Etablierung

In einem ersten Versuch wurde nur biotinyliertes GST zu den Reaktionsbeads hinzugegeben und so nur die Bindungskapazität des Assays überprüft (Abb. 21A).

In einem weiteren Schritt wurde jeweils nur eines der Proteine eingesetzt und das, als Positivkontrolle funktionierende Molekül, biotinyliertes GST, kompetitiv vom jeweiligen Reaktionspartner des Fusionsproteines verdrängt (Abb. 21 B und 21 C).

A.

AlphaScreen Assay: Positivkontrolle (Biotin-GST)

0 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000

1,00E-12 1,00E-11 1,00E-10 1,00E-09 1,00E-08 1,00E-07 Biotin-GST [M]

AlphaScreen [cps]

B.

bGST mit RGS3-Kompetition

0 20 40 60 80 100 120

0 50 100 150

RGS3 [ng]

[cps%]

C.

bGST mit Gαq-Kompetition

0 20 40 60 80 100 120 140

-20 30 80 130 180

Gαq [ng]

[cps%]

Abb. 21: Kompetitive Verdrängung des biotinylierten GST durch die rekombinanten Proteine Die Funktion des Assays wurde mit der firmeneigenen Positivkontrolle überprüft. Biotinyliertes GST band an Donor- und Acceptorbeads, dadurch wurde ein hohes Signal erzeugt (Abb. A). Durch die Zugabe eines an ein Reaktionsbead bindendes Protein, wie RGS3-GST (Abb. B) und Gαq-Biotin (Abb. C), wurde das biotinylierte GST kompetitiv vom entsprechenden Bindungspartner verdrängt. So nimmt das Bindungssignal der Reaktionsbeads mit steigender Proteinmenge ab.

3 Ergebnisse 53

Aufgrund der nicht erfolgten Aufreinigung des Gαq war es nötig zu überprüfen, in welchem Maße die noch im Dialysat enthaltenen Restproteine das Ergebnis beeinflussen. Hierzu wurde zu den Reaktionsbeads biotinyliertes GST gegeben und zusätzlich E. coli–Lysat titriert.

Es zeigte sich, dass auch große Mengen an Fremdprotein von bis zu 150 µg auf ein Reaktionsvolumen von 25 µl keine Abnahme des Bindungssignals zur Folge haben (Abb. 22).

Unspezifische Interferenz von E.coli Protein

0 20 40 60 80 100 120

1 10 100 1000 10000 100000

E. coli Protein [µg]

Fluoreszenz der Kontrolle [%]

Abb. 22: Unspezifische Interferenz des E.coli-Lysats mit dem AlphaScreen-Assay

Durch die Zugabe von Fremdprotein in Form eines E. coli-Lysat wurde die Bindung der Reaktionsbeads über biotinyliertes GST nur geringfügig gestört. Erst ab einer Menge von mehr als 150 µg Protein in 25 µl Reaktionsvolumen wurde das Signal gemindert.

Nun wurden verschiedene Mengen an RGS3- und Gαq–Dialysat in den Assay titriert.

Anhand der Signalverstärkung gegenüber der Negativprobe, die nur Reaktionsbeads, aber keine Proteine enthält, konnte so das optimale Verhältnis von RGS3 zu Gαq eruiert werden (Abb. 23).

Deutlich wurde dabei, dass ein Verhältnis von 170 ng (53 nmol) Gαq zu 320 ng (113 nmol) RGS3 die meisten counts per second erzeugt. In einem Gesamtreaktionsvolumen von 60 µl wurden je 7,5 µg Donor- und Akzeptorbeads verwendet. So wurde das Signal

des Grundrauschens, das durch ein zufälliges Aufeinandertreffen der Beads erzeugt wird und ein immer messbares Signal ist, bis zu 10-fach erhöht.

RGS3/GαqVerhältnis, 170 ng Gαq

Abb. 23: Experimentelle Bestimmung des optimalen Verhältnisses zwischen RGS3 und Gαq Durch Versuche mit verschiedenen Mengen an Bindungsproteinen wurde das Verhältnis zwischen RGS3 und Gαq ermittelt, bei dem ein möglichst hohes Signal-/Rausch-Verhältnis gemessen wird.

So wurde bei einem Verhältnis von 320 ng RGS3 zu 170 ng Gαq das Signal im Vergleich zum Rauschen, dem immer meßbaren Grundsignal, das durch ein zufälliges Aufeinandertreffen von Donor- und Akzeptorbead entsteht, bis zu 10-fach erhöht.

Durch Zugabe von 40 mM GTP-γ-S konnte das Signal-/Rausch-Verhältnis weiter verbessert werden. Es wurde eine Erhöhung um das 2,5-fache festgestellt (Abb. 24).

Einfluss von GTP-γ-S im RGS3/Gαq-AlphaScreen Assay

0

Abb. 24: Einfluss von GTP-γ-S im RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assay

Durch die Zugabe von 40 mM GTP-γ-S wurde das Bindungssignal um das 2,5-fache erhöht. Um die Funktion des Assays zu überprüfen, wurde als Assaykontrolle die Bindungsfähigkeit der Reaktionsbeads mit biotinyliertem GST, das sowohl an Donor- als auch an Akzeptorbead bindet, überprüft. Rauschen wurde in Abb. 23 definiert.

Zur Kontrolle der Spezifität des Testsystems wurde eine Verdrängung des mittels Biotin-Tag an das Akzeptorbead gekoppelten Gαq durch eine nicht an das Bead

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bindende Gαq/Gαi-Chimäre (AG Aktories) durchgeführt. Dieses Gαq/i-Molekül besitzt einen His-Tag und bindet demzufolge weder an Donor- noch an Akzeptorbead (Abb. 9).

Allerdings geht das Protein eine Bindung mit RGS3 ein und kompetetiert das an den Donor Bead gebundene RGS3 und verringert so die Anzahl der Bindungen. In den Versuchen wurden ~600 ng der Gαq/Gαi-Chimäre zur Kompetition der 170 ng Gαq-Biotin eingesetzt und eine Signalverminderung auf bis zu 44% erreicht (Abb. 25).

Test der Spezifität des RGS3/Gαq-AlphaScreen Assays mit Gnaq/Gnai-Kompetitionsprotein

0 5000 10000 15000 20000 25000

Signal AlphaScreen [cps]

Positivkontrolle Gaq/Gai Rauschen Assaykontrolle

Abb. 25: Kompetition durch Gαq/Gαi

In diesem Diagramm wurden die Signalstärken nach Zugabe von 10 µl reinem PBS und Zugabe von ~600 ng Gαq/Gαi gelöst in 10 µl PBS aufgetragen. Durch die Bindung des Gαq/Gαi an RGS3 wurde die Anzahl der Bindungen zwischen RGS3 und Gαq-Biotin verringert und somit auch die Stärke des Bindungssignals abgesenkt. Im ersten Versuch gelang eine Minderung des Signals auf 44% des Positivkontrollwertes, in der Wiederholung eine Senkung auf 63%. „Positivkontrolle“, „Rauschen“ und

„Assaykontrolle“ wurden in Abb. 23 und 24 definiert.

Die zu testenden Substanzen wurde in DMSO gelöst. Um zu kontrollieren, dass DMSO die Funktion des Assays nicht beeinträchtigt, wurde 10 µl DMSO zu Negativ (Donor- und Akzeptorbeads mit PBS)-, Positiv (Donor- und Akzeptorbeads mit Bindungsproteinen RGS3-GST und Gαq-Biotin) - und Assaykontrolle (Donor- und Akzeptorbeads mit biotinyliertem GST) auf ein Gesamtvolumen von 60 µl gegeben. Es zeigte sich, dass die gemessenen Signale höher waren als bei einer Messung ohne das Lösungsmittel DMSO, jedoch wurde das Signal-/Rausch-Verhältnis nicht beeinflusst.

Einfluß von DMSO auf das Bindungssignal

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000

Signal AlphaScreen [cps] RGS3 + Gaq

RGS3 + Gaq + DMSO Rauschen

Rauschen + DMSO Assaykontrolle + DMSO Assaykontrolle

Abb. 26: Einfluß des Inhibitor-Lösungsmittels DMSO auf das Bindungssignal des RGS3/Gαq-AlphaScreen-Assays

Durch die Zugabe von 10 µl DMSO auf ein Gesamtvolumen von 60 µl wurde das Bindungssignal um etwa 30% erhöht, jedoch hatte diese Erhöhung keine signifikante Veränderung des Signal/Rausch-Verhältnisses zur Folge. Auch das Signal des Rauschens (Definition siehe Abb. 23) wurde durch Zugabe von DMSO nicht signifikant erhöht. Die Assaykontrolle wurde in Abb. 24 definiert.

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