Aus dem Institut für Physiologische Chemie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für
Pharmazeutische Wissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion (RGS) als Zielgruppe für neue Medikamente – Entwicklung eines Testsystems zur
Suche nach RGS3-Inhibitoren
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Eva-Christina Schliewert
aus Münster
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Hassan Naim
Prof. Dr.Manfred Jung
1. Gutachter: Prof. Dr. Hassan Naim 2. Gutachter: PD Dr. Wolfgang Bäumer
Tag der mündlichen Prüfung: 14. Mai 2007
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 G-Proteine und G-Protein gekoppelte Rezeptoren ... 2
1.2 RGS-Proteine ... 5
1.3 Möglichkeiten der Modulation des Signaltransduktionsweges ... 11
1.4 Zielsetzung der Arbeit ... 13
2 Materialien und Methoden... 14
2.1 Materialien ... 14
2.1.1 Western Blot–Antikörper... 14
2.1.2 Größenmarker für Gele... 14
2.1.3 Chemikalien und Pufferlösungen... 14
2.1.4 Enzyme ... 16
2.1.5 Primer... 16
2.1.6 Vektoren... 16
2.1.7 Bakterienstämme ... 16
2.1.8 Protein... 16
2.1.9 Testsubtanzen... 17
2.1.10 Reaktionssysteme („Kits“)... 17
2.1.11 Reaktionslösungen ... 17
2.1.12 Affinitätschromatographie ... 18
2.1.13 Geräte und sonstige Materialien ... 18
2.2 Methoden ... 20
2.2.1 Klonierung ... 20
2.2.1.1 Primer-Design... 20
2.2.1.2 Polymerasenkettenreaktion (PCR)... 21
2.2.1.3 Agarose-Gelelektrophorese ... 23
2.2.1.4 Topoisomerase-Reaktion ... 23
2.2.1.5 Plasmidaufreinigung ... 24
2.2.1.6 LR-Reaktion zwischen Entryvektor und Destinationsvektor ... 26
2.2.2 Proteinaufbereitung... 29
2.2.2.1 Proteinexpression... 30
2.2.2.2 SDS-Gelelektrophorese und Westernblot (Immunoblot) ... 30
2.2.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA-Methode ... 32
2.2.2.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford... 32
2.2.2.5 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Proteinbandenvergleich mit
Quantity One (Firma Bio-Rad) ... 33
2.2.2.6 Proteinfärbung mit Coomassie-Blau... 33
2.2.2.7 Proteinfärbung mit Silberfärbung ... 34
2.2.2.8 Lösung und Rückfaltung der Proteine ... 34
2.2.2.9 Aufreinigung der Proteine ... 35
2.2.3 Affinitätschromatographie ... 35
2.2.3.1 Aufreinigung des Gαq... 36
2.2.3.2 Aufreinigung des RGS3... 37
2.2.4 AlphaScreen-Assay... 38
3 Ergebnisse... 42
3.1 Klonierung der DNA ... 43
3.1.1 PCR aus cDNA ... 43
3.1.2 Insertion in einen „Entryvektor“... 43
3.1.3 Umklonierung in Destinationsvektoren ... 44
3.2 Proteinexpression... 45
3.3 AlphaScreen-Assay... 50
3.3.1 Etablierung... 51
3.3.2 Test potentieller RGS3-Inhibitoren im AlphaScreen-Assay ... 57
4 Diskussion... 60
4.1 Proteinexpression und –detektion... 61
4.2 Erhaltung der Proteinaktivität... 62
4.3 Proteinaufreinigung ... 63
4.4 Etablierung des RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assays... 64
4.5 Screening von RGS-Inhibitoren im AlphaScreen-Assay... 66
5 Zusammenfassung ... 70
6 Summary... 71
7 Literatur ... 72
8. Danksagung ... 77
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: RGS3 als 'Drug-Target'... 2
Abb. 2: GTPase – Zyklus eines heterotrimeren G-Proteins... 5
Abb. 3: Struktur und Einteilung der humanen RGS –Proteine... 7
Abb. 4: Isoformen von RGS3 ... 8
Abb. 5: Domänenstruktur von RGS3 (Isoform 6). ... 8
Abb. 6: DNA-Sequenz der klonierten Proteine ... 22
Abb. 7: Gateway-Klonierungssystem ... 26
Abb. 8: Sequenz der klonierten Proteine ... 29
Abb. 9: Prinzip des AlphaScreen Assays... 39
Abb. 10: Strukturformeln der potentiellen Inhibitoren, „Hits“ des virtuellen Screenings... 41
Abb. 11: PCR-Amplifikation der RGS3- und Gαq-Sequenz... 43
Abb. 12: Kontrollverdau der RGS3- und Gαq-Klonierungsvektoren... 44
Abb. 13: Kontrollverdau der rekombinanten Destinationsvektoren... 45
Abb. 14: Kontrolle der Proteinexpression und Verifizierung des Proteintags ... 46
Abb. 15: Zeitverlauf der Proteinexpression... 46
Abb. 16: RGS3-Koloniewahl... 47
Abb. 17: Überprüfung der Löslichkeit von Gαq und RGS3... 47
Abb. 18: Gαq und RGS3-Detektion nach Rückfaltungsprotokoll ... 48
Abb. 19: RGS3-GST-Aufreinigung... 49
Abb. 20: Aufreinigung von Gαq-Biotin-Fusionsprotein ... 50
Abb. 21: Kompetitive Verdrängung des biotinylierten GST durch die rekombinanten Proteine ... 52
Abb. 22: Unspezifische Interferenz des E.coli-Lysats mit dem AlphaScreen-Assay 53 Abb. 23: Experimentelle Bestimmung des optimalen Verhältnisses zwischen RGS3 und Gαq ... 54
Abb. 24: Einfluss von GTP-γ-S im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay... 54
Abb. 25: Kompetition durch Gαq/Gαi... 55
Abb. 26: Einfluß des Inhibitor-Lösungsmittels DMSO auf das Bindungssignal des RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assays... 56
Abb. 27: Test verschiedener Konzentrationen des Neubig-RGS4-Inhibitors im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay ... 57
Abb. 28: Einfluß der Substanz HTS 07963 im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay ... 58
Abb. 29: Einfluß der Substanzen 2, 3 und 4 aus „virtuellem Screening“ im
AlphaScreen... 59 Abb. 30: Vergleich der Sequenzen von Gαq und Gαi1 (A) und RGS3 und RGS4 (B
und C) ... 68
Abkürzungsverzeichnis
BSA : Bovines Serum Albumin cDNA : complementary DNA cps : counts per second DMSO : Dimethylsulfoxid DTT : Dithiothreitol
EDTA : Ethylendinitrilotetraessigsäure – Dinatriumsalz
GAP : GTPase accelerating protein (GTPase-beschleunigendes Protein) GDP : Guanosindiphosphat
GPCR : G-Protein coupled receptor (G-Protein-gekoppelter Rezeptor) GST : Glutathion-S-Transferase
GTP : Guanosintriphosphat IP3 : Inositoltriphoshat
IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
NA : Noradrenalin
PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction
RGS : Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion SDS : Sodiumdodecylsulfat
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Es gibt viele Krankheiten, deren Ätiologie noch nicht vollständig geklärt ist. Dazu zählen auch Erkrankungen wie Epilepsie, Parkinson, Alzheimer, Herzversagen, Schmerz, Spastiken oder psychiatrische Störungen wie die Schizophrenie oder depressive Erkrankungen.
In aktuellen Untersuchungen wird diskutiert, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren und ihre Regulatoren einen Einfluss auf diese Krankheitsbilder haben (HOLLINGER et al.
2002; ZHONG et al. 2001). Besonders der Überexpression der Kontrollproteine wird eine entscheidende Rolle zugewiesen.
Am Beispiel der Depression lässt sich die Bedeutung der G-Protein–vermittelten Signaltransduktion und deren Funktion als Drug-Target gut aufzeigen: Es gibt eine Reihe von Hypothesen, die auf der neurobiologischen Ebene Erklärungsversuche für die Ätiologie der depressiven Erkrankung darstellen. Schon 1965 postulierte Schildkraut in der „Katecholamin-Hypothese“ ein Ungleichgewicht der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Adrenalin bei affektiven Störungen. Einige Jahre später vermuteten Janowsky et al., dass ein Ungleichgewicht der cholinergen und adrenergen Transmitter das Krankheitsbild hervorruft (JANOWSKY et al. 1972). Spätere Forschungsarbeiten verlagerten den Fokus auf die zelluläre Ebene und vermuteten z.B. eine veränderte Signaltransduktion von G-Protein gekoppelten Neurotransmitter-Rezeptoren (DEAN et al. 2004). Die Bedeutung der noradrenergen Signaltransduktion im Rahmen der depressiven Erkrankung zeigt der therapeutische Erfolg der Noradrenalin – Wiederaufnahmehemmer (Wirkstoff: Reboxetin). Durch die Unterdrückung der NA- Wiederaufnahme bleibt der Neurotransmitter länger im synaptischen Spalt und verstärkt so das noradrenerge Signal. Bezeichnet man diesen Weg aus zellulärer Sicht als eine
„exogene“ Amplifikation des Neurotransmitter-Signals, so stellt die Inhibition der RGS- Moleküle, die im Inneren der Zelle den Neurotransmitterrezeptor „ausschalten“, eine
„endogene“ Amplifikation des Neurotransmittersignals dar.
Abb. 1: RGS3 als 'Drug-Target'
Neurotransmitter-vermittelte Rezeptoraktivierung wird über G-Proteine auf ein Effektorenzym vermittelt.
RGS-Proteine schalten das G-Protein in den „OFF-Zustand“ zurück. Wird das RGS-Protein selber inhibiert, so bleibt das G-Protein länger im „ON-Zustand“, das heißt, der Transmittereffekt wird verstärkt (Modifiziert nach Nature Reviews. Drug Discovery 1(3):187, 2002).
So könnten Inhibitoren dieser Regulationsproteine beispielsweise auch in der Schmerztherapie Einsatz finden, indem sie die Wirkung endogener Opioide steigern und die Sensibilität für synthetische Opioide erhöhen (NEUBIG et al. 2002).
In Folge dieser Erkenntnisse eröffnen sich Optionen zu einer pharmakotherapeutischen Modulation dieses Systems und die Notwendigkeit zur Suche nach potentiellen Wirkstoffen.
1.1 G-Proteine und G-Protein gekoppelte Rezeptoren
Die Fähigkeit, auf externe Signale mit einer intrazellulären Antwort zu reagieren, ist für die einzelne Zelle, aber auch für den Gesamtorganismus von entscheidender Rolle. Eine wichtige Rolle in dieser Signaltransduktion wird von transmembranären Rezeptoren und den zugehörigen Signalkaskaden übernommen. Das Standardmodell der guanidinnukleotidbindenden Signaltransduktion besteht aus drei Komponenten:
Rezeptor, G-Protein und Effektor. Der Rezeptor ist ein helikales Zellprotein, das die Zellmembran sieben Mal durchspannt und an ein G-Protein gekoppelt ist. G-Proteine sind eine heterogene Gruppe von Proteinen, die in der Lage sind, Guanin-Nucleotide, also GTP und GDP, zu binden.
Als Effektoren können verschiedene Proteine wirken. Es werden einige Na- und K- Ionenkanäle, verschiedene Kinasen (Tyrosin und Serin/Threonin-Kinasen), Phospholipase C und Adenylylcyclasen durch die G-Proteine beeinflusst.
1 Einleitung 3
G-Proteine kommen in zwei Zuständen, „on“ und „off“, bzw. aktiv und inaktiv, vor.
Diese Grundzustände werden durch die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beeinflusst.
Durch die Bindung eines Liganden erfährt der Rezeptor eine Konformationsänderung, die schließlich zu einer Aktivierung des G-Proteins führt (PFEUFFER et al. 1988).
Das G-Protein ist heterotrimer, besteht also aus drei Untereinheiten, Gα, Gβ, Gγ.
Zurzeit sind 16 Gene, die Gα, 5 Gene, die Gβ, und 12 Gene, die Gγ kodieren, bekannt (DOWNES et al. 1999). Gemeinhin werden die G-Proteine gemäß ihrer Gα- Untereinheit in 4 Gruppen eingeteilt: Gαi, Gαs, Gαq und Gα12/13.
Gα-Untereinheiten bestehen aus zwei Domänen; einer GTPase-Domäne mit den sogennanten „Switch Regions“, die an der Bindung und Spaltung von GTP beteiligt sind, und einer helikalen Domäne, die das GTP in das Zentrum des Proteins transportiert. Diese helikale Domäne weist zwischen den verschiedenen Gα- Untergruppen große Unterschiede auf und könnte die Ursache für unterschiedliche Spezifität der verschiedenen G-Proteinfamilien sein.
Die Gβ-Untereinheit hat β-Faltblattstruktur und interagiert mit der Gγ-Untereinheit. Der Gβγ-Komplex bindet an eine hydrophobe Tasche in Gα-GDP. Diese Tasche wird durch die Bindung von GTP an Gα entfernt und somit wird die Affinität von Gβγ zu Gα gesenkt. Dadurch dissoziiert der trimere Gαβγ-Komplex.
Die aktivierten Untereinheiten interagieren nun mit unterschiedlichen Komponenten, die in der Signalkaskade nachgeschaltet sind, und ihrerseits weitere Effektoren, so genannte „second messengers“ und Ionen freisetzen, die die Zellfunktion steuern.
G-
Protein α-Untereinheit-
Unterfamile Aktivierung
Gs Gsα, Golf Stimulation der Adenylylcyclase
Gl Glα1-3, Goα, Gzα, Gαt Inhibition der Adenylylcyclase
Aktivierung der cGMP Phosphodiesterase (retinale Phototransduktion)
Gq Gqα, G11α, G14α, G16α Aktivierung der Phospholipase Cβ (PLCβ) G12 G12α, G13α Aktivierung des RhoA-Signals, Aktivierung
der PLC4
Tab. 1: Gα – Untereinheit Unterfamilien heterotrimerer G – Proteine und ihre Effekte (NEUBIG et al. 2002)
Die aktivierte Gα-Untereinheit beeinflusst zum Beispiel die Adenylylcyclase oder die Phosphodiesterase. Die Effektoren der βγ-Untereinheiten sind sehr unterschiedlich, es werden Na-und K-Ionenkanäle, unterschiedliche Kinasen (Tyrosin und Serin, Threonin- Kinasen), Phospholipase C und Adenylylcyclasen durch den βγ-Komplex gesteuert.
Der limitierende Faktor bei der Aktivierung des G-Proteins ist die Freisetzung von GDP. GDP wird auch spontan freigesetzt, die Rate ist dabei abhängig von der Art der Gα-Untereinheit.
Die Freisetzungsrate von GDP durch die Stimulation von Rezeptoren hängt davon ab, in welchem Maße der Rezeptor eine Konformationsänderung in der Gα-Untereinheit bewirkt.
Die Beendigung des Signals findet durch die Hydrolyse von GTP zu GDP statt. Die Geschwindigkeit dieser Spaltung ist abhängig von der GTPase-Aktivität der α- Untereinheit. Diese spaltet GTP zu GDP und führt so den Rezeptor vom „on“- in den
„off“-Zustand zurück. Durch die Hydrolyse von GTP zu GDP löst die Gα-Untereinheit sich vom Effektor und reassoziiert mit der βγ-Untereinheit und dem Rezeptor. So ist der Komplex bereit für ein neues Signal von außen.
Die intrinsische GTPase–Aktivität der G-Protein-Untereinheit kann durch die Assoziation mit dem Effektor verstärkt werden: Durch diese erhöhte GTPase-Aktivität wird das Signal schneller beendet.
Diese verkürzte Zellantwort kann allerdings auch durch RGS-Proteine (Regulators of G-Protein Signaling) bewirkt werden (ISHII et al. 2003).
1 Einleitung 5
III. I.
II.
Abb. 2: GTPase – Zyklus eines heterotrimeren G-Proteins
Durch die Bindung eines Liganden an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor kommt es zu einer Aktivierung des G – Proteins mit Austausch von GDP gegen GTP(I.). GαGTP dissoziert in der Folge vom Rezeptor und den Untereinheiten Gβγ. Die Untereinheiten können nun weitere Signalkaskaden modulieren (II.).
Das Signal wird durch die Hydrolyse von GTP zu GDP durch die intrinsische GTPase–Aktivität der Gα–
Untereinheit beendet, die Untereinheiten reassoziieren und der Zyklus ist vollendet (III.).
RGS – Proteine beschleunigen die intrinsische GTPase–Aktivität der Gα–Untereinheit und verkürzen so die Dauer des Signals. (CABRERA-VERA et al. 2003).
1.2 RGS-Proteine
RGS-Proteine sind Proteine, die an die Gα-Untereinheit binden und die Hydrolyse von GαGTP zu GαGDP beschleunigen, sogenannte „GTPase accelerating Proteins“ (GAPs), wodurch sie die die Inaktivierung des G-Proteins um ein Tausendfaches beschleunigen.
RGS-Proteine wurden erst in den 90er Jahren von drei unterschiedlichen Arbeitsgruppen entdeckt (SIDEROVSKI et al. 1994; DE VRIES et al. 1995; KOELLE et al. 1996; DRUEY et al. 1996).
In Auswertungen der Atomstruktur wurde gezeigt, dass die RGS-Proteine an den Gα- Effektorregionen angreifen und so auch mit dem Effektor um Gα-Proteine konkurrieren (HEPLER et al. 1997).
Im menschlichen Genom sind mehr als 30 verschiedene Proteine, die eine RGS- oder RGS-like-Domäne besitzen, identifiziert.
RGS-Proteine werden ubiquitär, also in vielen verschiedenen Geweben, exprimiert, häufig jedoch in einem zeitlich und räumlich eingeschränkten Muster. Ein wesentlicher Anteil der RGS-Genexpression findet allerdings im Gehirn statt, denn hier liegt eine große Diversität neuronaler und glialer G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vor und somit spielt die Signalmodulation dort eine große Rolle (HOLLINGER et al. 2002).
Da RGS-Proteine Gα-spezifisch und rezeptorspezifisch sind und durch die verschiedenen Spleißvarianten einzigartige Expressionsmuster möglich sind, könnte ein RGS-Inhibitor die Zellantwort über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektiv in bestimmten Geweben steigern.
RGS-Proteine werden, ausgehend von der Homologie der 120 Aminosäuren großen RGS-Domäne und dem Vorhandensein anderer Domänen, in verschiedene Familien eingeteilt (ROSS et al. 2000) (Abb. 3). Die konservierte RGS-Domäne ist für die Aktivierung des G-Proteins (GAP-Aktivität) verantwortlich (ISHII et al. 2003;
NEUBIG et al. 2002).
1 Einleitung 7
Abb. 3: Struktur und Einteilung der humanen RGS –Proteine
Die Proteine werden gemäß ihrer Domänen in verschiedene Unterfamilien eingeteilt. Jede Unterfamilie ist durch das Vorhandensein bestimmter Domänen charakterisiert, die RGS–Domäne ist Merkmal der gesamten RGS – Familie. Quelle: (HOLLINGER et al. 2002)
In dieser Abbildung sind die Proteine so dargestellt, dass der N–Terminus links liegt.
In dieser Arbeit wird die Interaktion eines ubiquitär exprimierten Familienmitgliedes, RGS3 Isoform 4, mit Gαq untersucht (Abb. 4).
RGS3 wurde 1996 erstmals von K.M. Druey am National Institute of Health (NIH) in Maryland/USA kloniert. Die zuerst beschriebene Isoform besteht aus 519 Aminosäuren und hat, basierend auf der Aminosäurenabfolge ohne posttranslatorische Modifikationen, ein Molekulargewicht von 57 kD (DRUEY et al. 1996). RGS3 ist auf
Chromosom 9 codiert. Weitere Isoformen (Spleißvarianten) sind in Abbildung 4 dargestellt.
Abb. 4: Isoformen von RGS3
Diese Abbildung zeigt die verschiedenen bekannten Isoformen von RGS3 im Vergleich. Die Spleißvarianten weisen Unterschiede in ihrer Struktur und Funktion auf. In dieser Arbeit wird Isoform 4 näher untersucht. Quelle: NCBI Entrez Gene
Das RGS3-Protein ist aus mehreren funktionellen Domänen zusammengesetzt (Abb. 5).
Die für die Proteinfamilie charakteristische RGS-Domäne befindet sich am Carboxy- terminalen Ende. Dieser Teil des Proteins bindet an die Gα-Untereinheit und beschleunigt die Hydrolyse von GTP. Darüber hinaus kann RGS allerdings auch mit dem Effektor um Gα konkurrieren und so die Zellantwort modulieren (Effektor- Antagonismus) (ANGER et al. 2004).
Abb. 5: Domänenstruktur von RGS3 (Isoform 6).
Der Balken mit Zahlen symbolisiert die Aminosäuresequenz mit der entsprechenden Position. Die
„Proteinkinase C konservierte Region 2“ (2C) besteht aus einem Ca2+-bindenden Motiv, wie es in Phospholipasen und PKCs vorkommt. Spezielle 2Cs binden Phospholipide, Inositolphosphate und intrazelluläre Proteine1. Die KOG-Domäne (KOG) steht im Zusammenhang mit dem intrazellulären Proteinverkehr, der Sekretion und dem vesikulären Transport2.
In der konservierten RGS-Domäne existiert eine Phosphorylierungsstelle, an die sich abhängig vom Phosphorylierungszustand das RGS-inaktivierende-Protein „14-3-3“
bindet (BENZING et al. 2000). So wird die RGS-Aktivität kontrolliert. Fehlte eine solche Kontrolle, würden in Folge die RGS-Proteine ständig die G-Proteine zu einer erhöhten GTP-Hydrolyserate anregen und so die Signalkaskade auf Höhe des G- Proteins stoppen. Diese Phosphorylierung wird über G-Protein regulierte Kinasen
1 NCBI Conserved Domain Database (CDD)
2 NCBI CDD
1 Einleitung 9
gesteuert, wie z.B. Phosphokinase A, Phosphokinase C und „Extracellular Signal Related Kinase“ (HOLLINGER et al. 2004). Durch die RGS-vermittelte negative Rückkopplungsschleife kann die Rezeptoraktivierung gezielt und sehr genau reguliert werden.
Im nicht aktivierten Zustand sind die RGS-Proteine gleichmäßig im Zytoplasma verteilt.
Nach der Aktivierung des G-Proteins durch einen Liganden wird RGS3 teilweise aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran transloziert (DULIN et al. 1999). Zusätzlich wurde festgestellt, dass RGS3 palmitoyliert wird (CASTRO-FERNANDEZ et al. 2002).
Dabei wird eine 16 Kohlenstoffatom lange Fettsäure an das Protein gekoppelt (BERNSTEIN et al. 2004). Vermutlich dient diese Palmoylierung der Verankerung des RGS3 in der Phospholipiddoppelschicht der Zellmembran.
Grundsätzlich kann aber davon ausgegangen werden, dass Abschnitte im Protein vorhanden sind, die eine Information zur Lokalisation beinhalten. Bei der Untersuchung von RGS3-Deletionsmutanten (DULIN et al. 1999) konnte gezeigt werden, dass diese Information über die Translokation in die Zellmembran auf den ersten 380 Aminosäuren kodiert wird, nicht in der RGS-Domäne. Dieser Effekt wurde weiter untersucht (DRUEY et al. 1996). Hierzu wurde eine klonierte RGS3-Isoform RGS3T (RGS3 truncated) verwendet. Diese Isoform weicht von der 519 Aminosäuren langen Isoform 3 ab, ihr fehlt ein großer Teil des aminoterminalen Endes. RGS3T besteht aus den Aminosäuren 314-519 und so fehlt die Information über die zytoplasmatische Lokalisation und das Protein wird in den Zellkern verbracht.
In weiteren Versuchen mit Deletionsmutanten konnte der für die Translokation in den Zellkern verantwortliche Proteinsequenzbereich weiter eingeschränkt werden. Es handelt sich hierbei um die nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) (DULIN et al. 2000) (ROBBINS et al. 1991).
Eine Überexpression von RGS3T erhöht die Apoptoseanfälligkeit der Zellen (DULIN et al. 2000), eine Funktion von RGS3 im Zellkern kann somit vermutet werden.
Auch andere RGS-Proteine besitzen Proteinabschnitte, die die Information für eine Translokation in den Zellkern kodieren, und so kann eine neuropathologische Relevanz vermutet werden (CHATTERJEE et al. 2000).
Obwohl noch viele Fragen zum genauen Mechanismus der Protein-Protein- Interaktionen der RGS–Proteine und ihre physiologischen Konsequenzen ungeklärt
sind, ist die Tatsache, dass RGS–Proteine einen direkten Einfluss auf G-Proteine und die daran nachgeschalteten Signalkaskaden haben, ein Hinweis auf die resultierenden Modulationsmöglichkeiten im Rahmen der Pharmakotherapie.
1 Einleitung 11
1.3 Möglichkeiten der Modulation des Signaltransduktionsweges
Insgesamt sind fünf verschiedene Möglichkeiten zu einer Beeinflussung des Signaltransduktionsweges vorstellbar: 1. direkte RGS/Gα-Bindung, 2. allosterische Modulation der RGS/Gα-Bindung, 3. selektive Interaktion zwischen RGS und Gα , 4.
Veränderung der RGS-Membranbindung, 5. RGS-Interaktion mit G-Protein- regulierenden Rezeptoren, Regulationsproteinen oder nachfolgenden Effektoren (HOLLINGER et al. 2002):
1. direkte Veränderung der RGS/Gα-Bindung
Zwischen den Aminosäuren der RGS/Gα-Kontaktstellen handelt es sich wohl um die offensichtlichste Angriffsstelle für einen möglichen Einsatz von Therapeutika.
Wirkstoffe, die die Interaktion zwischen RGS und Gα hemmen, könnten die inhibitorischen Effekte auf die Signaltransduktion aufheben, wohingegen Wirkstoffe, die RGS simulieren, das Signal des G-Proteins limitieren könnten.
Bisher wurde berichtet, dass die Oberflächenschleifen der Guanidinnukleotid-
„Switch“-Regionen im aktiven Gα mit der RGS-Domäne in Kontakt treten. Für die Stärke dieser Bindung sind verschiedene Aminosäurenreste relevant. Diese könnten auch als mögliche Angriffsziele für Wirkstoffe fungieren. So bewirkt beispielsweise bei RGS3 eine Phosphorylierung der Aminosäure 164 (Serin) eine verstärkte Interaktion mit dem zytosolischen Gerüstprotein 14:3:3 und verhindert eine Interaktion zwischen RGS und Gα (BENZING et al. 2000). Im Gegensatz dazu aktiviert eine Phosphorylierung von RGS2 durch Phosphokinase C die GAP- Aktivität gegenüber Gαq (CUNNINGHAM et al. 2001).
2 Allosterische Veränderung der RGS/Gα-Bindung
Auch Regionen, die nur indirekt an der Bindung von Gαq und RGS3 beteiligt sind, könnten als Zielstruktur für Therapeutika in Frage kommen. So verhindert die kovalente Bindung einer Palmitinsäure an ein Cystein in der Helix α4 der RGS- Domäne, die nicht direkt an der Bindung zu Gα beteiligt ist, eine Interaktion zwischen RGS und Gα (TU et al. 1999).
3. Selektivität der Interaktion zwischen Gα und RGS
Idealerweise sollte eine Substanz zwischen verschiedenen RGS-Gα Interaktionen unterscheiden können. Aus diesem Grund sind Gruppen, die die Spezifität von RGS bestimmen, besonders interessant. So haben verschiedene RGS-Proteine unterschiedliche Gα-Selektivität. RGS4 ist zum Beispiel ein sehr starkes GAP für Gαi und Gαq, während RGS2 sehr selektiv Gαq inhibiert (INGI et al. 1998;
HEXIMER et al. 1999). Aus solchen Untersuchungen erwächst die Möglichkeit, hochspezifische Gα-Inhibitoren zu entdecken.
4. Veränderung der Membranlokalisation von RGS3
Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität von RGS3 zu inhibieren, ist, die Membranbindung des Proteins zu stören. So verhindern Statine die Isoprenylierung vieler Signalproteine und stören so deren Membranbindung und Signalaktivität (BELLOSTA et al. 2000).
Da RGS-Proteine mit der Plasmamembran assoziieren müssen, um Gα-Signale zu modulieren, könnte eine Veränderung der Membranlokalisation ein interessantes Ziel für therapeutisch wirksame Substanzen sein.
5. Veränderung der RGS-Bindung an GPCR, Effektor- und Regulationsproteine Weil RGS nicht nur direkt mit Gα interagiert, sondern auch direkt an Proteine, die bei der nachgeschalteten Signaltransduktion von Bedeutung sind, bindet, ist eine Hemmung der Interaktion mit diesen Molekülen von Interesse. Dadurch könnten spezifische Zellprozesse wie Ionenleitfähigkeit, Zellwachstum und –differenzierung beeinflusst werden. So ist ein Effektorantagonismus bei RGS2 und RGS3 bekannt (LADDS et al. 007).
Insgesamt ist das Wissen über die spezifischen Proteinbindungen und ihre physiologischen Folgen noch sehr gering, weshalb besonders diese Funktion noch einer Vielzahl von Untersuchungen bedarf.
1 Einleitung 13
1.4 Zielsetzung der Arbeit
In Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern wird eine Überproduktion von RGS diskutiert. So stellen RGS-Proteine ein wichtiges Ziel bei der Entwicklung neuer Pharmakotherapeutika dar.
Aus diesem Grunde ist es Ziel dieser Arbeit, auf der Basis des AlphaScreen-Assays von PerkinElmer ein Testsystem zu entwickeln, das es ermöglicht, Substanzen zu finden, die die Interaktion zwischen RGS3 und Gαq inhibieren.
Dieser Assay soll auf Grundlage der Proteininteraktion zwischen RGS3 und Gαq funktionieren. So werden die notwendigen Gensequenzen von RGS3 und Gαq aus cDNA kloniert und die kodierten Proteine exprimiert. Nachfolgend werden die Proteine im Testsystem verwendet, der Assay soll etabliert, optimiert und für einige ausgewählte Substanzen angewendet werden.
2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Western Blot–Antikörper
Primäre Antikörper:
Anti - Gαq Rabbit IgG Gramsch, Schwabhausen
Anti GST-tag (Mouse) Santa Cruz, USA
Anti RGS3 Rabbit IgG Santa Cruz, USA
Strep-AP Konjugat Invitrogen, Karlsruhe
Sekundäre Antikörper:
Anti Mouse IgG Amersham, München
Anti Rabbit IgG Amersham, München
2.1.2 Größenmarker für Gele
100 Base-Pair Leiter (DNA) Amersham, München
High Range Rainbow Molecular Weight Marker Amersham, München
peqGOLD High Range DNA-Leiter peqLAB, Erlangen
2.1.3 Chemikalien und Pufferlösungen
Agarose Biozym, Hess. Oldendorf
Arginin Applichem, Darmstadt
Bacto Agar Difco Laboratories, USA
Bacto Trypton Difco Laboratories, USA
Carbacillin Roth, Karlsruhe
Dimethylsulfoxid (DMSO) Riedel-de-Haën, Seelze
Dithiothreitol (DTT) Roth, Karlsruhe
Essigsäure Riedel-de-Haën, Seelze
Ethanol Roth, Karlsruhe
2 Materialien und Methoden 15
Ethidiumbromid Schülke, Norderstedt
Ethylendinitrilotetraessigsäure – Dinatriumsalz (EDTA) Serva, Heidelberg
Formaldehyd Riedel-de-Haën, Seelze
GDP Sigma, Taufkirchen
Glutathion oxidiert Applichem, Darmstadt
Gluthation reduziert Applichem, Darmstadt
Glycerin Roth, Karlsruhe
GTP-γ-S Sigma, Taufkirchen
Guanidinhydrochlorid Applichem, Darmstadt
Imidazol Riedel-de-Haën, Seelze
Isopropanol Merck, Darmstadt
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) Sigma, Taufkirchen
Kanamycin Gibco BRL, Eggenstein
Lysozym Merck, Darmstadt
Methanol Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat Gibco BRL, Eggenstein
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco BRL, Eggenstein
Salzsäure (37%) Merck, Darmstadt
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) USB, USA
Yeast Extract Difco Laboratories, USA
Weitere im Text erwähnte Chemikalien wurden von den Firmen Roth, Sigma, Merck oder Applichem in der Qualitätstufe p.a. bezogen.
2.1.4 Enzyme
Taq Proofreading Polymerase AccuPrime PFX Invitrogen, Karlsruhe Restriktionsenzyme:
Cel II Roche, Mannheim
Eco RV Roche, Mannheim
Not I Roche, Mannheim
Sfu I Roche, Mannheim
Sph I Roche, Mannheim
2.1.5 Primer
MWG Biotech AG, München
2.1.6 Vektoren
pENTR/D-TOPO Invitrogen, Karlsruhe
pDest 15 Invitrogen, Karlsruhe
pET104 BioEase Invitrogen, Karlsruhe
2.1.7 Bakterienstämme
BL21Star - Zellen E.coli Invitrogen, Karlsruhe
OneShot Top10 E.coli Invitrogen, Karlsruhe
2.1.8 Protein
Gαq/Gαi-Chimäre-His-Tag Dr. Joachim Orth, AG
Aktories, Pharmakologie, Albert-Ludwig-
Universität Freiburg
2 Materialien und Methoden 17
2.1.9 Testsubtanzen
RGS4-Inhibitor Peptide Specialty
Laboratories GmbH, Heidelberg
HTS 07963 Maybridge, Cornwall, UK
SCR 01461 Maybridge, Cornwall, UK
HTS 05503 Maybridge, Cornwall, UK
ChemBridge 6372993 ChemBridge Corporation,
USA
2.1.10 Reaktionssysteme („Kits“)
BCA Protein Assay Pierce, USA
GST Detection Kit AlphaScreen PerkinElmer, Rodgau-Jügesheim QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
Qiagen Plasmid Mini Kit Qiagen, Hilden
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden
Roti-Black P Kit Roth, Karlsruhe
2.1.11 Reaktionslösungen
Bradford Reagenz Promega, Mannheim
ECL Plus Western Blotting Detection Reagents Amersham, München
Roti-Block Roth, Karlsruhe
Rotiphorese-Gel Roth, Karlsruhe
TMP Stabilized Substrate for HRP Promega, Mannheim Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphate Promega, Mannheim
2.1.12 Affinitätschromatographie
Glutathion Sepharose 4B Amersham, München
Soft Link Soft Release Avidin Resin Promega, Mannheim
2.1.13 Geräte und sonstige Materialien
BioDoc Analyze (UV-Gel) Biometra, Göttingen
CCTV Kamera Panasonic, Hamburg
Dialysiermembran cut-off 10,000 Roth, Karlsruhe Dialysierkassette Slide-A-Lyzer Pierce, USA
Elektrophoresekammer SE 600 Hoefer, USA
Electrophoresis Power Supply EPS 601 Pharmacia, Freiburg EnVision 2102 Multilabel Reader PerkinElmer,
Rodgau-Jügesheim
Gelkammer GNA 200 Pharmacia, Freiburg
Hyperfilm ECL Amersham, München
Immobilon-Membran Millipore , Schwalbach
Kühlzentrifuge 5430 Eppendorf, Wesseling-
Berzdorf
Laborzentrifuge 5415D Eppendorf, Wesseling-
Berzdorf
Laborzentrifuge J2-21 Beckman, Krefeld
Laborzentrifuge Biofuge 13 Heräus, Hanau
LKB Multiphor II (Blot) Pharmacia, Freiburg
OptiPlate-384 PerkinElmer,
Rodgau-Jügesheim
Photometer GeneQuant Pharmacia, Freiburg
Pipetten „eppendorf research“ Eppendorf, Wesseling- Berzdorf
Schüttelinkubator GFL 3031 GFL, Burgwedel
Schüttelinkubator Certotech MO Sartorius AG, Göttingen
Thermomixer Comfort Eppendorf,
Wesseling-Berzdorf
2 Materialien und Methoden 19
Techne Genius (Thermocycler) Techne, Burkhardtsdorf
Ultraturrax Homogenisator Schütt, Göttingen
2.2 Methoden 2.2.1 Klonierung 2.2.1.1 Primer-Design
Die verwendeten Primer wurden mit dem Programm „Primer Express 1.5“ von Applied Biosystems entworfen. Bei der Erstellung der verwendeten Primer waren verschiedene Punkte zu beachten:
Zuerst müssen die relevanten Abschnitte der Aminosäurensequenz des zu klonierenden Proteins durch den 5’- und den 3’-Primer abgedeckt werden (Tabelle 2).
Außerdem ist es für die direktionale Klonierung in den verwendeten Vektor notwendig, am 5’-Ende CAAC einzufügen. Die Schmelztemperatur sollte bei 50-60°C liegen und bei 3’- und 5’-Primer möglichst gleich sein, in der Regel werden Primer mit einer Länge von 18-30 bp verwendet, durch Variation der Länge kann allerdings die Schmelztemperatur verändert werden.
Am 3’-Ende des Primers sollten nicht drei aufeinander folgende gleiche Pyrimidinbasen (Guanin oder Cytosin) liegen, ferner sollte dort nicht Thymidin codiert sein.
Im Fall der vorliegenden Primer ist eine ausgeprägte Haarnadelstruktur der Primer zu beobachten. Das kann zu einer verminderten Amplifizierung der Targetsegmente in der PCR führen, da die Primer statt an die Ziel-DNA zu binden, eine Sekundärstruktur ausbilden. Da nicht alle Anforderungen gleichzeitig erfüllt werden können, wird ein Kompromiss in der Sekundärstruktur des Primers gemacht.
Primer Sequenz
Gαq - forward 5’- CAC CAT GAC TCT GGA GTC CA -3’
Gαq - reverse 5’- TTA GAC ATT GTA CTC CTT CAG G -3’
RGS3 - forward 5’- CAC CAT GAA GAA CAA GCT GG -3’
RGS3 - reverse 5’- CTA AAG CGG GGG ACT CAT C -3’
Tab. 2 : Primer für die Genamplifikation mittels PCR aus ss cDNA
2 Materialien und Methoden 21
2.2.1.2 Polymerasenkettenreaktion (PCR)
In der PCR werden die Gαq und RGS3 (Isoform 4) Genabschnitte aus single stranded cDNA amplifiziert. Die für die Amplifizierung des Gαq verwendete cDNA stammt aus der Tumorzelllinie U373, die mit Noradrenalin stimuliert wurde. Die für die Amplifizierung des RGS3 verwendete cDNA wurde aus humanen Astrozyten isoliert.
Die semiquantitative PCR wird mit dem Techne Genius durchgeführt.
Material: AccuPrimePFX Proofreading DNA Polymerase (Invitrogen, 2,5 U/µl) 10x Reaktionspuffer (Boehringer)
RGS3: ss cDNA aus humanen Astrozyten
Gαq: ss cDNA aus Noradrenalin-stimulierten U373-Zellen Primer: 1,5 µl (10µM in dH2O) (MWG Biotech AG, München)
Für den Reaktionsansatz werden 5 µl 10x Puffer mit 1,5 µl Forward-Primer (Sequenz) und 1,5 µl Reverse-Primer, 0,4 µl Taq Polymerase (1U) und 15,6 µl dH2O in ein 0,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert, das Gemisch wird kurz zentrifugiert und dann in die Techne PCR-Maschine überführt und amplifiziert. Zuerst wird bei 95°C in 60 sec die ss cDNA denaturiert. Im Anschluss wird in 40 Zyklen die DNA zuerst bei 97°C für 15 sec denaturiert, dann folgt für 30 sec bei 55°C die Anlagerung der Primer an das Template und in den folgenden 40 sec wird bei 72°C der Basenstrang verlängert. Zum Schluss folgt eine zehnminütige Phase bei 72°C, in der die Kettenextension beendet wird.
Die Sequenz der amplifizierten Fragmente ist in Abb. 6 dargestellt.
A. 1 agggggtgcc ggcggggctg cagcggaggc actttggaag aatgactctg gagtccatca 61 tggcgtgctg cctgagcgag gaggccaagg aagcccggcg gatcaacgac gagatcgagc 121 ggcagctccg cagggacaag cgggacgccc gccgggagct caagctgctg ctgctcggga 181 caggagagag tggcaagagt acgtttatca agcagatgag aatcatccat gggtcaggat 241 actctgatga agataaaagg ggcttcacca agctggtgta tcagaacatc ttcacggcca 301 tgcaggccat gatcagagcc atggacacac tcaagatccc atacaagtat gagcacaata 361 aggctcatgc acaattagtt cgagaagttg atgtggagaa ggtgtctgct tttgagaatc 421 catatgtaga tgcaataaag agtttatgga atgatcctgg aatccaggaa tgctatgata 481 gacgacgaga atatcaatta tctgactcta ccaaatacta tcttaatgac ttggaccgcg 541 tagctgaccc tgcctacctg cctacgcaac aagatgtgct tagagttcga gtccccacca 601 cagggatcat cgaatacccc tttgacttac aaagtgtcat tttcagaatg gtcgatgtag 661 ggggccaaag gtcagagaga agaaaatgga tacactgctt tgaaaatgtc acctctatca 721 tgtttctagt agcgcttagt gaatatgatc aagttctcgt ggagtcagac aatgagaacc 781 gaatggagga aagcaaggct ctctttagaa caattatcac atacccctgg ttccagaact 841 cctcggttat tctgttctta aacaagaaag atcttctaga ggagaaaatc atgtattccc 901 atctagtcga ctacttccca gaatatgatg gaccccagag agatgcccag gcagcccgag 961 aattcattct gaagatgttc gtggacctga acccagacag tgacaaaatt atctactccc 1021 acttcacgtg cgccacagac accgagaata tccgctttgt ctttgctgcc gtcaaggaca 1081 ccatcctcca gttgaacctg aaggagtaca atctggtcta attgtgcctc ctagacaccc 1141 gccctgccct tccctggtgg gctattgaag atacacaaga gggactgtat ttctgtggaa 1201 aacaatttgc ataatactaa tttattgccg tcctggactc tgtgtgagcg tgtccacaga 1261 gtttgtagta aatattatga ttttatttaa actattcaga ggaaaaacag aggatgctga 1321 agtacagtcc cagcacattt cctctctatc ttttttttag gcaaaacctt gtgactcagt 1381 gtattttaaa ttctcagtca tgcactcaca aagataagac ttgtttcttt ctgtctctct 1441 ctctttttct tttctatgga gcaaaacaaa gctgatttcc cttttttctt cccccgctaa 1501 ttcatacctc cctcctgatg tttttcccag gttacaatgg cctttatcct agttccattc
B. 1 ggatggacgc ctctcccccg gagcagcact ttggggccag cttgggccct ggggatgagc 61 cacaggggac ccacagccta tgcgtgtgag catgtaaccc gggagccagc tgggcccctc 121 gcggggtggg cagaaggacg ggctggccca ggaccctctt ctttgagaca tcccggactc 181 catctcggat gaaagtgctt tgagaaacca cagagttttc tgtttaatgg aagaaagaaa 241 tccagcctct ctccagagtg gcggtggccg gctagacagg agccaaggac atgaagaaca 301 agctggggat cttcagacgg cggaatgagt cccctggagc ccctcccgcg ggcaaggcag 361 acaaaatgat gaagtcattc aagcccacct cagaggaagc cctcaagtgg ggcgagtcct 421 tggagaagct gctggttcac aaatacgggt tagcagtgtt ccaagccttc cttcgcactg 481 agttcagtga ggagaatctg gagttctggt tggcttgtga ggacttcaag aaggtcaagt 541 cacagtccaa gatggcatcc aaggccaaga agatctttgc tgaatacatc gcgatccagg 601 catgcaagga ggtcaacctg gactcctaca cgcgggagca caccaaggac aacctgcaga 661 gcgtcacgcg gggctgcttc gacctggcac agaagcgcat cttcgggctc atggaaaagg 721 actcgtaccc tcgctttctc cgttctgacc tctacctgga ccttattaac cagaagaaga 781 tgagtccccc gctttagggg ccactggagt cgagctcagc gttcacacca ggcgggctgg 841 gtcccctgcc cacctgcctc cctgccccct gtgacggagg gggcaagcaa gcccccagag 901 gctgtgtctc tggacagacg gatagacata cggaagcgag gcctggacca agagaggccc 961 aggctactgg aggagtagaa ggatgggccc cgtggggtcc ccactgcccc ggtacgaggg 1021 ggcccaagac cctggcaggt caggggccct ggccaagcca gatctggagc tgctgctccc 1081 tgctgcggag accgcggagg cttcgcgttg accaagttcc ttaaagaact ggctgatggg 1141 gcaggaggtc caggcctggg ctctcgggcc ctcctagagg gccattggag cttgcagctc 1201 agacccccac tttgagtttt atttatttaa atagtagttg gatgcttggc acgtcgtcct 1261 gtaataggaa acccttgcct catcagtttt cctgatttac aagtgcaata ttttagccaa 1321 tgccttggga gaagctgcca tgcaaaggtg gacaccattc tccagcttca ggggatatgc 1381 tcgtcccggg caccggtggc aggcagctgg ccttctggac taaggcagcc tggggggaca 1441 ctgcagtctg gctacacaca gagatctggc accccctggg tggagtgtcc ctcgggggct 1501 ttgggaaagc atggcaccct cagaccacac agtagccaag ttctggagca aataaaaggc 1561 ctgtgttatt tcttgttctt ga
Abb. 6: DNA-Sequenz der klonierten Proteine
A. Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide (GNAQ), mRNA Gi: 40254461
B. Homo sapiens regulator of G-protein signalling 3 (RGS3), transcript variant 4, mRNA Gi: 19913391
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Markiert sind die Proteinsequenzen, die Primerangriffsstellen sind fettgedruckt.
2 Materialien und Methoden 23 2.2.1.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die amplifizierten Gensequenzen werden in einer Agarose-Gelelektrophorese getrennt, identifiziert und anschließend aufgereinigt.
10 µl der PCR-Produkte werden auf ein 1%-iges horizontales Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt wird, aufgetragen. Als Gel- und Laufpuffer wird 1x TBE verwendet. Als Größenstandard wird die 100 Base-Pair Leiter aufgetragen.
Die Gele werden im UV-Licht mit dem BioDoc Analyze bei 254 nm betrachtet, fotografiert und digital gespeichert.
Die nun auf dem Gel aufgetragenen Proben werden nach Beendigung der Elektrophorese mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) wieder extrahiert.
2.2.1.4 Topoisomerase-Reaktion
Um eine besonders effektive Klonierung zu erreichen, wird das „Gateway-System“ von Invitrogen verwendet, welches statt einer Ligase zur Rekombination eine Topoisomerase einsetzt.
DNA-Topoisomerasen sind in allen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen zu finden.
Sie sind bei Reaktionen beteiligt, in denen die räumliche Struktur der DNA verändert wird. Eine Topoisomerase-Reaktion hat mehrere Schritte:
Zuerst bindet das Enzym an die DNA, so wird eine Phosphatbrücke zwischen einer Tyrosin-Seitenkette des Enzyms und der hierbei gespalteten Phosphordiesterkette der DNA gebildet. Durch diese Bindung bildet sich eine Lücke in der DNA, hier kann nun der DNA-Strang gedreht oder ein intakter DNA-Strang eingebracht werden.
Zum Schluss löst sich die Enzym-DNA-Bindung und die Phosphordiesterkette der DNA bildet sich zurück.
Für diese Reaktion wird keine externe Energie benötigt, weil die Energie auch in der Tyrosin-Phosphat-Brücke erhalten bleibt.
Man unterscheidet zwei Gruppen von DNA-Topoisomerasen: Typ-I-DNA- Topoisomerasen spalten nur einen der beiden DNA-Stränge, durch Typ-II-DNA-
Topoisomerasen werden beide Stränge gespalten und ein intakter Doppelstrang in die Lücke eingeführt.
Bei den durchgeführten Vektorreaktionen handelt es sich demzufolge um Typ-II-DNA- Topoisomerasen, denn es werden die klonierten Gene in den Vektor eingebracht.
Dabei ist zu beachten, dass die PCR-Produkte „blunt end“ repliziert werden müssen, dazu muß in der PCR eine Proofreading Taq-Polymerase verwendet werden, hier die Taq Proofreading Polymerase AccuPrime PFX der Firma Invitrogen.
In der Topoisomerasereaktion werden Vektor und PCR-Produkt in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. 1 µl TOPO-Vektor (2580 bp) hat ein Gewicht von etwa 17,5 ng, dazu werden die in 4 µl dH2O gelösten PCR-Produkte pipettiert.
Das PCR-Produkt von RGS3 hat eine Länge von 506 bp, also müssen entsprechend 3,4 ng in 4 µl dH2O gelöst sein, bei Gαq mit einer Länge von 1079 bp 7,3 ng in 4 µl dH2O.
Reaktionsansatz: 4 µl dH20, darin gelöst PCR-Produkt 1 µl Salt Solution
1 µl TOPO – Vektor
Zur Transformation der kompetenten E. coli werden 2 µl des Reaktionsproduktes zu den Zellen gegeben und nach Herstelleranleitung fortgefahren.
Im Anschluss werden die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten, die mit 50 µg Kanamycin/ml versetzt werden, ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die gewachsenen Kolonien werden in je 2 ml LB-Medium (50 µg Kanamycin/ml) überführt und 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm inkubiert.
2.2.1.5 Plasmidaufreinigung
Je 1,5 ml der Kulturen werden mit Hilfe des Qiagen Plasmid Mini Kits nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Die Eluate werden photometrisch auf ihre Reinheit überprüft.
Um die Größe der eluierten cDNA zu überprüfen, müssen die Plasmide geschnitten werden. Dazu verwendet man Restriktionsenzyme, die den Vektor 5’ und 3’ des Inserts schneiden.
2 Materialien und Methoden 25
Dabei ist zu beachten, dass das verwendete Restriktionsenzym den Vektor nur einmal schneiden sollte und außerdem nicht in das Insert schneidet. Das kann mit dem „NEB Cutter“ unter http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php geprüft werden.
Hier wurden Eco RV, das bei 818 bp, und Not I, das bei der Vektorposition 673 bp schneidet, gewählt.
So ist das ausgeschnittene Insert schließlich um 144 bp der Vektor-DNA länger als die eigentlich eingefügte Sequenz, also 1223 bp bei Gαq und 653 bp bei RGS3.
Die Plasmide werden für eine Stunde bei 37°C mit den Restriktionsenzymen inkubiert.
Um sicherzustellen, dass ein großer Teil der Plasmide geschnitten wird, wird das Enzym in hoher Konzentration eingesetzt.
Reaktionsansatz: 50 µl DNA (~10ng/µl)
6 µl 10x Puffer (Roche) 2 µl Not I in Verdünnung 2 µl Eco RV in Verdünnung
1 µl Not I bzw. 1 µl Eco RV enthält 10 U, 1 µl reagiert also mit 10 µg DNA pro Stunde.
Anschließend werden die Eluate komplett auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt.
Die E. coli - Kolonien mit den erwarteten Resultaten werden in 50 ml LB-Medium (50 µg Kanamycin/ml) überimpft und für 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm bebrütet.
Die Kulturen werden mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Das Eluat wird photometrisch auf seine Reinheit überprüft und auf ein Agarosegel aufgetragen, um zu verifizieren, dass es sich um die erwarteten Produkte handelt.
Zur Absicherung des Ergebnisses wird die rekombinante DNA zusätzlich durch Herrn Dr. Igloi, Institut für Biologie III der Albert-Ludwig-Universtät Freiburg, sequenziert.
2.2.1.6 LR-Reaktion zwischen Entryvektor und Destinationsvektor
In der LR-Reaktion werden die zu klonierenden Sequenzen aus dem Entryvektor in den Destinationsvektor geschleust. LR ist die firmeneigene Abkürzung für „Left-Right“, es werden nur die einander entsprechenden „Attachment Sites“ der Entry- bzw.
Destinationsvektoren miteinander verknüpft.
Durch die Verwendung zweier Vektoren im Rahmen des „Gateway-Systems“ ist es möglich, auszuwählen, in welchem Zellsystem man das Zielprotein exprimieren möchte. So gibt es beispielsweise Vektoren für E. coli, Hefe, humane Zellen oder auch für Insektenzellen. Weiterhin ermöglicht der Destinationsvektor den Einbau einer zusätzlichen Sequenz, eines so genannten „Tags“, an das Protein. Dadurch wird nachfolgend die Aufreinigung des Proteins erleichtert und weitere Verwendungszwecke ermöglicht (Abb. 7).
Abb. 7: Gateway-Klonierungssystem Quelle: Invitrogen
2 Materialien und Methoden 27
Das RGS3-Molekül wird in den pDEST 15 – Vektor (Invitrogen) eingefügt, hier wird dem Molekül ein N-terminaler GST-Tag angehängt, der später für die Konzeptionierung des Alpha-Screen-Assays notwendig ist, aber auch für die Aufreinigung von Vorteil ist.
Gαq wird in den pET104 BioEase (Invitrogen) eingebracht und erhält so einen N-terminalen Biotin-Tag, der für die spätere Verwendung im Alpha-Screen-Assay benötigt wird, aber auch zur Aufreinigung dient.
Für die Reaktion werden 1 µl des Destinationsvektors mit 100 ng des Entryvektors versetzt und mit TE Puffer, pH 8, auf 8 µl aufgefüllt.
Dazu werden 2 µl LR ClonaseII Enzyme Mix pipettiert und die Lösung für eine Stunde bei 25°C inkubiert. Im Anschluß wird 1 µl Proteinase K hinzugefügt und das Gemisch für 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Für die Transformation der kompetenten E.coli-Zellen wird 1 µl des Reaktionsgemisches in 1 Tube OneShot-E.coli (Invitrogen) überführt. Die Tubes werden für 30 Minuten auf Eis gelagert und dann für 30 Sekunden bei 42°C einem Hitzeschock ausgesetzt. Nun werden 250 µl SOC-Medium (2 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glukose) zu den Bakterienzellen gegeben und die Kulturen für eine Stunde bei 37°C und 300 rpm inkubiert.
Im Anschluss wird das Nährmedium in Volumina von 10 µl, 100 µl und 130 µl auf LB- Agarplatten (50 µg Carbacillin/ml) ausgestrichen und bei 37°C für 18 Stunden inkubiert.
Die einzeln gewachsenen Kulturen werden in je 2 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) überführt und bei 37°C und 225 rpm für 14 Stunden inkubiert.
LB-Medium: 0,1 % (w/v) NaCl
0,1 % (w/v) Bactotrypton 0,05 % (w/v) Yeast Extract LB-Agar: 0,1 % (w/v) NaCl
0,1 % (w/v) Bactotrypton 0,05 % (w/v) Yeast Extract 1,5 % (w/v) Bacto Agar
Nach dem Autoklavieren wird dem Medium ein Antibiotikum zugesetzt.
Je 1,5 ml der Bakterienkulturen werden mit Hilfe des Qiagen Plasmid Mini Kits nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Die Eluate werden photometrisch auf ihre Reinheit überprüft. Um die Größe der klonierten Sequenz zu kontrollieren, werden die Plasmide mit Restriktionsenzymen (Roche) versetzt.
Für den Verdau des pDEST15 (5309 bp nach LR-Reaktion) werden Sfu I und Cel II verwendet. Das Insert hat eine Länge von 546 bp und wird zwischen bp 792 und bp 2496 eingefügt. Sfu I schneidet den Vektor bei bp 503, Cel II bei bp 2546, der geschnittene Vektor hat also Teilstücke von 885 bp und 4424 bp Länge.
Der Vektor pET104 (6911 bp nach LR-Reaktion) wird mit den Restriktionsenzymen Sph I, das bei bp 1 schneidet, und Cel II, das bei 2352 bp schneidet, versetzt. Das Insert selbst hat eine Länge von 1119 bp und liegt zwischen den bp 597 und 2280. Die Fragmente haben also eine Länge von 1788 bp und 5123 bp.
Für den Verdau werden je 10 U des Restriktionsenzyms mit 10xPuffer und 500 ng DNA versetzt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Danach werden die Proben auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Als Marker wird die peqGOLD High Range DNA-Leiter verwendet.
Von den positiv geprüften Proben werden Kulturen mit 50 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) angesetzt, diese werden für 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm inkubiert.
Die Kulturen werden mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Das Eluat wird photometrisch auf seine Reinheit geprüft. Auch diese Proben werden zur Überprüfung mit den Restriktionsenzymen versetzt und anschließend elektrophoretisch getrennt.
2 Materialien und Methoden 29
2.2.2 Proteinaufbereitung
In weiteren Schritten werden nun die exprimierten Proteine (Abb. 8) auf ihre Identität getestet und quantifiziert. In Folge werden die Proteine aufgereinigt.
A. 1 mtlesimacc lseeakearr indeierqlr rdkrdarrel kllllgtges gkstfikqmr 61 iihgsgysde dkrgftklvy qniftamqam iramdtlkip ykyehnkaha qlvrevdvek 121 vsafenpyvd aikslwndpg iqecydrrre yqlsdstkyy lndldrvadp aylptqqdvl 181 rvrvpttgii eypfdlqsvi frmvdvggqr serrkwihcf envtsimflv alseydqvlv 241 esdnenrmee skalfrtiit ypwfqnssvi lflnkkdlle ekimyshlvd yfpeydgpqr 301 daqaarefil kmfvdlnpds dkiiyshftc atdtenirfv faavkdtilq lnlkeynlv
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Abb. 8: Sequenz der klonierten Proteine
A. guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide [Homo sapiens]
Gi: 40254462
B. regulator of G-protein signalling 3 isoform 4 [Homo sapiens]
Gi: 19913392
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2.1 Proteinexpression
Für die Proteinexpression (Proteinsequenzen siehe Abb. 8, allerdings ohne Tags) werden BL21Star-Zellen, einem speziellen Stamm zur Proteinexpression (Invitrogen), auf Eis aufgetaut und mit der in Wasser gelösten DNA gemischt. 4 ng der Gαq-DNA werden in 2 µl dH2O gelöst, ebenso 4,5 ng der RGS3-DNA. Die Zellen werden für 30 Minuten auf Eis gelagert, dann folgt für 30 Sekunden ein Hitzeschock bei 42°C mit anschließender Lagerung auf Eis. Nun werden 250 µl SOC-Medium hinzugefügt und für eine Stunde bei 37°C und 225 rpm inkubiert. Schließlich werden 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) hinzugefügt und bei 37°C und 225 rpm für 12 Stunden inkubiert.
500 µl der Kulturlösung werden in 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) überführt und bei 37°C und 225 rpm inkubiert, bis die photometrisch gemessene OD600 0,5-0,8 beträgt.
Nun wird die 10 ml Kultur in zwei Kulturen à 5 ml geteilt, eine dieser Kulturen wird mit 25 µl 200 mM IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM IPTG gebracht. Das ist notwendig, weil das zur Rekombination gewünschte Gen sich auf einem Plasmid befindet, womit die Bakterien transformiert werden. Zur Aktivierung und Translation dieses Gens in ein Protein muß ein Operon aktiv sein. IPTG wird verwendet, um das Lactose-Operon zu aktivieren. Da Gαq biotinyliert wird, wird den E.coli–Bakterien zusätzlich Biotin in einer 2 µM Endkonzentration zur Verfügung gestellt. Zum Startzeitpunkt und danach stündlich für 6 Stunden wird von jeder Kultur eine 500 µl Probe genommen, das Medium abzentrifugiert und das Bakterienpellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -20°C gelagert.
2.2.2.2 SDS-Gelelektrophorese und Westernblot (Immunoblot)
Bei dieser Methode werden Proteine elektrophoretisch getrennt und dauerhaft auf einer Membran fixiert. Die nach Gewicht getrennten Proteine können so durch spezifische Antikörperreaktionen nachgewiesen und zudem die Größe und relative Menge der Proteine bestimmt werden.
Die Bakterienpellets werden in 96 µl dH2O und 24 µl 5x Loading Buffer gelöst, 5 Minuten bei 95°C gekocht, um die Proteine zu denaturieren, und dann auf ein 12%-iges
2 Materialien und Methoden 31
SDS-Polyacrylamidgel (SDS-Page-Gel) aufgetragen. SDS (Sodiumdodecylsulfat) löst die Proteine und gibt ihnen eine negative Ladung, sodass die elektrophoretische Auftrennung nur aufgrund der Proteingröße erfolgt. Als Größenreferenz wird der High Range Rainbow Molecular Weight Marker verwendet.
Zuerst wandern die Proteine bei einer Spannung von 40 Volt 10 Minuten im Sammelgel in Richtung Anode, danach erfolgt die Auftrennung im Trenngel bei 80 Volt für 50 Minuten.
Im Anschluss erfolgt der elektrophoretische Transfer der Proteine auf eine proteinbindende Membran. Durch Anlegen eines Stroms von 65 mA werden die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylfluoridmembran (Immobilon-Membran, Millipore) übertragen und dort hydrophob gebunden.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran werden nun durch eine einstündige Inkubation mit Roti-Block (Roth) abgesättigt.
Die überschüssige Roti-Block-Lösung wird für 15 Minuten mit TBST (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% Tween-20) abgewaschen, danach wird die Membran für zwei Stunden mit dem primären Antikörper inkubiert.
In drei weiteren fünfzehnminütigen Waschschritten mit TBST wird Antikörper, der nicht an Antigen gebunden hat, entfernt. Nun wird die Membran für eine Stunde mit dem sekundären Antikörper (Anti-Rabbit IgG, HRP-konjugiert, Qiagen) inkubiert.
Dieser Antikörper bindet an den Fc-Teil des primären Antikörpers und ist zur Detektion an das Enzym Horseradishperoxydase gekoppelt.
Anschließend erfolgen wieder drei fünfzehnminütige Waschschritte mit TBST, um den überschüssigen Sekundärantikörper zu entfernen.
Für die Detektion erfolgt eine einminütige Inkubation der Membran mit der Visualisierungslösung, um eine Chemilumineszenzreaktion, die auf Röntgenfilm sichtbar ist, hervorzurufen. Der Röntgenfilm wird in einer Dunkelkammer entwickelt und anschließend ausgewertet.
Bei der Auswahl der spezifischen (primären) Antikörper werden zwei Aspekte berücksichtigt:
Zum einen wird das Protein mit einem spezifischen Antikörper detektiert, zum anderen wird ein Antikörper eingesetzt, der gegen den Tag gerichtet ist.
Für die Detektion von Gαq werden somit zwei unterschiedliche Systeme verwendet.
Ein Antikörper (Anti-Gαq, Kaninchen, Gramsch) ist gegen das Protein selber gerichtet,
im anderen System bindet der Antikörper (Strep-AP-Konjugat, Invitrogen) an den Biotin-Tag des klonierten Proteins. Dieser Biotinantikörper kann statt mit einer Chemilumineszenzreaktion auch mit einer Farbreaktion (Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphate) detektiert werden.
RGS3 wird ebenfalls mit einem proteinspezifischen Antikörper (RGS3 AS 1-300, Santa Cruz) und auch mit einem GST-Tag-spezifischen Antikörper (Anti-GST-Tag, Mouse, Santa Cruz) detektiert. Dieser kann mit einer Farbreaktion (TMP Stabilized Substrate for HRP, Promega) oder durch Chemilumineszenz auf einem Film (Hyperfilm ECL, Amersham) sichtbar gemacht werden.
2.2.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA-Methode
Bei der Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem BCA Protein Assay (Pierce) wird die Proteinkonzentration einer Lösung durch Vergleich mit bekannten Standardverdünnungen von BSA (Bovine Serum Albumin) bestimmt. Die Proben werden mit einer Mischung aus Reagenz A und B (Pierce) vermischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Eine Farbreaktion findet statt, wenn das Cu2+-Reagenz mit der Peptidbindung und Cu+ mit Bicinchoninat reagiert. Die Lösungen werden bei 630 nm auf ihre optische Dichte getestet und so die Proteinkonzentration ermittelt.
Dieser Test hat eine Sensitivität von 20-2000 µg/ml.
2.2.2.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Da das Glutathion aus dem Elutionspuffer mit der Proteinmessung im BCA-Assay interferieren kann, ist es notwendig, auf ein anderes Quantifizierungssystem auszuweichen. Hier eignet sich die Proteinbestimmung nach Bradford.
Bei dieser kolorimetrischen Methode wird der Farbstoff Coomassie-Brilliantblau G250 verwendet, der an aromatische und basische Aminosäurereste bindet. Die Standardkurve wird mit linear ansteigenden Konzentrationen von BSA erstellt.
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5 Minuten nach Zugabe des Farbstoffes wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen und die Proteinkonzentration der Probe berechnet. Die Detektionsgrenze dieses Tests liegt bei 1µg Protein /ml.
2.2.2.5 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Proteinbandenvergleich mit Quantity One (Firma Bio-Rad)
Nach der Dialyse lag die Proteinkonzentration der aufgereinigten Proteinprobe unterhalb des Detektionsbereichs der o.g. Bestimmungsmethoden. Um die Konzentration des Proteins abschätzen zu können, wurde ein SDS-Page Gel der Proteinprobe angefertigt, mit Coomassie-Blau angefärbt und im Anschluss entfärbt.
Parallel wurden Proben mit definierter BSA-Konzentration aufgetragen. In dem verwendeten Computerprogramm wird die Bandenstärke der gesuchten Probe mit der Bandenstärke der bekannten Proteinkonzentration an BSA verglichen und anschließend kann so rechnerisch die Konzentration des aufgereinigten Proteins ermittelt werden.
2.2.2.6 Proteinfärbung mit Coomassie-Blau
Mit dieser Färbetechnik werden Proteine quantitativ nachgewiesen. Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blau bindet unspezifisch an die meisten Proteine. Dadurch bleiben nach Anfärbung und anschließender Entfärbung der Gelmatrix die Proteine im Gel als blaue Banden sichtbar. Die Detektionsgrenze der Coomassie-Blau-Färbung liegt bei 50- 100 ng Protein pro Bande.
Die Anfärbung erfolgt in 60 Minuten mit einer Lösung, die aus 40% Ethanol, 10%
Essigsäure, 50% Wasser und 0,05% Coomassie Brilliant Blau besteht. Anschließend wird für 60 Minuten mit einer Lösung aus 40% Ethanol, 10% Essigsäure und 50%
Wasser entfärbt.
Das Gel wird zwischen Zellophanpapier getrocknet.
2.2.2.7 Proteinfärbung mit Silberfärbung
Die Silberfärbung ist eine weitere sehr sensitive Möglichkeit, Proteine nachzuweisen.
Hier bindet sich Silbernitrat unspezifisch an die Proteine und lässt so die Banden sichtbar werden.
Die Detektionsgrenze liegt bei dieser Methodik bei 1-10 ng Protein pro Bande.
Zur Färbung wird das Roti-Black P Kit (Roth) verwendet und nach Herstelleranleitung vorgegangen.
2.2.2.8 Lösung und Rückfaltung der Proteine
Für die nachfolgenden Experimente ist es unabdingbar, dass die Proteine aktiv sind.
Allerdings liegen überexprimierte Proteine in vielen Fällen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter „Inclusion Bodies“, vor, weil sich das Bakterium vor dem Protein durch dessen Abkapselung schützt. So müssen die Proteine mit denaturierenden Reagenzien extrahiert werden. Deshalb muss nach der Extraktion eine Rückfaltung des Proteins in seine native Form durchgeführt werden. Ein etabliertes Rückfaltungsverfahren ist die „Pulsrenaturierung“ nach Rudolph (RUDOLPH et al.
1996). Hier wird das Bakterienpellet erst in PBS, 10µg/ml Lysozym, gelöst. Diese Lösung wird dreimal für 60 Sekunden mit Ultraschall behandelt und in einem anschließenden Zentrifugationsschritt werden bei 40000g für 40 Minuten die löslichen Bestandteile von den unlöslichen getrennt. Die unlöslichen Anteile befinden sich im Pellet, der Überstand wird verworfen.
Das Pellet wird in 6 M Guanidinhydrochlorid (GdmCl), 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0 (4ml/g Pellet) mit Hilfe eines Ultraturrax Homogenisators für 1 min bei Stufe 8 resuspendiert. Die Lösung wird anschließend bei Raumtemperatur für mindestens zwei Stunden gerührt und dann bei 40000g für 40 Minuten zentrifugiert. Die Proteine befinden sich nun im Überstand.
Dieser wird gegen ein hundertfaches Volumen von 6 M GdmCl, 50 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 3,0 bei 4°C dialysiert. Das ist notwendig, um das bei der Renaturierung unerwünschte DTT des Solubilisierungspuffers zu entfernen. Der niedrige pH-Wert
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bewirkt die Protonierung der Sulfhydrylgruppen, so wird eine Oxidation der Cysteinseitenketten und die Bildung von Disulfidbrücken verhindert.
Nachfolgend wird die Proteinkonzentration der Einschlusskörper bestimmt.
Die eigentliche Proteinrenaturierung wird bei 4°C mit der Methode der
„Pulsrenaturierung“ durchgeführt. Dazu wird zu einem Rückfaltungspuffer (1 M Arginin, 50 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA, 1 mM oxidiertes Glutathion, 10 mM reduziertes Glutathion) in Abständen von einer Stunde jeweils eine Proteinkonzentration von 0,1 mg/ml Puffer hinzugefügt. Das ermöglicht die Einstellung eines Gleichgewichts und verringert eine Aggregation noch nicht vollständig zurückgefalteter Proteine.
Nach Zufügen des letzten Pulses wird die Lösung für weitere 12-14 Stunden bei 4°C gehalten und im Anschluss zweimal gegen 50 Volumen 50 mM Tris, pH 8,0, 300mM NaCl, 10% Glycerin, 10 mM Imidazol dialysiert.
Die Proteinkonzentration wird mit der BCA-Proteinbestimmung gemessen und mittels eines Western Blots die Anwesenheit einer bekannten Menge Kontrollprotein quantifiziert.
2.2.2.9 Aufreinigung der Proteine
Die gelösten Proteine werden chromatographisch bei 4°C aufgereinigt. Zur Aufreinigung des Gαq wird die ÄKTA design Pumpe von Amersham Pharmacia Biotech verwendet und nach Anleitung des Herstellers vorgegangen.
2.2.3 Affinitätschromatographie
Das Prinzip der Affinitätschromatographie beruht auf der reversiblen Bindung von Proteinen an einen spezifischen Liganden, der an eine Matrix gekoppelt ist. Durch diese selektive Bindung kann das Zielprotein aus einer Lösung, die verschiedene Proteine enthält, isoliert und konzentriert werden.
Die Interaktion zwischen Ligand und Zielmolekül resultiert aus elektrostatischen oder hydrophoben Wechselwirkungen, van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken. Zur
Elution des Zielproteins können diese Bindungen durch einen kompetetiven Liganden, die Änderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentrationen oder der Polarität gebrochen werden.
So genannte Tags ermöglichen die schnelle Aufreinigung der Proteine in einem Schritt mittels Affinitätschromatographie. Hierzu werden mit der Hilfe von speziellen Destinationsvektoren gezielt Aminosäureketten an das exprimierte Protein angehängt.
RGS3 wird an einen GST-Tag gekoppelt. So wird das kleine RGS-Protein (~19 kDa) mit einem großen Tag (~28 kDa) kombiniert. GST (Glutathion S-Transferase) ist der am zweithäufigsten verwendete Tag. Es ist zudem bekannt, dass ein GST-Tag die Ausbeute und Löslichkeit des Proteins erhöhen kann. Die Aufreinigung erfolgt über Glutathion Sepharose.
Ursprünglich war geplant, Gαq an einen His-Tag zu koppeln, da jedoch die Nickelbrücke eventuell mit einigen der zu testenden Wirkstoffen in Wechselwirkung treten könnte, fiel die Entscheidung für Gαq auf einen Biotin-Tag.
2.2.3.1 Aufreinigung des Gαq
Biotinylierte Proteine binden an Streptavidin, allerdings ist die Bindung zwischen diesen Substanzen sehr stark. Die Dissoziationskonstante (Kd) des Avidin-Biotin- Komplexes beträgt pro Untereinheit 0,6x10-15 M, die des Streptavidin-Biotin- Komplexes 4x10-14 M. Diese Komplexe sind sehr stabil gegenüber denaturierenden Reagenzien, Detergentien, Proteolyse und einem breiten pH-Wert. Somit können die gebundenen biotinylierten Proteine nur unter äußerst stringenten Bedingungen, die das Zielprotein im Allgemeinen inaktivieren, eluiert werden. Um diese Problematik zu umgehen, verwendet man monomeres Avidin statt der tetrameren Form des Streptavidins. Durch die Dissoziation des Avidintetramers zum Avidinmonomer kommt es zu einer Konformationsänderung in der Untereinheit und die Kd für Biotin steigt auf 10-7M, die hohe Bindungspezifität für Biotin bleibt dabei erhalten. So wird eine Elution des gebundenen biotinylierten Proteins unter milden Konditionen ermöglicht.
Allerdings weisen auch diese Formen Nachteile auf, denn monomeres Avidin tendiert dazu, sich zu hochaffinen Tetrameren zusammenzuschließen (GREEN et al. 1973).
2 Materialien und Methoden 37
Vor Verwendung der monomeren Avidinsäule (Soft Link Soft Release Avidin Resin, Promega) wird diese mit 0,1 M NaPO4 equilibriert und nichtreversible Bindungsstellen mit 2 Säulenvolumen 5 mM Biotin in NaPO4-Lösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde abgesättigt. Nach einer Wartezeit von 15 Minuten wird die Säule regeneriert, indem sie zuerst mit 8 Säulenvolumen 10%iger Essigsäure und dann mit 8 Säulenvolumen 100mM NaPO4 (pH 7,0) gewaschen wird.
Der Durchlauf soll einen pH von mindestens 6,8 haben. Nun folgt eine Wartezeit von 30 Minuten, in der sich das Avidin rückfalten kann. Abschließend wird die Säule mit 5 Säulenvolumen 50 mM Tris, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 10 mM Imidazol equilibriert.
Nun kann die Probe mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde auf die Säule gegeben werden. Hierbei bindet das biotinylierte Protein an die Matrix.
Schließlich kann das biotinylierte Protein mit 5 mM Biotin-Lösung von der Säule verdrängt werden. Das Eluat wird mittels BCA-Proteinbestimmung auf seinen Proteingehalt getestet und im Western Blot die Anwesenheit von Gαq geprüft.
2.2.3.2 Aufreinigung des RGS3
Die Aufreinigung des an einen GST-Tag gekoppelten RGS3 erfolgt mit Glutathion Sepharose 4B (Amersham). Die Beads (200 µl pro Liter E. coli – Kultur) werden zweimal mit jeweils 1 ml PBS gewaschen und bei 14000 rpm bei 4°C abzentrifugiert.
Dann werden sie zu der mittels Pulsrenaturierung rückgefaltetem Proteinlösung gegeben und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. In dieser Zeit bindet das GST-RGS3 an die Sepharosebeads. Im Anschluss werden die Beads bei 400 rpm bei 4°C sedimentiert und wiederum zweimal mit je 1 ml PBS und zweimal mit je 1 ml Salzpuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl) gewaschen. Die Elution des gebundenen Proteins erfolgt durch zehnminütige Inkubation mit dem Elutionspuffer (10 mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Die Elution wird insgesamt dreimal durchgeführt und im Anschluss die Eluatsfraktionen im Bradford-Proteinassay auf ihren Proteingehalt überprüft.
Zusätzlich wird mittels eines Western Blots auch noch die Identität der aufgereinigten Proteine kontrolliert.
