2.2 Methoden
2.2.2 Proteinaufbereitung
In weiteren Schritten werden nun die exprimierten Proteine (Abb. 8) auf ihre Identität getestet und quantifiziert. In Folge werden die Proteine aufgereinigt.
A. 1 mtlesimacc lseeakearr indeierqlr rdkrdarrel kllllgtges gkstfikqmr 61 iihgsgysde dkrgftklvy qniftamqam iramdtlkip ykyehnkaha qlvrevdvek 121 vsafenpyvd aikslwndpg iqecydrrre yqlsdstkyy lndldrvadp aylptqqdvl 181 rvrvpttgii eypfdlqsvi frmvdvggqr serrkwihcf envtsimflv alseydqvlv 241 esdnenrmee skalfrtiit ypwfqnssvi lflnkkdlle ekimyshlvd yfpeydgpqr 301 daqaarefil kmfvdlnpds dkiiyshftc atdtenirfv faavkdtilq lnlkeynlv
B. 1 mknklgifrr rnespgappa gkadkmmksf kptseealkw geslekllvh kyglavfqaf 61 lrtefseenl efwlacedfk kvksqskmas kakkifaeyi aiqackevnl dsytrehtkd 121 nlqsvtrgcf dlaqkrifgl mekdsyprfl rsdlyldlin qkkmsppl
Abb. 8: Sequenz der klonierten Proteine
A. guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide [Homo sapiens]
Gi: 40254462
B. regulator of G-protein signalling 3 isoform 4 [Homo sapiens]
Gi: 19913392
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2.1 Proteinexpression
Für die Proteinexpression (Proteinsequenzen siehe Abb. 8, allerdings ohne Tags) werden BL21Star-Zellen, einem speziellen Stamm zur Proteinexpression (Invitrogen), auf Eis aufgetaut und mit der in Wasser gelösten DNA gemischt. 4 ng der Gαq-DNA werden in 2 µl dH2O gelöst, ebenso 4,5 ng der RGS3-DNA. Die Zellen werden für 30 Minuten auf Eis gelagert, dann folgt für 30 Sekunden ein Hitzeschock bei 42°C mit anschließender Lagerung auf Eis. Nun werden 250 µl SOC-Medium hinzugefügt und für eine Stunde bei 37°C und 225 rpm inkubiert. Schließlich werden 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) hinzugefügt und bei 37°C und 225 rpm für 12 Stunden inkubiert.
500 µl der Kulturlösung werden in 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) überführt und bei 37°C und 225 rpm inkubiert, bis die photometrisch gemessene OD600 0,5-0,8 beträgt.
Nun wird die 10 ml Kultur in zwei Kulturen à 5 ml geteilt, eine dieser Kulturen wird mit 25 µl 200 mM IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM IPTG gebracht. Das ist notwendig, weil das zur Rekombination gewünschte Gen sich auf einem Plasmid befindet, womit die Bakterien transformiert werden. Zur Aktivierung und Translation dieses Gens in ein Protein muß ein Operon aktiv sein. IPTG wird verwendet, um das Lactose-Operon zu aktivieren. Da Gαq biotinyliert wird, wird den E.coli–Bakterien zusätzlich Biotin in einer 2 µM Endkonzentration zur Verfügung gestellt. Zum Startzeitpunkt und danach stündlich für 6 Stunden wird von jeder Kultur eine 500 µl Probe genommen, das Medium abzentrifugiert und das Bakterienpellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -20°C gelagert.
2.2.2.2 SDS-Gelelektrophorese und Westernblot (Immunoblot)
Bei dieser Methode werden Proteine elektrophoretisch getrennt und dauerhaft auf einer Membran fixiert. Die nach Gewicht getrennten Proteine können so durch spezifische Antikörperreaktionen nachgewiesen und zudem die Größe und relative Menge der Proteine bestimmt werden.
Die Bakterienpellets werden in 96 µl dH2O und 24 µl 5x Loading Buffer gelöst, 5 Minuten bei 95°C gekocht, um die Proteine zu denaturieren, und dann auf ein 12%-iges
2 Materialien und Methoden 31
SDS-Polyacrylamidgel (SDS-Page-Gel) aufgetragen. SDS (Sodiumdodecylsulfat) löst die Proteine und gibt ihnen eine negative Ladung, sodass die elektrophoretische Auftrennung nur aufgrund der Proteingröße erfolgt. Als Größenreferenz wird der High Range Rainbow Molecular Weight Marker verwendet.
Zuerst wandern die Proteine bei einer Spannung von 40 Volt 10 Minuten im Sammelgel in Richtung Anode, danach erfolgt die Auftrennung im Trenngel bei 80 Volt für 50 Minuten.
Im Anschluss erfolgt der elektrophoretische Transfer der Proteine auf eine proteinbindende Membran. Durch Anlegen eines Stroms von 65 mA werden die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylfluoridmembran (Immobilon-Membran, Millipore) übertragen und dort hydrophob gebunden.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran werden nun durch eine einstündige Inkubation mit Roti-Block (Roth) abgesättigt.
Die überschüssige Roti-Block-Lösung wird für 15 Minuten mit TBST (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% Tween-20) abgewaschen, danach wird die Membran für zwei Stunden mit dem primären Antikörper inkubiert.
In drei weiteren fünfzehnminütigen Waschschritten mit TBST wird Antikörper, der nicht an Antigen gebunden hat, entfernt. Nun wird die Membran für eine Stunde mit dem sekundären Antikörper (Anti-Rabbit IgG, HRP-konjugiert, Qiagen) inkubiert.
Dieser Antikörper bindet an den Fc-Teil des primären Antikörpers und ist zur Detektion an das Enzym Horseradishperoxydase gekoppelt.
Anschließend erfolgen wieder drei fünfzehnminütige Waschschritte mit TBST, um den überschüssigen Sekundärantikörper zu entfernen.
Für die Detektion erfolgt eine einminütige Inkubation der Membran mit der Visualisierungslösung, um eine Chemilumineszenzreaktion, die auf Röntgenfilm sichtbar ist, hervorzurufen. Der Röntgenfilm wird in einer Dunkelkammer entwickelt und anschließend ausgewertet.
Bei der Auswahl der spezifischen (primären) Antikörper werden zwei Aspekte berücksichtigt:
Zum einen wird das Protein mit einem spezifischen Antikörper detektiert, zum anderen wird ein Antikörper eingesetzt, der gegen den Tag gerichtet ist.
Für die Detektion von Gαq werden somit zwei unterschiedliche Systeme verwendet.
Ein Antikörper (Anti-Gαq, Kaninchen, Gramsch) ist gegen das Protein selber gerichtet,
im anderen System bindet der Antikörper (Strep-AP-Konjugat, Invitrogen) an den Biotin-Tag des klonierten Proteins. Dieser Biotinantikörper kann statt mit einer Chemilumineszenzreaktion auch mit einer Farbreaktion (Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphate) detektiert werden.
RGS3 wird ebenfalls mit einem proteinspezifischen Antikörper (RGS3 AS 1-300, Santa Cruz) und auch mit einem GST-Tag-spezifischen Antikörper (Anti-GST-Tag, Mouse, Santa Cruz) detektiert. Dieser kann mit einer Farbreaktion (TMP Stabilized Substrate for HRP, Promega) oder durch Chemilumineszenz auf einem Film (Hyperfilm ECL, Amersham) sichtbar gemacht werden.
2.2.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA-Methode
Bei der Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem BCA Protein Assay (Pierce) wird die Proteinkonzentration einer Lösung durch Vergleich mit bekannten Standardverdünnungen von BSA (Bovine Serum Albumin) bestimmt. Die Proben werden mit einer Mischung aus Reagenz A und B (Pierce) vermischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Eine Farbreaktion findet statt, wenn das Cu2+-Reagenz mit der Peptidbindung und Cu+ mit Bicinchoninat reagiert. Die Lösungen werden bei 630 nm auf ihre optische Dichte getestet und so die Proteinkonzentration ermittelt.
Dieser Test hat eine Sensitivität von 20-2000 µg/ml.
2.2.2.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Da das Glutathion aus dem Elutionspuffer mit der Proteinmessung im BCA-Assay interferieren kann, ist es notwendig, auf ein anderes Quantifizierungssystem auszuweichen. Hier eignet sich die Proteinbestimmung nach Bradford.
Bei dieser kolorimetrischen Methode wird der Farbstoff Coomassie-Brilliantblau G250 verwendet, der an aromatische und basische Aminosäurereste bindet. Die Standardkurve wird mit linear ansteigenden Konzentrationen von BSA erstellt.
2 Materialien und Methoden 33
5 Minuten nach Zugabe des Farbstoffes wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen und die Proteinkonzentration der Probe berechnet. Die Detektionsgrenze dieses Tests liegt bei 1µg Protein /ml.
2.2.2.5 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Proteinbandenvergleich mit Quantity One (Firma Bio-Rad)
Nach der Dialyse lag die Proteinkonzentration der aufgereinigten Proteinprobe unterhalb des Detektionsbereichs der o.g. Bestimmungsmethoden. Um die Konzentration des Proteins abschätzen zu können, wurde ein SDS-Page Gel der Proteinprobe angefertigt, mit Coomassie-Blau angefärbt und im Anschluss entfärbt.
Parallel wurden Proben mit definierter BSA-Konzentration aufgetragen. In dem verwendeten Computerprogramm wird die Bandenstärke der gesuchten Probe mit der Bandenstärke der bekannten Proteinkonzentration an BSA verglichen und anschließend kann so rechnerisch die Konzentration des aufgereinigten Proteins ermittelt werden.
2.2.2.6 Proteinfärbung mit Coomassie-Blau
Mit dieser Färbetechnik werden Proteine quantitativ nachgewiesen. Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blau bindet unspezifisch an die meisten Proteine. Dadurch bleiben nach Anfärbung und anschließender Entfärbung der Gelmatrix die Proteine im Gel als blaue Banden sichtbar. Die Detektionsgrenze der Coomassie-Blau-Färbung liegt bei 50-100 ng Protein pro Bande.
Die Anfärbung erfolgt in 60 Minuten mit einer Lösung, die aus 40% Ethanol, 10%
Essigsäure, 50% Wasser und 0,05% Coomassie Brilliant Blau besteht. Anschließend wird für 60 Minuten mit einer Lösung aus 40% Ethanol, 10% Essigsäure und 50%
Wasser entfärbt.
Das Gel wird zwischen Zellophanpapier getrocknet.
2.2.2.7 Proteinfärbung mit Silberfärbung
Die Silberfärbung ist eine weitere sehr sensitive Möglichkeit, Proteine nachzuweisen.
Hier bindet sich Silbernitrat unspezifisch an die Proteine und lässt so die Banden sichtbar werden.
Die Detektionsgrenze liegt bei dieser Methodik bei 1-10 ng Protein pro Bande.
Zur Färbung wird das Roti-Black P Kit (Roth) verwendet und nach Herstelleranleitung vorgegangen.
2.2.2.8 Lösung und Rückfaltung der Proteine
Für die nachfolgenden Experimente ist es unabdingbar, dass die Proteine aktiv sind.
Allerdings liegen überexprimierte Proteine in vielen Fällen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter „Inclusion Bodies“, vor, weil sich das Bakterium vor dem Protein durch dessen Abkapselung schützt. So müssen die Proteine mit denaturierenden Reagenzien extrahiert werden. Deshalb muss nach der Extraktion eine Rückfaltung des Proteins in seine native Form durchgeführt werden. Ein etabliertes Rückfaltungsverfahren ist die „Pulsrenaturierung“ nach Rudolph (RUDOLPH et al.
1996). Hier wird das Bakterienpellet erst in PBS, 10µg/ml Lysozym, gelöst. Diese Lösung wird dreimal für 60 Sekunden mit Ultraschall behandelt und in einem anschließenden Zentrifugationsschritt werden bei 40000g für 40 Minuten die löslichen Bestandteile von den unlöslichen getrennt. Die unlöslichen Anteile befinden sich im Pellet, der Überstand wird verworfen.
Das Pellet wird in 6 M Guanidinhydrochlorid (GdmCl), 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0 (4ml/g Pellet) mit Hilfe eines Ultraturrax Homogenisators für 1 min bei Stufe 8 resuspendiert. Die Lösung wird anschließend bei Raumtemperatur für mindestens zwei Stunden gerührt und dann bei 40000g für 40 Minuten zentrifugiert. Die Proteine befinden sich nun im Überstand.
Dieser wird gegen ein hundertfaches Volumen von 6 M GdmCl, 50 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 3,0 bei 4°C dialysiert. Das ist notwendig, um das bei der Renaturierung unerwünschte DTT des Solubilisierungspuffers zu entfernen. Der niedrige pH-Wert
2 Materialien und Methoden 35
bewirkt die Protonierung der Sulfhydrylgruppen, so wird eine Oxidation der Cysteinseitenketten und die Bildung von Disulfidbrücken verhindert.
Nachfolgend wird die Proteinkonzentration der Einschlusskörper bestimmt.
Die eigentliche Proteinrenaturierung wird bei 4°C mit der Methode der
„Pulsrenaturierung“ durchgeführt. Dazu wird zu einem Rückfaltungspuffer (1 M Arginin, 50 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA, 1 mM oxidiertes Glutathion, 10 mM reduziertes Glutathion) in Abständen von einer Stunde jeweils eine Proteinkonzentration von 0,1 mg/ml Puffer hinzugefügt. Das ermöglicht die Einstellung eines Gleichgewichts und verringert eine Aggregation noch nicht vollständig zurückgefalteter Proteine.
Nach Zufügen des letzten Pulses wird die Lösung für weitere 12-14 Stunden bei 4°C gehalten und im Anschluss zweimal gegen 50 Volumen 50 mM Tris, pH 8,0, 300mM NaCl, 10% Glycerin, 10 mM Imidazol dialysiert.
Die Proteinkonzentration wird mit der BCA-Proteinbestimmung gemessen und mittels eines Western Blots die Anwesenheit einer bekannten Menge Kontrollprotein quantifiziert.
2.2.2.9 Aufreinigung der Proteine
Die gelösten Proteine werden chromatographisch bei 4°C aufgereinigt. Zur Aufreinigung des Gαq wird die ÄKTA design Pumpe von Amersham Pharmacia Biotech verwendet und nach Anleitung des Herstellers vorgegangen.
2.2.3 Affinitätschromatographie
Das Prinzip der Affinitätschromatographie beruht auf der reversiblen Bindung von Proteinen an einen spezifischen Liganden, der an eine Matrix gekoppelt ist. Durch diese selektive Bindung kann das Zielprotein aus einer Lösung, die verschiedene Proteine enthält, isoliert und konzentriert werden.
Die Interaktion zwischen Ligand und Zielmolekül resultiert aus elektrostatischen oder hydrophoben Wechselwirkungen, van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken. Zur
Elution des Zielproteins können diese Bindungen durch einen kompetetiven Liganden, die Änderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentrationen oder der Polarität gebrochen werden.
So genannte Tags ermöglichen die schnelle Aufreinigung der Proteine in einem Schritt mittels Affinitätschromatographie. Hierzu werden mit der Hilfe von speziellen Destinationsvektoren gezielt Aminosäureketten an das exprimierte Protein angehängt.
RGS3 wird an einen GST-Tag gekoppelt. So wird das kleine RGS-Protein (~19 kDa) mit einem großen Tag (~28 kDa) kombiniert. GST (Glutathion S-Transferase) ist der am zweithäufigsten verwendete Tag. Es ist zudem bekannt, dass ein GST-Tag die Ausbeute und Löslichkeit des Proteins erhöhen kann. Die Aufreinigung erfolgt über Glutathion Sepharose.
Ursprünglich war geplant, Gαq an einen His-Tag zu koppeln, da jedoch die Nickelbrücke eventuell mit einigen der zu testenden Wirkstoffen in Wechselwirkung treten könnte, fiel die Entscheidung für Gαq auf einen Biotin-Tag.
2.2.3.1 Aufreinigung des Gαq
Biotinylierte Proteine binden an Streptavidin, allerdings ist die Bindung zwischen diesen Substanzen sehr stark. Die Dissoziationskonstante (Kd) des Avidin-Biotin-Komplexes beträgt pro Untereinheit 0,6x10-15 M, die des Streptavidin-Biotin-Komplexes 4x10-14 M. Diese Komplexe sind sehr stabil gegenüber denaturierenden Reagenzien, Detergentien, Proteolyse und einem breiten pH-Wert. Somit können die gebundenen biotinylierten Proteine nur unter äußerst stringenten Bedingungen, die das Zielprotein im Allgemeinen inaktivieren, eluiert werden. Um diese Problematik zu umgehen, verwendet man monomeres Avidin statt der tetrameren Form des Streptavidins. Durch die Dissoziation des Avidintetramers zum Avidinmonomer kommt es zu einer Konformationsänderung in der Untereinheit und die Kd für Biotin steigt auf 10-7M, die hohe Bindungspezifität für Biotin bleibt dabei erhalten. So wird eine Elution des gebundenen biotinylierten Proteins unter milden Konditionen ermöglicht.
Allerdings weisen auch diese Formen Nachteile auf, denn monomeres Avidin tendiert dazu, sich zu hochaffinen Tetrameren zusammenzuschließen (GREEN et al. 1973).
2 Materialien und Methoden 37
Vor Verwendung der monomeren Avidinsäule (Soft Link Soft Release Avidin Resin, Promega) wird diese mit 0,1 M NaPO4 equilibriert und nichtreversible Bindungsstellen mit 2 Säulenvolumen 5 mM Biotin in NaPO4-Lösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde abgesättigt. Nach einer Wartezeit von 15 Minuten wird die Säule regeneriert, indem sie zuerst mit 8 Säulenvolumen 10%iger Essigsäure und dann mit 8 Säulenvolumen 100mM NaPO4 (pH 7,0) gewaschen wird.
Der Durchlauf soll einen pH von mindestens 6,8 haben. Nun folgt eine Wartezeit von 30 Minuten, in der sich das Avidin rückfalten kann. Abschließend wird die Säule mit 5 Säulenvolumen 50 mM Tris, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 10 mM Imidazol equilibriert.
Nun kann die Probe mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde auf die Säule gegeben werden. Hierbei bindet das biotinylierte Protein an die Matrix.
Schließlich kann das biotinylierte Protein mit 5 mM Biotin-Lösung von der Säule verdrängt werden. Das Eluat wird mittels BCA-Proteinbestimmung auf seinen Proteingehalt getestet und im Western Blot die Anwesenheit von Gαq geprüft.
2.2.3.2 Aufreinigung des RGS3
Die Aufreinigung des an einen GST-Tag gekoppelten RGS3 erfolgt mit Glutathion Sepharose 4B (Amersham). Die Beads (200 µl pro Liter E. coli – Kultur) werden zweimal mit jeweils 1 ml PBS gewaschen und bei 14000 rpm bei 4°C abzentrifugiert.
Dann werden sie zu der mittels Pulsrenaturierung rückgefaltetem Proteinlösung gegeben und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. In dieser Zeit bindet das GST-RGS3 an die Sepharosebeads. Im Anschluss werden die Beads bei 400 rpm bei 4°C sedimentiert und wiederum zweimal mit je 1 ml PBS und zweimal mit je 1 ml Salzpuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl) gewaschen. Die Elution des gebundenen Proteins erfolgt durch zehnminütige Inkubation mit dem Elutionspuffer (10 mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Die Elution wird insgesamt dreimal durchgeführt und im Anschluss die Eluatsfraktionen im Bradford-Proteinassay auf ihren Proteingehalt überprüft.
Zusätzlich wird mittels eines Western Blots auch noch die Identität der aufgereinigten Proteine kontrolliert.