AlphaScreen-Assay

Der AlphaScreen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) ist ein nichtradioaktiver Bioassay, der auf der Basis so genannter Beads funktioniert und mit dem sich biomolekulare Interaktionen im Mikroplattenformat untersuchen lassen (Abb.

9).

Ursprünglich wurde der AlphaScreen unter dem Namen LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) von Dade Behring, Inc. in Deutschland entwickelt, PerkinElmer Life and Analytical Sciences hat den Assay 1999 für den pharmazeutischen Markt etabliert.

Die AlphaScreen Beads sind Kügelchen von neutraler Dichte und einem Durchmesser von etwa 200 nm. Sie sind mit einem Dextranhydrogel überzogen, das unspezifische Bindungen und Aggregation minimiert. In jedem Testsystem sind zwei verschiedene Beads enthalten. Diese Beads sind mit reaktiven Aldehydgruppen ausgestattet, so können sie Proteine, Peptide oder Aminosäuren binden. Donor Beads sind gewöhnlich mit Streptavidin überzogen, Akzeptorbeads sind an Antikörper, Protein A oder Metallchelate gebunden. Die Donorbeads enthalten einen Photosensibilisator, Phthalocyanin, der, wenn er mit Licht der Wellenlänge 680 nm angeregt wird, umgebenden Sauerstoff in eine angeregte Form eines O2, ein Singlet-Sauerstoff, wandelt (Abb. 9). Die Acceptorbeads enthalten Thioxenderivate, die mit Singlet-Sauerstoff reagieren und Licht der Wellenlängen 520-620 nm emittieren. In den für gewöhnlich verwendeten Puffern hat Singlet- Sauerstoff eine Halbwertszeit von 4 µsec und kann sich in freier Lösung etwa 200 µm vom Donorbead entfernen. Ist nun ein Akzeptorbead in Reichweite, wird die Energie des Singlet- Sauerstoff durch eine chemische Reaktion auf das Akzeptorbead übertragen und durch nachfolgenden Zerfall Licht (Chemilumineszenz) emittiert. Sollte kein Acceptorbead erreicht werden, zerfällt das Singlet- Sauerstoff ohne Lichtsignal (Abb. 9B).

Dieser auf Distanz der Reaktionspartner basierende Energietransfer ist die Grundlage für die Messung der Interaktion zweier Biomoleküle.

Zwei Reaktionspartner werden an Donor- und Akzeptorbead gekoppelt. Das Bindungsverhalten dieser zwei Moleküle kann nun anhand der Größe des Lichtsignals interpretiert werden (Abb. 9C).

2 Materialien und Methoden 39

In der AlphaScreen Technologie ist zusätzlich ein Amplifizierungsschritt vorhanden, da jedes Donorbead nach Anregung bis zu 60000 Singlet- Sauerstoffmoleküle pro Sekunde erzeugt. So wird die Sensitivität erhöht und die benötigten Reaktionsvolumina können niedrig gehalten werden (VON LEOPRECHTING et al. 2006).

A. B.

C.

GST-tagged RGS3

biotinylier es t G-alpha-q

Abb. 9: Prinzip des AlphaScreen Assays

Bei Anregung der Donorbeads mit einem Laser der Wellenlänge 680 nm wird ein Singlet-Oxygen freigesetzt. Dieses Molekül hat eine Halbwertzeit von 4 µsec und kann sich etwa 200 µm vom Donorbead entfernen. Trifft es auf ein Akzeptorbead, wird Licht der Wellenlänge 520-620 nm emittiert (A). Ist kein Akzeptorbead in Reichweite, zerfällt das Singlet-Oxygen, ohne ein Signal zu emittieren (B). Im hier entwickelten Assay (C) bindet Gαq über Biotin an das Streptavidin-überzogene Akzeptorbead, RGS3 über den GST-Tag an den mit einem Anti-GST versehenen Donorbead. Durch die Bindung zwischen RGS3 und Gαq ist die Distanz zwischen Donor- und Acceptorbead geringer als die maximale Reichweite des Singlet-Oxygen, somit wird nach Anregung ein Signal erzeugt, das mit dem EnVision Reader gemessen werden kann.

Quelle: modifiziert nach PerkinElmer - A practical guide to working with AlphaScreen

Es wurde mit Anti-GST-Akzeptorbeads und mit Streptavidin-Donorbeads gearbeitet.

Die Anti-GST-Akzeptorbeads binden das mit einem GST-Tag ausgestattete RGS3, während die Streptavidin-Donorbeads das an Biotin gekoppelte Gαq binden (Abb. 9C).

Die Versuche wurden mit einem Gesamtvolumen von 60 µl pro Reaktion in einer 394-Well-Platte (OptiPlate-384, PerkinElmer) durchgeführt und mit dem PerkinElmer EnVision Reader mit dem Emissionsfilter 570 und dem Mirror D640as abgelesen.

Alle Versuche mit dem AlphaScreen Assay wurden mit Triplikaten zweifach durchgeführt.

In den ersten Versuchen wurde das optimale Verhältnis zwischen der verwendeten Menge an RGS3 und Gαq ermittelt.

Die verwendeten 60 µl setzten sich in Folge aus 15 µl Pufferlösung mit je 750 ng Beads, 40 µl Proteinlösung mit 320 µg RGS3 und 170 µg Gαq und 10 µl DMSO, das auch zur Lösung der zu testenden Inhibitoren eingesetzt wurde, zusammen. Zusätzlich wurden 40 µM GTP-γ-S hinzugefügt, um die RGS3-Gαq-Proteinbindung zu stabilisieren. In weiteren Versuchen wurde ausgeschlossen, dass reines DMSO einen Einfluss auf die Bindungsqualität und das Signal-Rausch-Verhältnis hat.

RGS3-Protein und der in DMSO gelöste Inhibitor wurden vermischt und bei Raumtemperatur für 20 Minuten vorinkubiert. Nun wurden Gαq, GTP-γ-S und die Donor- und Akzeptorbeads hinzugefügt und bei Raumtemperatur für weitere 2 Stunden auf einem Schüttler inkubiert. Als Negativkontrolle wurden Donor- und Akzeptorbeads mit PBS und DMSO auf das Assaygesamtvolumen von 60 µl aufgefüllt. Für die Positivkontrolle wurde nur DMSO ohne Inhibitor verwendet; die Bindung zwischen den beiden Proteinen wird dadurch nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde die testeigene Assaykontrolle verwendet. Hierbei wurden die Donor- und Akzeptorbeads mit PBS und DMSO und zusätzlich 41,6 nM biotinyliertem GST auf das Gesamtvolumen von 60 µl gebracht. Biotinyliertes GST bindet sowohl an Anti-GST-Akzeptorbeads als auch an Streptavidin-Donorbeads und erzeugt ein starkes Signal.

Der von Jin, Neubig et. al publizierte RGS4-Inhibitor (JIN et al. 2004) wurde in DMSO in Konzentrationen von 10 µM bis 1 pM gelöst und mit RGS3 20 Minuten vorinkubiert.

Dann wurden die weiteren Assaykomponenten hinzugegeben, die Mikroplatte für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit dem PerkinElmer EnVision Reader abgelesen.

Die Substanzen, die als mögliche Inhibitoren getestet werden, sind aus einem virtuellen Screening hervorgegangen. Mittels des GOLD docking program (Version 2.2) -Computerprogramms (Cambridge Christallographic Data Center) wurde geprüft, ob die verschiedenen Molekularstrukturen der in Datenbanken verfügbaren Substanzen möglicherweise einen Kontakt zu der Bindungsstelle des RGS3 herstellen könnten. Es

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ist nur die Kristallstruktur von RGS4 bekannt, deshalb wurde diese als Grundlage für das Screening verwendet. Das virtuelle Screening wurde durch Herrn Prof. W. Sippl, Institut für Pharmazeutische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, durchgeführt.

Abb. 10: Strukturformeln der potentiellen Inhibitoren, „Hits“ des virtuellen Screenings

Diese Abbildung zeigt die Strukturformeln der Substanzen, die beim virtuellen Screening als mögliche Inhibitoren angezeigt wurden. Es ist keine gemeinsame chemische Leitstruktur zu erkennen.

Die in diesem Verfahren als potentielle Hemmstoffe erkannten Stoffe wurden in Folge in DMSO gelöst und in Konzentrationen von 10 µM-1 pM im Assay eingesetzt.

3 Ergebnisse

In der Pathogenese verschiedener Krankheitsbilder wie Parkinson, Epilepsie oder Depression wird eine Fehlregulation in der Signaltransduktionskaskade diskutiert. So soll die Überexpression bestimmter Kontrollproteine des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, z.B. Mitglieder der RGS-Familie, ursächlich in der Genese dieser Erkrankungen beteiligt sein. Eine pharmakologische Inhibition von RGS-Molekülen sollte eine Verstärkung des Target-G-Protein-Rezeptorsignals bedeuten.

Um zu untersuchen, ob die Bindung von RGS3 an Gαq spezifisch gestört werden kann, wurde ein Testsystem zum Screening potentieller Inhibitoren entwickelt.

Dazu wurden die Gensequenzen der beteiligten Proteine aus cDNA amplifiziert, in Vektoren mit einem zusätzlichen Tag exprimiert, aufgereinigt und in den AlphaScreen Assay integriert.

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