem Zeitpunkt ein PCBUS gesichert.

Zeitpunkt

Probenentnahme

1 Stunde 2 Stunden 4 Stunden 6 Stunden 24 Stunden

Überstand für

ELISA 30 µl 30 µl 130 µl 130 µl 400 µl

mikrobiologische

Untersuchung 100 µl - 100 µl 100 µl -

3.2.8.2.1 Untersuchung von Testsubstanzen zur Beeinflussung des Infektionsgeschehens

Nach der Etablierung des artifiziellen bakteriellen Infektionsmodells wurden in Folgeversuchen drei Testsubstanzen zu den mit Bakterien beimpften PCBUS gegeben. Bei den Testsubstanzen handelte es sich um Florfenicol, Meloxicam und Mepyramin. Dies wurde mit je vier PCBUS aus sechs Eutern durchgeführt.

Florfenicol gehört zu der Gruppe der Amphenicolantibiotika. Florfenicol ist ein strukturelles Analogen zu Thiamphenicol (SYRIOPOULOU et al. 1981) und ist ein hochpotenter Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese (VOORSPOELS et al.

1999). Es wirkt gegen ein breites Spektrum von gram-positiven und -negativen Bakterien (YAO u. MOELLERING 1999).

Bei Meloxicam handelt es sich um ein nicht-steroidales Antiphlogistikum (NSAID) aus der Gruppe der Oxicame (DAVIES u. SKJODT 1999). Durch die selektive Hemmung der Cyclooxigenase 2 inhibiert es die Prostaglandinsynthese und hat dadurch analgetische, antipyretische und antiinflammatorische Eigenschaften.

Mepyramin ist ein H1-Rezeptor-Antagonist und hemmt diesen kompetitiv. Dadurch wird die Wirkung von Histamin auf die Zellen verhindert. Es wirkt also der Erregung H1-Rezeptor induzierter Kontraktionen der glatten Muskulatur, einer Vasodilatation der

Material und Methoden

Arteriolen und Kapillaren sowie der Erhöhung der Gefäßpermeabilität und Stimulation von afferenten Nervenendigungen entgegen.

In diesem Ansatz wurden die PCBUS mit dem klinischen Feldisolat des S. aureus Rd5 infiziert, da die Wirkung der Testsubstanzen auf ein krankheitsauslösendes Bakterium untersucht werden sollte. Der Probeentnahmezeitpunkt 6 Stunden wurde gewählt, damit die Testsubstanzen auf die Bakterien Einfluss nehmen konnten, die Vermehrung der Bakterien aber nicht so stark war, als dass die Menge der zugegebenen Testsubstanzen keine Wirkung mehr erzielen konnte.

Die PCBUS wurden in diesem Versuchsaufbau nach ihrer Generierung 48 Stunden in 500 µl Haltungsmedium inkubiert. Nach dieser Zeit wurde ein Teil der PCBUS in antibiotikafreies Medium überführt und 24 Stunden vor Zugabe der Bakterien inkubiert.

Der andere Teil der PCBUS wurde 24 Stunden vor der Bakterienzugabe mit je einer der drei Testsubstanzen (Mepyramin, Florfenicol, Meloxicam) in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Die minimale Hemmstoffkonzentration (MHK) des S. aureus-Stammes wurde von der diagnostischen Abteilung des mikrobiologischen Instituts der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bestimmt und lag für Florfenicol bei 4 µg/ml. Dem antibiotikafreien Medium der PCBUS wurde im vierfachen Ansatz Mepyramin in den Konzentrationen 30, 100 und 300 µg/ml, Florfenicol in den Konzentrationen 1, 4 und 10 µg/ml und Meloxicam in den Konzentrationen 0,35, 3,5 und 35 µg/ml zugesetzt. Alle PCBUS wurden bis zum Versuchsstart bei 37°C und 5 % CO2-Begasung inkubiert.

Da der Versuch nach einer einmaligen Probenentnahme beendet wurde, konnte zu diesem Zeitpunkt der komplette Überstand von ca. 500 µl zur weiteren Bearbeitung bei –20°C in einem Probengefäß gesichert werden.

Material und Methoden

Tabelle 6: Konzentrationen der Testsubstanzen

Testsubstanz Konzentration Ansätze

30 µg/ml 4

Meypramin 100 µg/ml 4

300 µg/ml 4

1 µg/ml 4

Florfenicol 4 µg/ml 4

10 µg/ml 4

0,35 µg/ml 4

Meloxicam 3,5 µg/ml 4

35 µg/ml 4

Am Versuchstag wurde dem Nährmedium aller PCBUS, ohne sowie mit Vorinkubation mit den Testsubstanzen, eine Bakteriensuspension mit der Konzentration von 2,5 x 10⁷ KBE und je eine Testsubstanz einer bestimmten Konzentration (s. Tabelle 6) zugesetzt. Acht PCBUS wurden ohne Testsubstanzen, aber mit zugesetzten Bakterien und weitere acht ausschließlich mit dem Medium inkubiert. Auch bei diesem Vorgehen wurde darauf geachtet, dass die unterschiedlich behandelten PCBUS auf verschiedenen 24-Wellplatten inkubieren konnten. Über die Versuchszeit von 6 Stunden inkubierten die PCBUS bei 37°C und 5 % CO2-Begasung. Eine Übersicht des zeitlichen Verlaufs von der Gewinnung der PCBUS bis zum Ende des Versuchs bietet Abbildung 8. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Überstände in Reaktionsgefäßen gesichert und bei –20°C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.

Die gewonnenen Überstände wurden auf das Vorhandensein der Zytokine IL-1ß und IL-6 mittels ELISA untersucht.

Material und Methoden

Abbildung 8: Zeitverlauf des Infektionsversuchs; an jedem aufgeführten Zeitpunkt wurde ein Vitalitätstest durchgeführt; nach 48 und 72 Stunden wurde mit 100 µl des Überstandes eine mikrobiologische Untersuchung durchgeführt; nach 48 Stunden wurde eine Hälfte der PCBUS mit den Testsubstanzen der jeweiligen Konzentration vorinkubiert; der Blitz markiert die Beimpfung der PCBUS mit Bakterien in Anlehnung an den Versuchsablauf des Kapitels 3.2.8.2 und die Zugabe der Testsubstanzen in verschiedenen Konzentrationen (Tabelle 6)

3.2.8.3. Untersuchung der Überstände auf das Vorhandensein von Immunmediatoren mittels Ezyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Die Durchführung der ELISA erfolgte, je nach verwendetem Kit, nach den Angaben des Herstellers. Durch Vorversuche wurde die Verdünnung der Probenüberstände ermittelt, die nötig war, um ein auswertbares Ergebnis der Messung zu erhalten.

Im Dokument Bovine Euterpräzisionsschnitte als Modell des frühen Infektionsgeschehens einer Mastitis (Seite 34-0)