3.1 Klonierung der DNA
3.1.3 Umklonierung in Destinationsvektoren
Die exprimierten Proteine RGS3 und Gαq sollten jeweils mit einem GST- bzw. Biotin-Tag versehen werden. Zu diesem Zweck wurden die Insertionsfragmente von RGS3 und Gαq in der LR-Reaktion (siehe Methoden 2.2.1.6) in den entsprechenden Destinationsvektor, pDest 15 bzw. pET 104, ligiert. Auch hier wurden die aufgereinigten Plasmide wieder zur Kontrolle mit Restriktionsenzymen geschnitten und die Fragmente in einem Agarosegel nach Größe getrennt (Abb. 13).
3 Ergebnisse 45
M 1 2 3 4 M
Vektorfragment pDEST 15
Vektorfragment pET 104 4424 bp
5123 bp
Abb. 13: Kontrollverdau der rekombinanten Destinationsvektoren
Der Vektor pDEST15-RGS3 wurde mit den Restriktionsenzymen Sfu I und Cel II (Spur 1 und 2, unabhängige Klone) und der Vektor pET104-Gαq mit Sph I und Cel II (Spur 3 und 4, unabhängige Klone) geschnitten. Zu sehen sind die erwarteten Fragmentlängen von 4424 und 885 bp (Spur 1 und 2) sowie 5123 und 1788 bp (Spur 3 und 4). Seitlich wurde die 1000 bp-Leiter als Marker aufgetragen.
3.2 Proteinexpression
Die transfizierten E. coli–Bakterien wurden, wie unter 2.2.2.1 beschrieben, herangezüchtet und lysiert. Im folgenden Schritt wurde nun mittels Western Blots verifiziert, dass die gewünschten Proteine von den Bakterienzellen exprimiert werden und den entsprechenden Tag besitzen. Auf Basis der Sequenz der Proteine konnte das Molekulargewicht abgeschätzt werden. Allerdings konnten posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise Phosphorylierung und Glykosylierung, die in E. coli nicht stattfinden, nicht berücksichtigt werden. So hat die klonierte RGS3 Isoform 4 ein Molekulargewicht von 19,35 kDa und der fusionierte GST-Tag ein Molekulargewicht von 27.7 kDa, das Produkt also ein Gesamtgewicht von 47 kDa (Abb. 14, 2A und 2B).
Der Biotin-Tag hat ein Molekulargewicht von 11 kDa, Gαq ein Molekulargewicht von 42,1 kDa, das Gesamtprotein hat demzufolge ein Gewicht von 53 kDa (Abb. 14, 1A und 1B).
RGS3 885 bp
1500 bp Gαq 2000 bp
1788 bp
1A 2A
RGS3 47 kDa Gαq 53 kDA
1B 2B
Abb. 14: Kontrolle der Proteinexpression und Verifizierung des Proteintags
In diesem Western Blot liegt die Bande des biotinylierten Gαq bei 53 kDa. Das Protein wurde mit einem Anti-Gαq-Antikörper detektiert (Abb. 1B) und zur Kontrolle der Biotinylierung außerdem mit einem Antikörper gegen Biotin (Abb.1A) detektiert.
RGS3-GST wurde ebenfalls in einem Western Blot detektiert. Die Bande liegt bei 47 kDa, auch hier wurde das Protein mit Anti-RGS3 (Abb. 2A) und zusätzlich mit Anti-GST (Abb. 2B) geprüft.
Um die Proteinausbeute zu optimieren, wurde in einem Zeitverlauf stündlich eine Probe der mit IPTG induzierten und nicht induzierten Kulturen genommen, lysiert und in einem Western Blot die Proteinausbeute quantifiziert (Abb. 15).
A.
B.
Abb. 15: Zeitverlauf der Proteinexpression
Diese Western Blots von Lysaten mit Destinationsvektoren transfizierter E. coli mit RGS3 (A.) und Gαq (B.) zeigen eine Zunahme der Expression bei längerer Inkubationszeit der Bakterienkulturen. Die Proben wurden im Abstand von einer Stunde genommen (1, 2, 3, 4, 5, 6 Stunden). Der Unterschied zwischen mit IPTG induzierten (i) und nicht induzierten Kulturen ist sehr gering.
Nach fünf Stunden wurde eine hohe Konzentration an exprimiertem Protein erreicht.
RGS3 47 kDa Gαq 53 kDA
0 1 1i 2 2i 3 3i 4 4i 5 5i Zeit in h
i = induzierte Probe
RGS3 (~47kDa)
0 1 1i 2 2i 3 3i 4 4i 5 5i 6 6i Zeit in h
i
= induzierte Probe
Gαq (~53 kDa)
3 Ergebnisse 47
Nach Schwierigkeiten mit der Proteinausbeute von RGS3 wurden auf einer LB-Agarplatte verschiedene Kolonien herangezüchtet und die unterschiedlichen Klone in Folge amplifiziert, lysiert und auf ihren RGS3-Proteingehalt geprüft (Abb. 16). Es war ersichtlich, dass Kolonie Nr. 5 für die weiteren Versuche geeignet ist und als Stammkolonie verwendet werden kann.
1 1i 2 2i 3i 4 4i 5 5i 6 6i 7i 8 8i
RGS3 (47 kDa)
Abb. 16: RGS3-Koloniewahl
In diesen Western Blots wurden Lysate verschiedener, mit pDest 15-RGS3 tranzifizierter E. coli - Kolonien (Nummern 1-8, i = induzierte Proben) aufgetragen. Unter Berücksichtigung des Proteingehalts (4 µg/Spur) konnte so gefolgert werden, dass Kolonie Nr. 5 als Stammkolonie für die weiteren Experimente zur RGS3-Expression geeignet ist, während z.B. Kolonie Nr. 1 kaum RGS3 exprimiert und deshalb nicht verwendet werden sollte.
Die exprimierten Proteine waren nach der Lyse zu unterschiedlichen Anteilen in Pellet und Überstand enthalten. Auch hier wurden zur Überprüfung der Löslichkeit Western Blots durchgeführt.
Abb. 17: Überprüfung der Löslichkeit von Gαq und RGS3
Der Western Blot des mit Tris-Puffer (pH 8,0) gelösten und mit Ultraschall behandelten E. coli-Pellets zeigt, dass RGS3 (Abb. A) und Gαq (Abb. B) unter den gewählten Bedingungen nicht in Lösung geht..
Die Proteine verblieben im sedimentierten Pellet (Spur 1), das in SDS-Puffer gelöst und auf das Gel aufgetragen wurde, nur ein kleiner Teil konnte gelöst werden und war im Überstand (Spur 2). In diesen Abbildungen ist die RGS3-Bande bei 47 kDa und die Gαq-Bande bei 53 kDa zu sehen.
Sowohl RGS3 (Abb. 17A) als auch Gαq (Abb. 17B) erwiesen sich als lipophil und so verblieb der Großteil der exprimierten Proteine nach der Lyse im Pellet. Um sie zu lösen und gleichzeitig die Aktivität zu erhalten, wurden sie im Verfahren der
„Pulsrenaturierung“ zuerst gelöst und anschließend zurückgefaltet.
Nach dieser Prozedur konnten die gelösten Proteine im Dialysat detektiert werden (Abb.18).
A. B.
[kDa]
66
Gαq 53 kDa Gαq 53 kDa
RGS3 47 kDa 45
30
Abb. 18: Gαq und RGS3-Detektion nach Rückfaltungsprotokoll
Nach der Rückfaltung werden die Proteine erneut in einem Western Blot detektiert. So findet sich auch hier RGS3 bei 47 kDa (A) und Gαq bei 53 kDa (B).
3 Ergebnisse 49
Um die Spezifität im AlphaScreen-Assay zu erhöhen, wurde RGS3 anschließend über den GST-Tag mit Glutathion-Sepharose aufgereinigt (Abb. 19).
A
M 1 2 3 4 5
220
97
66
45 RGS3 47 kDa
30
20
B
1 2 3 4 5
RGS3-GST 47 kDa
C
1 2 3 4 5
RGS3-GST 47 kDa
Abb. 19: RGS3-GST-Aufreinigung
Diese Abbildungen zeigen die Konzentration an RGS3 vor und nach der Aufreinigung. Auf jede Spur wurden 4 µg Protein aufgetragen. Die mit Anti-RGS3 detektierte Bande befindet sich bei etwa 47 kDa (Abb. B). Auch die Detektion mit einem GST-Tag spezifischen Antikörper war erfolgreich (Abb. C).
In Spur 1 wurde das Dialysat nach der Rückfaltung aufgetragen, hier sind nur geringe Konzentrationen des Proteins zu detektieren. Nach der Inkubation mit den Glutathion-Sepharose Beads ist das Protein fast vollständig an diese gebunden, das Signal im Überstand (Spur 2) also noch geringer. Nach der Elution war das Protein dann in den Eluatsfraktionen zu finden (Spuren 3 bis 5). Die Coomassie-Blau-Färbung (Abb A.) zeigt, dass das aufgereinigte Protein etwa eine Reinheit von 80% hat. Hier wurde 1 µg Protein pro Spur aufgetragen.
Die Aufreinigung von Gαq mittels Streptavidin war nicht möglich (Abb. 20). Zwar konnte eine erfolgreiche Bindung an die Matrix nachgewiesen werden (Abb. 20B, Spur 1), aber die Elution unter nicht denaturierenden Bedingungen war nicht möglich (Abb.20A, Spur 1-6).
A
1 2 3 4 5 6 D K
Gαq 53 kDa
B
[kDa]
1 2
Abb. 20: Aufreinigung von Gαq-Biotin-Fusionsprotein
Die Elution des gebundenen Proteins war nicht erfolgreich (Abb. A). In keiner der Eluatsfraktionen (Spur 1 bis 6) wurde Gαq detektiert. Auch im Durchlauf (Spur D) war kein Gαq mehr vorhanden. In Spur K wurde als Positivkontrolle das Gαq enthaltende E. coli-Dialysat aufgetragen, welches nicht über die Streptavidinsäule gegeben wurde.
Im Western Blot (Abb. B) wurde das mit SDS aufgekochte Säulenmaterial (Spur 1) neben einer Gαq-Positivkontrolle, die vom Hernn Prof. Benzing, Freiburg, gestellt wurde (Spur 2), aufgetragen. Deutlich ist zu erkennen, dass das Protein nach der Inkubation mit dem Elutionspuffer auf der Säule verblieb.
3.3 AlphaScreen-Assay
Die isolierten Proteine werden nun im AlphaScreen-Assay eingesetzt. Hierbei handelt es sich um eine preisgünstige Testplattform, die es ermöglicht, die Inhibitorsuche im Hochdurchsatzscreenig durchzuführen.
66 97
Gαq 53 kDa 45
30
3 Ergebnisse 51