Gram-Färbung der PCBUS

An sechs mit S. aureus (ATCC^®29213, Rd5) sowie E. coli (ATCC^®25922, 4520/11/18) infizierten PCBUS wurde eine Gram-Färbung zur Detektion der im Versuch eingesetzten Bakterien durchgeführt. Zu allen Untersuchungszeitpunkten konnten jeweils grampositive und gramnegative Bakterien nachgewiesen werden. In den PCBUS, die nur mit dem Nährmedium inkubiert wurden, konnten durch die Färbung keine Bakterien sichtbar gemacht werden (Abbildung 16).

Exemplarisch ist in Abbildung 14 ein mit E. coli 4520/11/18 infizierter gram-gefärbter PCBUS bei einer 100-fachen Vergrößerung abgebildet. Es sind mehrere rot gefärbte Stäbchen zu erkennen. Dabei fällt auf, dass die rot gefärbten Stäbchen besonders oft im Bereich des interstitiellen Bindegewebes zu finden sind. Bei der gewählten Färbemethode ist diese Anfärbung charakteristisch für gramnegative Stäbchen. Dies ließ daher die Vermutung zu, dass in dem untersuchten PCBUS die in dem Versuch eingesetzten E. coli Bakterien zu sehen sind. Bestätigt wurde diese Vermutung durch die Durchführung einer mikrobiologischen Untersuchung des Versuchsüberstandes.

Die Auswertung der über Nacht gewachsenen Kolonien mittels Bunter Reihe zeigte, dass es sich bei den untersuchten Bakterien zu 99,9 % um E. coli handelte.

Abbildung 15 zeigt einen gram gefärbten PCBUS nach Infektion mit S. aureus Rd5, bei einer 100-fachen Vergrößerung. Besonders in der Grenzregion des Gewebes sind dunkelviolette, in Gruppen angeordnete Kokken zu erkennen. Die spezifische Farbe ist bei dieser Art der Färbung ein Indiz für grampositive Bakterien. Auch in diesem Fall wurde nach einer Anzucht der Bakterien aus dem Versuchsüberstand über Nacht eine Bunte Reihe durchgeführt, die mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit zeigte, dass es sich bei den untersuchten Bakterien um S. aureus handelte.

Ergebnisse

49

Abbildung 14: Gram-Färbung eines PCBUS nach Infektion mit E.coli 4520/11/18; der Pfeil zeigt beispielhaft auf ein gram-negativ gefärbtes Stäbchen; 100x Öl

Abbildung 15: Gram-Färbung eines PCBUS nach Infektion mit S. aureus Rd5; der Pfeil zeigt beispielhaft auf eine gram-positive Kokke; 100x Öl

Ergebnisse

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Abbildung 16: Gram-Färbung eines PCBUS in Nährmedium, ohne Zugabe von Bakterien; 100x Öl

Ergebnisse

51 4.5.2. Freisetzung von IL-1ß

Abbildung 17 zeigt die IL-1ß-Konzentrationen der mit den Stimulanzien inkubierten PCBUS.

Die IL-1ß-Konzentrationen lagen über den gesamten Versuchszeitraum von 6 Stunden deutlich unterhalb der mit Bakterien infizierten PCBUS. Hier ist am IL-1ß-Freisetzungsprofil der mit PGN-stimulierten PCBUS zu erkennen, dass ein mäßiger Anstieg von 1 bis 6 Stunden vorliegt. Die IL-1ß-Konzentrationen der LPS-stimulierten PCBUS lagen bei allen untersuchten Zeitpunkten auf einem ähnlichen Konzentrationsniveau, sodass kein Anstieg über die Zeit zu erkennen ist.

Die IL-1ß-Freisetzung bei den mit der Kombination aus beiden Substanzen stimulierten PCBUS ist nach 1 Stunde am höchsten und fällt im zeitlichen Verlauf ab.

In Abbildung 18 ist das IL-1ß-Freisetzungsprofil nach der Infektion der PCBUS mit den jeweiligen Bakterienstämmen von E. coli (ATCC^®25922 und 4520/11/18) und in Abbildung 19 von S. aureus (ATCC^®29213 und Rd5) in pg/PCBUS zu sehen. Die beschriebenen Signifikanzen sind immer auf die jeweilige Kontrolle des betrachteten Messzeitpunktes bezogen.

Bereits nach 1 Stunde ist ein höchst signifikanter Anstieg der IL-1ß-Konzentration der mit E. coli ATCC^®25922 infizierten PCBUS zu sehen. Dieser hoch signifikante Anstieg ist ebenfalls zu den Messzeitpunkten von 4 und 6 Stunden zu erkennen. Der Anstieg der IL-1ß-Freisetzung der mit dem Mastitisisolat infizierten PCBUS ist bereits nach 1 Stunde hoch signifikant und steigt über den Untersuchungszeitraum stetig an.

Über den untersuchten Zeitraum von 1 bis 6 Stunden ist ein Anstieg der IL-1ß-Konzentration der S. aureus infizierten PCBUS zu erkennen. Dabei ist die IL-1ß-Konzentration durch die Infektion der PCBUS durch das klinische Mastitisisolat (Rd5) über den gesamten Zeitverlauf höher als die IL-1ß-Konzentration der PCBUS, welche mit dem ATCC^®-Stamm des S. aureus infiziert wurden.

Zu allen betrachteten Zeitpunkten lag die Konzentration von IL-1ß der mit Nährmedium inkubierten PCBUS unterhalb der mit Bakterien infizierten PCBUS.

Ergebnisse

52 4.5.3. Freisetzung von PGE2

Abbildung 17 zeigt die PGE2-Konzentration in ng/PCBUS der mit den Stimulanzien inkubierten PCBUS zu den Zeitpunkten 4, 6 und 24 Stunden.

Ein Anstieg der PGE2-Konzentration über die Zeit ist bei allen zugegebenen Stimulanzien nicht erkennbar. Hoch signifikante Anstiege der PGE2-Konzentration sind nach 4 Stunden bei den mit LPS sowie den mit der Kombination beider Stimulanzien inkubierten PCBUS zu sehen. Nach 6 Stunden ist bei den beiden Stimulationen ein hoch signifikanter Unterschied erkennbar.

Abbildung 18 zeigt das PGE2-Freisetzungsprofil nach der Infektion der PCBUS mit den jeweiligen Bakterienstämmen von E. coli (ATCC^®25922 und 4520/11/18) und Abbildung 19 von S. aureus (ATCC^®29213 und Rd5) in ng/PCBUS. Die beschriebenen Signifikanzen sind immer auf die jeweilige Kontrolle des betrachteten Messzeitpunktes bezogen.

Bei den PCBUS, die mit dem Referenzstamm des E. coli (ATCC^® 25922) infiziert wurden, war zu den untersuchten Messzeitpunkten kein Unterschied in der freigesetzten PGE2-Konzentration zu erkennen. Ein signifikanter Konzentrationsunterschied von PGE2 gegen die Kontrolle war allerdings nach dem ersten Messzeitpunkt nach 4 Stunden gegeben. Dies ist aber auf die abfallende Konzentration der Kontrolle zum Zeitpunkt von 4 Stunden zurückzuführen. Eine abfallende Konzentrationsmenge an PGE2 war nach 6 Stunden festzustellen. Auch hier kann festgehalten werden, dass das PGE2-Freisetzungsprofil bei dem E. coli-Stamm 4520/11/18 ähnlich dem des E. coli-Referenzstammes (ATCC^®25922) verläuft, allerdings in einem niedrigeren Konzentrationsbereich.

Die mit S. aureus ATCC^® 29213 infizierten PCBUS zeigten bis zum Zeitpunkt von 4 Stunden eine ansteigende Freisetzung an PGE2. Zum Zeitpunkt von 4 Stunden war die PGE2-Konzentration signifikant erhöht. Eine hoch signifikante Erhöhung war auch nach 6 Stunden gegeben. Ein ähnliches PGE2-Freisetzungsprofil, allerdings in gesamtheitlich niedrigeren Konzentrationen, war bei der Infektion der PCBUS mit dem klinischen Mastitisisolat Rd5 des S. aureus zu beobachten. Eine Signifikanz der PGE2-Konzentration gegenüber der Kontrolle war erst nach 6 Stunden gegeben.

Ergebnisse

53 4.5.4. Freisetzung von TNF-α

Abbildung 17 zeigt die TNF-α-Konzentration der mit den Stimulanzien inkubierten PCBUS zu den Zeitpunkten 4, 6 und 24 Stunden.

Ein Anstieg der TNF-α-Konzentration über die Zeit ist bei allen zugegebenen Stimulanzien nicht erkennbar. Erst nach 24 Stunden ist bei allen drei Stimulationsansätzen eine darstellbare TNF-α-Konzentration möglich. Ein hoch signifikanter Anstieg der TNF-α-Konzentration im Gegensatz zu der Kontrolle ist nach 24 Stunden bei den mit LPS stimulierten PCBUS zu sehen.

In Abbildung 18 ist das TNF-α-Freisetzungsprofil nach der Infektion der PCBUS mit den jeweiligen Bakterienstämmen von E. coli (ATCC^®25922 und 4520/11/18) sowie in Abbildung 19 von S. aureus (ATCC^®29213 und Rd5) in pg/PCBUS zu sehen. Die beschriebenen Signifikanzen sind immer auf die jeweilige Kontrolle des betrachteten Messzeitpunktes bezogen.

Bei den PCBUS, welche mit dem Referenzstamm des E. coli infiziert wurden, zeigten sich keine Konzentrationsunterschiede von TNF-α zu den jeweiligen Messzeitpunkten.

Ein signifikanter Unterschied der TNF-α-Konzentration im Bezug zur Kontrolle ist zum ersten Messzeitpunkt von 4 Stunden zu sehen. Ein Anstieg über die untersuchte Zeit ist bei den mit dem Mastitisisolat des E. coli infizierten PCBUS zu erkennen. Höchst signifikante Unterschiede sind nach 4 und 24 Stunden festzustellen.

Ein Anstieg der TNF-α-Freisetzung der S. aureus ATCC^® 29213 infizierten PCBUS ist erst nach 24 Stunden zu sehen; dieser ist signifikant. Bei den PCBUS, welche mit dem klinischen Mastitisisolat infiziert wurden, ist kein Konzentrationsunterschied zu den Zeitpunkten 4 und 6 Stunden zu sehen, gleichwohl ein hoch signifikanter Unterschied in der TNF-α-Freisetzung nach 4 Stunden zu erkennen. Nach 24 Stunden ist ein signifikanter Unterschied der TNF-α-Konzentration der PCBUS, welche mit dem Referenzstamm infiziert wurden und ein hoch signifikanter Unterschied der mit dem Mastitisisolat infizierten PCBUS zu erkennen.

Ergebnisse

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Abbildung 17: Freisetzungsprofile der Immunmediatoren IL-1ß, TNF-α und PGE2 nach Stimulation der PCBUS mit PGN S. aureus, LPS (O111:B5) und der Kombination aus beiden Substanzen;

Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001

Ergebnisse

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Abbildung 18: Freisetzungsprofile der Immunmediatoren IL-1ß, TNF-α und PGE2 nach Infektion der PCBUS mit E. coli ATCC^®25922 und 4520/11/18; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchführung an 6 Eutern je 4 PCBUS;

Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001

Ergebnisse

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Abbildung 19: Freisetzungsprofile der Immunmediatoren IL-1ß, TNF-α und PGE2 nach Infektion der PCBUS mit S. aureus ATCC®29213 und Rd5 ; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Durchführung mit je 4 PCBUS von 6 Eutern;

Legende der Symbole: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001

Ergebnisse

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4.6. Untersuchung von Testsubstanzen zur Beeinflussung des Infektionsgeschehens

4.6.1. Freisetzung von IL-1ß und IL-6

Abbildung 20 zeigt das Freisetzungsprofil von IL-1ß und IL-6 nach der Infektion der PCBUS mit S. aureus Rd5 und der Behandlung mit dem Florfenicol nach 6 Stunden.

Es ist zu erkennen, dass die ausgeschüttete IL-1ß-Konzentrationsmenge bei allen behandelten PCBUS weit niedriger ist als die der nur mit Bakterien infizierten PCBUS.

Hoch signifikant sind die Unterschiede bei den zugegebenen Florfenicol-Konzentrationen 4 µg/ml und 10 µg/ml, unabhängig von der Vorinkubation.

Im Freisetzungsprofil von IL-6 sind keine signifikanten Unterschiede zur Inkubation der PCBUS mit Bakterien zu sehen. Tendenziell ist eine abfallende IL-6-Konzentration bei zunehmender Florfenicolkonzentration in der Gruppe ohne Vorinkubation zu erkennen.

Abbildung 20: IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS 6 Stunden nach Zugabe von

S. aureus Rd5 und der Behandlung von Florfenicol in den Konzentrationen 1, 4 und 10 µg/ml; Ohne Vorinkubation steht für eine zeitgleiche Zugabe der Bakteriensuspension und der Testsubstanz Florfenicol; mit Vorinkubation steht für die Inkubation der PCBUS mit Florfenicol 24 Stunden vor der Bakterienzugabe; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Legende der Symbole: *** p ≤ 0,001

Ergebnisse

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In Abbildung 21 ist die IL-1ß- sowie IL-6-Freisetzung nach der Infektion der PCBUS und der Zugabe von Meloxicam nach 6 Stunden zu sehen.

Bei einer Zugabe der Konzentration von 35 µg/ml Meloxicam lag die IL-1ß-Konzentration niedriger als die der nur mit Bakterien infizierten PCBUS. Auch hier war kein Unterschied zwischen der IL-1ß-Expression der PCBUS bei der 24-stündigen Vorinkubation mit Meloxicam im Gegensatz zu der gleichzeitigen Gabe der Testsubstanz und der Bakteriensuspension zu erkennen. Ein ähnliches Bild ist bei der Expression von IL-6 zu erkennen. In beiden Zytokinfreisetzungsprofilen sind keine signifikanten Unterschiede zu der Bakteriengruppe zu erkennen.

Abbildung 21: IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS 6 Stunden nach der Bakterienzugabe von S. aureus Rd5 und der Behandlung von Meloxicam in den Konzentrationen 0,35, 3,5 und 35 µg/ml; Ohne Vorinkubation steht für eine zeitgleiche Zugabe der Bakteriensuspension und der Testsubstanz Meloxicam; mit Vorinkubation steht für die Inkubation der PCBUS mit Meloxicam 24 Stunden vor der Bakterienzugabe; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Legende der Symbole: *** p ≤ 0,001

Ergebnisse

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Abbildung 22 zeigt das IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS und der Zugabe von Mepyramin. Dabei lag die IL-1ß- sowie IL-6-Konzentration bei allen Behandlungen im Bereich der nur mit Bakterien infizierten PCBUS. Bei keiner zugegebenen Konzentration des Mepyramins sind signifikante Unterschiede zu sehen.

Abbildung 22: IL-1ß- und IL-6-Freisetzungsprofil der PCBUS 6 Stunden nach der Bakterienzugabe von S. aureus Rd5 und der Behandlung von Mepyramin in den Konzentrationen 30, 100 und 300 µg/ml; Ohne Vorinkubation steht für eine zeitgleiche Zugabe der Bakteriensuspension und der Testsubstanz Mepyramin; mit Vorinkubation steht für die Inkubation der PCBUS mit Mepyramin 24 Stunden vor der Bakterienzugabe; Durchführung an je 4 PCBUS von 6 Eutern; Angabe des Medians mit 95% Quartil sowie Angabe der Einzelwerte; Legende der Symbole: *** p ≤ 0,001

Diskussion

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5. Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein In-vitro-Modell etabliert, welches für die Untersuchung der Wirksamkeit von neuen Therapeutika zur Verfügung stehen soll und dabei das 3R-Prinzip im Sinne des Tierschutzes berücksichtigt.

5.1. Herkunft des Probenmaterials

Die bovinen Euter stammten von geschlachteten Milchkühen aus dem Schlachthof in Minden-Lübbecke. Mehrere Studien zeigten bereits, dass Schlachtmaterial zur Untersuchung von unterschiedlichen Fragestellungen mit reproduzierbaren Ergebnissen genutzt werden kann (DE LANGE et al. 1992; KIETZMANN et al. 1993;

BÄUMER u. KIETZMANN 2000).

Die Euter wurden bereits vor Ort adspektorisch und palpatorisch untersucht und nur die für gesund befundenen Euter für den Transport in das Labor ausgesucht. Die erste Überprüfung der Euter vor Ort wurde immer durch dieselbe Mitarbeiterin mit langjähriger Berufserfahrung vorgenommen. Im Labor selbst wurde zusätzlich mit der ermelkbaren Milch des vermeindlich gesunden Euters der Calfifornia-Mastitis-Test (CMT) durchgeführt. Anhand dieser Examinierungen war allerdings nicht zu erkennen, ob in dem vorliegenden Organ eine subklinische Entzündung vorlag, das Tier wegen einer systemisch vorliegenden Erkrankung geschlachtet wurde, in welchem Laktationsstadium das Euter vorlag oder wie alt das Rind war. Ein Vorbericht war bei dieser Art der Materialgewinnung nicht gegeben.

5.2. Gewinnung der PCBUS und histologische Untersuchung

Wenn die in 5.1 genannten Untersuchungen auf ein gesundes Euter hindeuteten, wurde das Gewebe zur Probengewinnung genutzt. Beim Schneiden des Eutergewebes wurde erkennbar, dass jedes Euter eine andere Gewebestruktur und Konsistenz aufwies. Diese Erkenntnis korrelierte zumeist mit der Größe des jeweiligen Euters. Kleine Euter enthielten dabei wenig Milch, das Gewebe war im Allgemeinen derb und überwiegend mit bindegewebigen Septen durchzogen. Das Gewebe von großen Eutern hingegen war eher weich und zeigte größtenteils drüsenartige Anteile sowie ein hohes Milchaufkommen. Die durch Palpation und Adspektion festgestellten

Diskussion

61

Unterschiede zeigten, dass sich die Kühe, von denen die Euter stammten, zum Zeitpunkt der Schlachtung in unterschiedlichen Laktationsstadien befanden. Daher war es wichtig, die Methode der Gewinnung der PCBUS immer an das vorliegende Gewebe anzupassen. Die verschiedenen Laktationsstadien und die Unterschiede der im Euter enthaltenen Milchmenge erforderten beispielsweise eine Anpassung der Anzahl an Waschschritten.

Versuche von PETRY (2017) haben gezeigt, dass sich Eutergewebe mittels eines Dermatoms, welches zum Abtragen von Hautarealen in der Dermatologie eingesetzt wird, schneiden lässt. Bei weichen Geweben wurde die Klinge des Dermatoms schneller stumpf und musste häufiger gewechselt werden, um das Gewebe so schonend wie möglich schneiden zu können.

Die histologischen Ergebnisse der Dickenbestimmung mittels computergestützter Software dieser Arbeit bestätigen, dass eine gute Reproduzierbarkeit in Hinblick auf die Schnittdicke gegeben ist. Dies ist wichtig, da die Gewebedicke Einfluss auf deren Kultivierbarkeit sowie Nährstoffversorgung haben kann. MARTIN et al. (1996) zeigten bei Lungenpräzisionsschnitten, dass diese bei einer Schnittdicke von 250 µm besser mit Sauerstoff sowie Nährstoffen versorgt werden als die Lungenpräzisionsschnitte von DANDURAND et al. (1993) bei einer Dicke von 500–1000 µm.

Das zusätzliche Ausstanzen des dünnen Eutergewebes ermöglichte das Arbeiten mit einer standardisierten Schnittfläche. Dabei wurde der Durchmesser der Biopsiestanzen von 6 mm gewählt, da bei größer gewählten Durchmessern häufiger auch unterschiedlich große Milchgänge in der ausgestanzten Fläche lagen. Dies hätte eine zusätzliche Variabilität der untersuchten Gewebemenge zur Folge gehabt, die bei einer Biopsiestanzengröße von 6 mm umgangen werden konnte. Um einen möglichst großen, zusammenhängenden Zellverbund untersuchen zu können, sollten die ausgestanzten PCBUS nicht kleiner als 6 mm sein.

Ein großer Vorteil dieser Methode ist die große Anzahl an zu generierenden PCBUS.

Bei korrekter Anwendung der Schnitt- und Stanztechnik können aus einem Euterviertel mehr als 200 Euterpräzisionsschnitte gewonnen werden, die viele unterschiedliche Versuchsansätze an Material ermöglichen und dabei von nur einem Tier stammen.

Diskussion

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Die histologische Betrachtung der HE-gefärbten PCBUS-Paraffinschnitte zeigte, dass die PCBUS morphologisch mit Paraffinschnitten aus herkömmlich gewonnenen Eutergewebeproben vergleichbar sind. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von MAGRO et al. (2017), die an ihren Euterexplantaten ebenfalls die morphologische Struktur von bovinem Eutergewebe erkennen konnten.

Innerhalb eines Euters konnten ähnlich verteilte Gewebeanteile beobachtet werden.

Es war aber eine Variation zwischen einzelnen Eutern festzustellen. Diese Variation der morphologischen Gegebenheiten könnte dazu genutzt werden, um Therapieansätze zu unterschiedlichen Laktationsstadien zu untersuchen. Wenn also die Möglichkeit bestünde, das Probenmaterial vom Schlachthof zu beziehen und einen Vorbericht zu dem entsprechenden Tier zu erhalten, wäre die Vielfalt des Probenmaterials ein Vorteil. Da diese Informationen während der Studien zu dieser Arbeit nicht vorlagen, zählt die Variabilität der morphologischen Zusammensetzung allerdings zu den Nachteilen, da die Unterschiede ohne Vorbericht nicht hinreichend erklärt werden konnten.

5.3. Vitalitätsbestimmung der PCBUS

Die Vitalität der PCBUS wurde durch den MTT-Assay ermittelt. Dieser Test wurde schon in zahlreichen Studien verwendet und zählt zu den Standardtests der Vitalitätsbestimmung (CIAPETTI et al. 1993; BOUCHARD et al. 2013; LAMBERMONT et al. 2014). Die ISO 10993-5:2009 Norm (2009) beschreibt, dass bei MTT-Testergebnissen unterhalb von 70 % von einer reduzierten Vitalität gesprochen wird. Daher wurde diese Grenze auch in dieser Arbeit eingesetzt und keine Versuche mit PCBUS durchgeführt, die unterhalb dieses Wertes lagen.

Die Durchführung dieses Tests ist für die verwendeten Gewebe ein finaler Versuch, so dass die Gewebeproben für weiterführende Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung standen. Es wäre für weiterführende Studien erfolgversprechend, über einen Test zu verfügen, mit dem die Vitalität der PCBUS festgestellt werden kann, um anschließend weitergehende Untersuchungen durchführen zu können, ähnlich wie es bei Lungenpräzisionsschnitten der Fall ist. Bei diesen kann die Bewegung des Zilienschlags des Flimmerepithels durch ein Mikroskop beobachtet und die Vitalität so

Diskussion

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bestimmt werden (EBSEN et al. 2002; WOHLSEN et al. 2003; VIETMEIER et al. 2007;

BARTON et al. 2010). In Vorversuchen wurden den PCBUS in verschiedenen Konzentrationen Oxytocin oder Metacholin zugesetzt, da diese Substanzen zur Kontraktion der im Zellverband befindlichen Myoepithelzellen führen (ZAVIZION et al.

1992). Dies konnte hier allerdings nicht beobachtet werden.

Die metabolische Umsetzung des Farbstoffs während des MTT-Assay geschieht durch die mitochondrialen Dehydrogenasen der Drüsenzellen, nicht aber durch das in den PCBUS befindliche Bindegewebe. Wenn das Verhältnis von Drüsen- zu Bindegewebe in den einzelnen PCBUS also unterschiedlich war, konnte das Ergebnis dieses Tests schwanken. Die von einem Euter gewonnenen PCBUS zeigten aber größtenteils eine ähnliche Gewebestruktur sodass von einem ähnlichen Verhältnis von Drüsen- zu Bindegewebe ausgegangen werden. Bei der Betrachtung der PCBUS von unterschiedlichen Eutern zeigte die Gewebezusammensetzung allerdings eine große Variabilität.

Wenn die PCBUS von einem kleinen Euter mit wenig enthaltender Milch generiert wurden, lag die Vermutung nahe, dass es sich um ein Färseneuter handelte. Auch bei Eutern älterer Kühe ist der Anteil von Bindegewebe höher, da die Laktation im Alter abnimmt und Bindegewebe wieder zum vorherrschenden Gewebe im Euter zählt.

Diese PCBUS wiesen ein stark bindegewebiges Netz auf, in dem nur wenig Drüsengewebe zu erkennen war. Die MTT-Ergebnisse dieser PCBUS fielen also im Vergleich niedriger aus als von PCBUS, die von Eutern in der Hochlaktation gewonnen wurden.

Die Schnittdicke sowie die Schnittfläche der PCBUS konnte also nur innerhalb eines Euters zur Beurteilung der Vitalität der PCBUS herangezogen werden. Ein Vergleich der Schnittdicke und –fläche sowie der Vitalität zwischen PCBUS unterschiedlicher Euter konnte allerdings nicht erfolgen.

Es hat sich jedoch an den untersuchten PCBUS gezeigt, dass sie, unabhängig von der Gewebezusammensetzung, zuverlässig über einen Zeitraum von mindestens 96 Stunden kultiviert und in vitalem Zustand gehalten werden konnten.

Diskussion

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5.4. Stimulation der PCBUS

In Vorversuchen wurden PCBUS von zwei Eutern mit PGN, LPS und der Kombination beider Substanzen stimuliert. So sollte getestet werden, ob die PCBUS nicht nur vital, sondern auch stimulationsfähig sind. Die Ergebnisse der Stimulationen durch die Substanzen mit einer Konzentration von je 1 µg/ml zeigen einen deutlichen Unterschied in der freigesetzten PGE2-Menge zwischen den Kontrollen und den stimulierten PCBUS. Nach 3 Stunden konnte ein hoch signifikanter Unterschied zwischen den PCBUS mit der kombinierten Stimulation und der Kontrolle nachgewiesen werden. Nach 6 Stunden waren bei allen Stimulationsansätzen signifikante Unterschiede zur Kontrolle zu sehen.

Hier wird bereits deutlich, dass es durch die etablierte Methodik möglich ist, Gewebepräzisionsschnitte zu generieren, die in der Lage sind, auf äußere Umweltreize zu reagieren. Auf Möglichkeiten der Streuung in den Ergebnissen wird in Kapitel 5.7 eingegangen.

5.5. Etablierung des artifiziellen Infektionsgeschehens

In dieser Arbeit sollte zunächst überprüft werden, ob eine Infektion der PCBUS überhaupt möglich ist, und wenn ja, ob die PCBUS in der Lage sind, durch die

In dieser Arbeit sollte zunächst überprüft werden, ob eine Infektion der PCBUS überhaupt möglich ist, und wenn ja, ob die PCBUS in der Lage sind, durch die

Im Dokument Bovine Euterpräzisionsschnitte als Modell des frühen Infektionsgeschehens einer Mastitis (Seite 58-0)