2.2 Methoden
2.2.1 Klonierung
2.2.1.2 Polymerasenkettenreaktion (PCR)
In der PCR werden die Gαq und RGS3 (Isoform 4) Genabschnitte aus single stranded cDNA amplifiziert. Die für die Amplifizierung des Gαq verwendete cDNA stammt aus der Tumorzelllinie U373, die mit Noradrenalin stimuliert wurde. Die für die Amplifizierung des RGS3 verwendete cDNA wurde aus humanen Astrozyten isoliert.
Die semiquantitative PCR wird mit dem Techne Genius durchgeführt.
Material: AccuPrimePFX Proofreading DNA Polymerase (Invitrogen, 2,5 U/µl) 10x Reaktionspuffer (Boehringer)
RGS3: ss cDNA aus humanen Astrozyten
Gαq: ss cDNA aus Noradrenalin-stimulierten U373-Zellen Primer: 1,5 µl (10µM in dH2O) (MWG Biotech AG, München)
Für den Reaktionsansatz werden 5 µl 10x Puffer mit 1,5 µl Forward-Primer (Sequenz) und 1,5 µl Reverse-Primer, 0,4 µl Taq Polymerase (1U) und 15,6 µl dH2O in ein 0,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert, das Gemisch wird kurz zentrifugiert und dann in die Techne PCR-Maschine überführt und amplifiziert. Zuerst wird bei 95°C in 60 sec die ss cDNA denaturiert. Im Anschluss wird in 40 Zyklen die DNA zuerst bei 97°C für 15 sec denaturiert, dann folgt für 30 sec bei 55°C die Anlagerung der Primer an das Template und in den folgenden 40 sec wird bei 72°C der Basenstrang verlängert. Zum Schluss folgt eine zehnminütige Phase bei 72°C, in der die Kettenextension beendet wird.
Die Sequenz der amplifizierten Fragmente ist in Abb. 6 dargestellt.
A. 1 agggggtgcc ggcggggctg cagcggaggc actttggaag aatgactctg gagtccatca 61 tggcgtgctg cctgagcgag gaggccaagg aagcccggcg gatcaacgac gagatcgagc 121 ggcagctccg cagggacaag cgggacgccc gccgggagct caagctgctg ctgctcggga 181 caggagagag tggcaagagt acgtttatca agcagatgag aatcatccat gggtcaggat 241 actctgatga agataaaagg ggcttcacca agctggtgta tcagaacatc ttcacggcca 301 tgcaggccat gatcagagcc atggacacac tcaagatccc atacaagtat gagcacaata 361 aggctcatgc acaattagtt cgagaagttg atgtggagaa ggtgtctgct tttgagaatc 421 catatgtaga tgcaataaag agtttatgga atgatcctgg aatccaggaa tgctatgata 481 gacgacgaga atatcaatta tctgactcta ccaaatacta tcttaatgac ttggaccgcg 541 tagctgaccc tgcctacctg cctacgcaac aagatgtgct tagagttcga gtccccacca 601 cagggatcat cgaatacccc tttgacttac aaagtgtcat tttcagaatg gtcgatgtag 661 ggggccaaag gtcagagaga agaaaatgga tacactgctt tgaaaatgtc acctctatca 721 tgtttctagt agcgcttagt gaatatgatc aagttctcgt ggagtcagac aatgagaacc 781 gaatggagga aagcaaggct ctctttagaa caattatcac atacccctgg ttccagaact 841 cctcggttat tctgttctta aacaagaaag atcttctaga ggagaaaatc atgtattccc 901 atctagtcga ctacttccca gaatatgatg gaccccagag agatgcccag gcagcccgag 961 aattcattct gaagatgttc gtggacctga acccagacag tgacaaaatt atctactccc 1021 acttcacgtg cgccacagac accgagaata tccgctttgt ctttgctgcc gtcaaggaca 1081 ccatcctcca gttgaacctg aaggagtaca atctggtcta attgtgcctc ctagacaccc 1141 gccctgccct tccctggtgg gctattgaag atacacaaga gggactgtat ttctgtggaa 1201 aacaatttgc ataatactaa tttattgccg tcctggactc tgtgtgagcg tgtccacaga 1261 gtttgtagta aatattatga ttttatttaa actattcaga ggaaaaacag aggatgctga 1321 agtacagtcc cagcacattt cctctctatc ttttttttag gcaaaacctt gtgactcagt 1381 gtattttaaa ttctcagtca tgcactcaca aagataagac ttgtttcttt ctgtctctct 1441 ctctttttct tttctatgga gcaaaacaaa gctgatttcc cttttttctt cccccgctaa 1501 ttcatacctc cctcctgatg tttttcccag gttacaatgg cctttatcct agttccattc
B. 1 ggatggacgc ctctcccccg gagcagcact ttggggccag cttgggccct ggggatgagc 61 cacaggggac ccacagccta tgcgtgtgag catgtaaccc gggagccagc tgggcccctc 121 gcggggtggg cagaaggacg ggctggccca ggaccctctt ctttgagaca tcccggactc 181 catctcggat gaaagtgctt tgagaaacca cagagttttc tgtttaatgg aagaaagaaa 241 tccagcctct ctccagagtg gcggtggccg gctagacagg agccaaggac atgaagaaca 301 agctggggat cttcagacgg cggaatgagt cccctggagc ccctcccgcg ggcaaggcag 361 acaaaatgat gaagtcattc aagcccacct cagaggaagc cctcaagtgg ggcgagtcct 421 tggagaagct gctggttcac aaatacgggt tagcagtgtt ccaagccttc cttcgcactg 481 agttcagtga ggagaatctg gagttctggt tggcttgtga ggacttcaag aaggtcaagt 541 cacagtccaa gatggcatcc aaggccaaga agatctttgc tgaatacatc gcgatccagg 601 catgcaagga ggtcaacctg gactcctaca cgcgggagca caccaaggac aacctgcaga 661 gcgtcacgcg gggctgcttc gacctggcac agaagcgcat cttcgggctc atggaaaagg 721 actcgtaccc tcgctttctc cgttctgacc tctacctgga ccttattaac cagaagaaga 781 tgagtccccc gctttagggg ccactggagt cgagctcagc gttcacacca ggcgggctgg 841 gtcccctgcc cacctgcctc cctgccccct gtgacggagg gggcaagcaa gcccccagag 901 gctgtgtctc tggacagacg gatagacata cggaagcgag gcctggacca agagaggccc 961 aggctactgg aggagtagaa ggatgggccc cgtggggtcc ccactgcccc ggtacgaggg 1021 ggcccaagac cctggcaggt caggggccct ggccaagcca gatctggagc tgctgctccc 1081 tgctgcggag accgcggagg cttcgcgttg accaagttcc ttaaagaact ggctgatggg 1141 gcaggaggtc caggcctggg ctctcgggcc ctcctagagg gccattggag cttgcagctc 1201 agacccccac tttgagtttt atttatttaa atagtagttg gatgcttggc acgtcgtcct 1261 gtaataggaa acccttgcct catcagtttt cctgatttac aagtgcaata ttttagccaa 1321 tgccttggga gaagctgcca tgcaaaggtg gacaccattc tccagcttca ggggatatgc 1381 tcgtcccggg caccggtggc aggcagctgg ccttctggac taaggcagcc tggggggaca 1441 ctgcagtctg gctacacaca gagatctggc accccctggg tggagtgtcc ctcgggggct 1501 ttgggaaagc atggcaccct cagaccacac agtagccaag ttctggagca aataaaaggc 1561 ctgtgttatt tcttgttctt ga
Abb. 6: DNA-Sequenz der klonierten Proteine
A. Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide (GNAQ), mRNA Gi: 40254461
B. Homo sapiens regulator of G-protein signalling 3 (RGS3), transcript variant 4, mRNA Gi: 19913391
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Markiert sind die Proteinsequenzen, die Primerangriffsstellen sind fettgedruckt.
2 Materialien und Methoden 23 2.2.1.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die amplifizierten Gensequenzen werden in einer Agarose-Gelelektrophorese getrennt, identifiziert und anschließend aufgereinigt.
10 µl der PCR-Produkte werden auf ein 1%-iges horizontales Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt wird, aufgetragen. Als Gel- und Laufpuffer wird 1x TBE verwendet. Als Größenstandard wird die 100 Base-Pair Leiter aufgetragen.
Die Gele werden im UV-Licht mit dem BioDoc Analyze bei 254 nm betrachtet, fotografiert und digital gespeichert.
Die nun auf dem Gel aufgetragenen Proben werden nach Beendigung der Elektrophorese mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) wieder extrahiert.
2.2.1.4 Topoisomerase-Reaktion
Um eine besonders effektive Klonierung zu erreichen, wird das „Gateway-System“ von Invitrogen verwendet, welches statt einer Ligase zur Rekombination eine Topoisomerase einsetzt.
DNA-Topoisomerasen sind in allen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen zu finden.
Sie sind bei Reaktionen beteiligt, in denen die räumliche Struktur der DNA verändert wird. Eine Topoisomerase-Reaktion hat mehrere Schritte:
Zuerst bindet das Enzym an die DNA, so wird eine Phosphatbrücke zwischen einer Tyrosin-Seitenkette des Enzyms und der hierbei gespalteten Phosphordiesterkette der DNA gebildet. Durch diese Bindung bildet sich eine Lücke in der DNA, hier kann nun der DNA-Strang gedreht oder ein intakter DNA-Strang eingebracht werden.
Zum Schluss löst sich die Enzym-DNA-Bindung und die Phosphordiesterkette der DNA bildet sich zurück.
Für diese Reaktion wird keine externe Energie benötigt, weil die Energie auch in der Tyrosin-Phosphat-Brücke erhalten bleibt.
Man unterscheidet zwei Gruppen von DNA-Topoisomerasen: Typ-I-DNA-Topoisomerasen spalten nur einen der beiden DNA-Stränge, durch
Typ-II-DNA-Topoisomerasen werden beide Stränge gespalten und ein intakter Doppelstrang in die Lücke eingeführt.
Bei den durchgeführten Vektorreaktionen handelt es sich demzufolge um Typ-II-DNA-Topoisomerasen, denn es werden die klonierten Gene in den Vektor eingebracht.
Dabei ist zu beachten, dass die PCR-Produkte „blunt end“ repliziert werden müssen, dazu muß in der PCR eine Proofreading Taq-Polymerase verwendet werden, hier die Taq Proofreading Polymerase AccuPrime PFX der Firma Invitrogen.
In der Topoisomerasereaktion werden Vektor und PCR-Produkt in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. 1 µl TOPO-Vektor (2580 bp) hat ein Gewicht von etwa 17,5 ng, dazu werden die in 4 µl dH2O gelösten PCR-Produkte pipettiert.
Das PCR-Produkt von RGS3 hat eine Länge von 506 bp, also müssen entsprechend 3,4 ng in 4 µl dH2O gelöst sein, bei Gαq mit einer Länge von 1079 bp 7,3 ng in 4 µl dH2O.
Reaktionsansatz: 4 µl dH20, darin gelöst PCR-Produkt 1 µl Salt Solution
1 µl TOPO – Vektor
Zur Transformation der kompetenten E. coli werden 2 µl des Reaktionsproduktes zu den Zellen gegeben und nach Herstelleranleitung fortgefahren.
Im Anschluss werden die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten, die mit 50 µg Kanamycin/ml versetzt werden, ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die gewachsenen Kolonien werden in je 2 ml LB-Medium (50 µg Kanamycin/ml) überführt und 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm inkubiert.
2.2.1.5 Plasmidaufreinigung
Je 1,5 ml der Kulturen werden mit Hilfe des Qiagen Plasmid Mini Kits nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Die Eluate werden photometrisch auf ihre Reinheit überprüft.
Um die Größe der eluierten cDNA zu überprüfen, müssen die Plasmide geschnitten werden. Dazu verwendet man Restriktionsenzyme, die den Vektor 5’ und 3’ des Inserts schneiden.
2 Materialien und Methoden 25
Dabei ist zu beachten, dass das verwendete Restriktionsenzym den Vektor nur einmal schneiden sollte und außerdem nicht in das Insert schneidet. Das kann mit dem „NEB Cutter“ unter http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php geprüft werden.
Hier wurden Eco RV, das bei 818 bp, und Not I, das bei der Vektorposition 673 bp schneidet, gewählt.
So ist das ausgeschnittene Insert schließlich um 144 bp der Vektor-DNA länger als die eigentlich eingefügte Sequenz, also 1223 bp bei Gαq und 653 bp bei RGS3.
Die Plasmide werden für eine Stunde bei 37°C mit den Restriktionsenzymen inkubiert.
Um sicherzustellen, dass ein großer Teil der Plasmide geschnitten wird, wird das Enzym in hoher Konzentration eingesetzt.
Reaktionsansatz: 50 µl DNA (~10ng/µl)
6 µl 10x Puffer (Roche) 2 µl Not I in Verdünnung 2 µl Eco RV in Verdünnung
1 µl Not I bzw. 1 µl Eco RV enthält 10 U, 1 µl reagiert also mit 10 µg DNA pro Stunde.
Anschließend werden die Eluate komplett auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt.
Die E. coli - Kolonien mit den erwarteten Resultaten werden in 50 ml LB-Medium (50 µg Kanamycin/ml) überimpft und für 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm bebrütet.
Die Kulturen werden mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Das Eluat wird photometrisch auf seine Reinheit überprüft und auf ein Agarosegel aufgetragen, um zu verifizieren, dass es sich um die erwarteten Produkte handelt.
Zur Absicherung des Ergebnisses wird die rekombinante DNA zusätzlich durch Herrn Dr. Igloi, Institut für Biologie III der Albert-Ludwig-Universtät Freiburg, sequenziert.
2.2.1.6 LR-Reaktion zwischen Entryvektor und Destinationsvektor
In der LR-Reaktion werden die zu klonierenden Sequenzen aus dem Entryvektor in den Destinationsvektor geschleust. LR ist die firmeneigene Abkürzung für „Left-Right“, es werden nur die einander entsprechenden „Attachment Sites“ der Entry- bzw.
Destinationsvektoren miteinander verknüpft.
Durch die Verwendung zweier Vektoren im Rahmen des „Gateway-Systems“ ist es möglich, auszuwählen, in welchem Zellsystem man das Zielprotein exprimieren möchte. So gibt es beispielsweise Vektoren für E. coli, Hefe, humane Zellen oder auch für Insektenzellen. Weiterhin ermöglicht der Destinationsvektor den Einbau einer zusätzlichen Sequenz, eines so genannten „Tags“, an das Protein. Dadurch wird nachfolgend die Aufreinigung des Proteins erleichtert und weitere Verwendungszwecke ermöglicht (Abb. 7).
Abb. 7: Gateway-Klonierungssystem Quelle: Invitrogen
2 Materialien und Methoden 27
Das RGS3-Molekül wird in den pDEST 15 – Vektor (Invitrogen) eingefügt, hier wird dem Molekül ein N-terminaler GST-Tag angehängt, der später für die Konzeptionierung des Alpha-Screen-Assays notwendig ist, aber auch für die Aufreinigung von Vorteil ist.
Gαq wird in den pET104 BioEase (Invitrogen) eingebracht und erhält so einen N-terminalen Biotin-Tag, der für die spätere Verwendung im Alpha-Screen-Assay benötigt wird, aber auch zur Aufreinigung dient.
Für die Reaktion werden 1 µl des Destinationsvektors mit 100 ng des Entryvektors versetzt und mit TE Puffer, pH 8, auf 8 µl aufgefüllt.
Dazu werden 2 µl LR ClonaseII Enzyme Mix pipettiert und die Lösung für eine Stunde bei 25°C inkubiert. Im Anschluß wird 1 µl Proteinase K hinzugefügt und das Gemisch für 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Für die Transformation der kompetenten E.coli-Zellen wird 1 µl des Reaktionsgemisches in 1 Tube OneShot-E.coli (Invitrogen) überführt. Die Tubes werden für 30 Minuten auf Eis gelagert und dann für 30 Sekunden bei 42°C einem Hitzeschock ausgesetzt. Nun werden 250 µl SOC-Medium (2 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glukose) zu den Bakterienzellen gegeben und die Kulturen für eine Stunde bei 37°C und 300 rpm inkubiert.
Im Anschluss wird das Nährmedium in Volumina von 10 µl, 100 µl und 130 µl auf LB-Agarplatten (50 µg Carbacillin/ml) ausgestrichen und bei 37°C für 18 Stunden inkubiert.
Die einzeln gewachsenen Kulturen werden in je 2 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) überführt und bei 37°C und 225 rpm für 14 Stunden inkubiert.
LB-Medium: 0,1 % (w/v) NaCl
Nach dem Autoklavieren wird dem Medium ein Antibiotikum zugesetzt.
Je 1,5 ml der Bakterienkulturen werden mit Hilfe des Qiagen Plasmid Mini Kits nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Die Eluate werden photometrisch auf ihre Reinheit überprüft. Um die Größe der klonierten Sequenz zu kontrollieren, werden die Plasmide mit Restriktionsenzymen (Roche) versetzt.
Für den Verdau des pDEST15 (5309 bp nach LR-Reaktion) werden Sfu I und Cel II verwendet. Das Insert hat eine Länge von 546 bp und wird zwischen bp 792 und bp 2496 eingefügt. Sfu I schneidet den Vektor bei bp 503, Cel II bei bp 2546, der geschnittene Vektor hat also Teilstücke von 885 bp und 4424 bp Länge.
Der Vektor pET104 (6911 bp nach LR-Reaktion) wird mit den Restriktionsenzymen Sph I, das bei bp 1 schneidet, und Cel II, das bei 2352 bp schneidet, versetzt. Das Insert selbst hat eine Länge von 1119 bp und liegt zwischen den bp 597 und 2280. Die Fragmente haben also eine Länge von 1788 bp und 5123 bp.
Für den Verdau werden je 10 U des Restriktionsenzyms mit 10xPuffer und 500 ng DNA versetzt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Danach werden die Proben auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Als Marker wird die peqGOLD High Range DNA-Leiter verwendet.
Von den positiv geprüften Proben werden Kulturen mit 50 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) angesetzt, diese werden für 14 Stunden bei 37°C und 225 rpm inkubiert.
Die Kulturen werden mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Das Eluat wird photometrisch auf seine Reinheit geprüft. Auch diese Proben werden zur Überprüfung mit den Restriktionsenzymen versetzt und anschließend elektrophoretisch getrennt.
2 Materialien und Methoden 29
2.2.2 Proteinaufbereitung
In weiteren Schritten werden nun die exprimierten Proteine (Abb. 8) auf ihre Identität getestet und quantifiziert. In Folge werden die Proteine aufgereinigt.
A. 1 mtlesimacc lseeakearr indeierqlr rdkrdarrel kllllgtges gkstfikqmr 61 iihgsgysde dkrgftklvy qniftamqam iramdtlkip ykyehnkaha qlvrevdvek 121 vsafenpyvd aikslwndpg iqecydrrre yqlsdstkyy lndldrvadp aylptqqdvl 181 rvrvpttgii eypfdlqsvi frmvdvggqr serrkwihcf envtsimflv alseydqvlv 241 esdnenrmee skalfrtiit ypwfqnssvi lflnkkdlle ekimyshlvd yfpeydgpqr 301 daqaarefil kmfvdlnpds dkiiyshftc atdtenirfv faavkdtilq lnlkeynlv
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Abb. 8: Sequenz der klonierten Proteine
A. guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide [Homo sapiens]
Gi: 40254462
B. regulator of G-protein signalling 3 isoform 4 [Homo sapiens]
Gi: 19913392
Quelle: National Center of Biotechnology Information (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2.1 Proteinexpression
Für die Proteinexpression (Proteinsequenzen siehe Abb. 8, allerdings ohne Tags) werden BL21Star-Zellen, einem speziellen Stamm zur Proteinexpression (Invitrogen), auf Eis aufgetaut und mit der in Wasser gelösten DNA gemischt. 4 ng der Gαq-DNA werden in 2 µl dH2O gelöst, ebenso 4,5 ng der RGS3-DNA. Die Zellen werden für 30 Minuten auf Eis gelagert, dann folgt für 30 Sekunden ein Hitzeschock bei 42°C mit anschließender Lagerung auf Eis. Nun werden 250 µl SOC-Medium hinzugefügt und für eine Stunde bei 37°C und 225 rpm inkubiert. Schließlich werden 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) hinzugefügt und bei 37°C und 225 rpm für 12 Stunden inkubiert.
500 µl der Kulturlösung werden in 10 ml LB-Medium (50 µg Carbacillin/ml) überführt und bei 37°C und 225 rpm inkubiert, bis die photometrisch gemessene OD600 0,5-0,8 beträgt.
Nun wird die 10 ml Kultur in zwei Kulturen à 5 ml geteilt, eine dieser Kulturen wird mit 25 µl 200 mM IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM IPTG gebracht. Das ist notwendig, weil das zur Rekombination gewünschte Gen sich auf einem Plasmid befindet, womit die Bakterien transformiert werden. Zur Aktivierung und Translation dieses Gens in ein Protein muß ein Operon aktiv sein. IPTG wird verwendet, um das Lactose-Operon zu aktivieren. Da Gαq biotinyliert wird, wird den E.coli–Bakterien zusätzlich Biotin in einer 2 µM Endkonzentration zur Verfügung gestellt. Zum Startzeitpunkt und danach stündlich für 6 Stunden wird von jeder Kultur eine 500 µl Probe genommen, das Medium abzentrifugiert und das Bakterienpellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -20°C gelagert.
2.2.2.2 SDS-Gelelektrophorese und Westernblot (Immunoblot)
Bei dieser Methode werden Proteine elektrophoretisch getrennt und dauerhaft auf einer Membran fixiert. Die nach Gewicht getrennten Proteine können so durch spezifische Antikörperreaktionen nachgewiesen und zudem die Größe und relative Menge der Proteine bestimmt werden.
Die Bakterienpellets werden in 96 µl dH2O und 24 µl 5x Loading Buffer gelöst, 5 Minuten bei 95°C gekocht, um die Proteine zu denaturieren, und dann auf ein 12%-iges
2 Materialien und Methoden 31
SDS-Polyacrylamidgel (SDS-Page-Gel) aufgetragen. SDS (Sodiumdodecylsulfat) löst die Proteine und gibt ihnen eine negative Ladung, sodass die elektrophoretische Auftrennung nur aufgrund der Proteingröße erfolgt. Als Größenreferenz wird der High Range Rainbow Molecular Weight Marker verwendet.
Zuerst wandern die Proteine bei einer Spannung von 40 Volt 10 Minuten im Sammelgel in Richtung Anode, danach erfolgt die Auftrennung im Trenngel bei 80 Volt für 50 Minuten.
Im Anschluss erfolgt der elektrophoretische Transfer der Proteine auf eine proteinbindende Membran. Durch Anlegen eines Stroms von 65 mA werden die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylfluoridmembran (Immobilon-Membran, Millipore) übertragen und dort hydrophob gebunden.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran werden nun durch eine einstündige Inkubation mit Roti-Block (Roth) abgesättigt.
Die überschüssige Roti-Block-Lösung wird für 15 Minuten mit TBST (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% Tween-20) abgewaschen, danach wird die Membran für zwei Stunden mit dem primären Antikörper inkubiert.
In drei weiteren fünfzehnminütigen Waschschritten mit TBST wird Antikörper, der nicht an Antigen gebunden hat, entfernt. Nun wird die Membran für eine Stunde mit dem sekundären Antikörper (Anti-Rabbit IgG, HRP-konjugiert, Qiagen) inkubiert.
Dieser Antikörper bindet an den Fc-Teil des primären Antikörpers und ist zur Detektion an das Enzym Horseradishperoxydase gekoppelt.
Anschließend erfolgen wieder drei fünfzehnminütige Waschschritte mit TBST, um den überschüssigen Sekundärantikörper zu entfernen.
Für die Detektion erfolgt eine einminütige Inkubation der Membran mit der Visualisierungslösung, um eine Chemilumineszenzreaktion, die auf Röntgenfilm sichtbar ist, hervorzurufen. Der Röntgenfilm wird in einer Dunkelkammer entwickelt und anschließend ausgewertet.
Bei der Auswahl der spezifischen (primären) Antikörper werden zwei Aspekte berücksichtigt:
Zum einen wird das Protein mit einem spezifischen Antikörper detektiert, zum anderen wird ein Antikörper eingesetzt, der gegen den Tag gerichtet ist.
Für die Detektion von Gαq werden somit zwei unterschiedliche Systeme verwendet.
Ein Antikörper (Anti-Gαq, Kaninchen, Gramsch) ist gegen das Protein selber gerichtet,
im anderen System bindet der Antikörper (Strep-AP-Konjugat, Invitrogen) an den Biotin-Tag des klonierten Proteins. Dieser Biotinantikörper kann statt mit einer Chemilumineszenzreaktion auch mit einer Farbreaktion (Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphate) detektiert werden.
RGS3 wird ebenfalls mit einem proteinspezifischen Antikörper (RGS3 AS 1-300, Santa Cruz) und auch mit einem GST-Tag-spezifischen Antikörper (Anti-GST-Tag, Mouse, Santa Cruz) detektiert. Dieser kann mit einer Farbreaktion (TMP Stabilized Substrate for HRP, Promega) oder durch Chemilumineszenz auf einem Film (Hyperfilm ECL, Amersham) sichtbar gemacht werden.
2.2.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA-Methode
Bei der Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem BCA Protein Assay (Pierce) wird die Proteinkonzentration einer Lösung durch Vergleich mit bekannten Standardverdünnungen von BSA (Bovine Serum Albumin) bestimmt. Die Proben werden mit einer Mischung aus Reagenz A und B (Pierce) vermischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Eine Farbreaktion findet statt, wenn das Cu2+-Reagenz mit der Peptidbindung und Cu+ mit Bicinchoninat reagiert. Die Lösungen werden bei 630 nm auf ihre optische Dichte getestet und so die Proteinkonzentration ermittelt.
Dieser Test hat eine Sensitivität von 20-2000 µg/ml.
2.2.2.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Da das Glutathion aus dem Elutionspuffer mit der Proteinmessung im BCA-Assay interferieren kann, ist es notwendig, auf ein anderes Quantifizierungssystem auszuweichen. Hier eignet sich die Proteinbestimmung nach Bradford.
Bei dieser kolorimetrischen Methode wird der Farbstoff Coomassie-Brilliantblau G250 verwendet, der an aromatische und basische Aminosäurereste bindet. Die Standardkurve wird mit linear ansteigenden Konzentrationen von BSA erstellt.
2 Materialien und Methoden 33
5 Minuten nach Zugabe des Farbstoffes wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen und die Proteinkonzentration der Probe berechnet. Die Detektionsgrenze dieses Tests liegt bei 1µg Protein /ml.
2.2.2.5 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Proteinbandenvergleich mit Quantity One (Firma Bio-Rad)
Nach der Dialyse lag die Proteinkonzentration der aufgereinigten Proteinprobe unterhalb des Detektionsbereichs der o.g. Bestimmungsmethoden. Um die Konzentration des Proteins abschätzen zu können, wurde ein SDS-Page Gel der Proteinprobe angefertigt, mit Coomassie-Blau angefärbt und im Anschluss entfärbt.
Parallel wurden Proben mit definierter BSA-Konzentration aufgetragen. In dem verwendeten Computerprogramm wird die Bandenstärke der gesuchten Probe mit der Bandenstärke der bekannten Proteinkonzentration an BSA verglichen und anschließend kann so rechnerisch die Konzentration des aufgereinigten Proteins ermittelt werden.
2.2.2.6 Proteinfärbung mit Coomassie-Blau
Mit dieser Färbetechnik werden Proteine quantitativ nachgewiesen. Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blau bindet unspezifisch an die meisten Proteine. Dadurch bleiben nach Anfärbung und anschließender Entfärbung der Gelmatrix die Proteine im Gel als blaue Banden sichtbar. Die Detektionsgrenze der Coomassie-Blau-Färbung liegt bei 50-100 ng Protein pro Bande.
Die Anfärbung erfolgt in 60 Minuten mit einer Lösung, die aus 40% Ethanol, 10%
Essigsäure, 50% Wasser und 0,05% Coomassie Brilliant Blau besteht. Anschließend wird für 60 Minuten mit einer Lösung aus 40% Ethanol, 10% Essigsäure und 50%
Wasser entfärbt.
Das Gel wird zwischen Zellophanpapier getrocknet.
2.2.2.7 Proteinfärbung mit Silberfärbung
Die Silberfärbung ist eine weitere sehr sensitive Möglichkeit, Proteine nachzuweisen.
Hier bindet sich Silbernitrat unspezifisch an die Proteine und lässt so die Banden sichtbar werden.
Die Detektionsgrenze liegt bei dieser Methodik bei 1-10 ng Protein pro Bande.
Zur Färbung wird das Roti-Black P Kit (Roth) verwendet und nach Herstelleranleitung vorgegangen.
2.2.2.8 Lösung und Rückfaltung der Proteine
Für die nachfolgenden Experimente ist es unabdingbar, dass die Proteine aktiv sind.
Für die nachfolgenden Experimente ist es unabdingbar, dass die Proteine aktiv sind.