Der bis dato einzig bekannter RGS-Inhibitor (JIN et al. 2004) wurde in dem hier etablierten System getestet. Da es sich bei der Forschung an RGS-Proteinen um ein neues Gebiet handelt, gibt es bisher nur relativ wenige Erkenntnisse. So wurde das Bindungsverhalten von RGS4 und Gαi untersucht und ein Inhibitor dieser Bindung gefunden. Diese Substanz ist als RGS4-Inhibitor mit einer hohen Spezifität veröffentlicht worden. Da noch kein Inhibitor der Bindung zwischen RGS3 und Gαq publiziert wurde, habe ich den einzig bekannten RGS4-Inhibitor getestet.
Bei der Untersuchung des RGS4-Inhibitors konnte keine spezifische Signalverminderung festgestellt werden (Abb. 27). Ein Homologievergleich der Sequenzen von RGS3 und RGS4 bzw. Gαq und Gαi zeigte Unterschiede in der Molekülstruktur. So ist die Aminosäure 180 der Switch-Region der Gαi-Untereinheit Prolin, bei Gαq ist dort Lysin. Aminosäure 185 ist bei Gαi ein Valin und bei Gαq ein Isoleucin. Da diese Aminosäuren ein wichtiger Bestandteil der Gαi/RGS4-Bindung sind und als Grundlage für das Inhibitordesign dient (JIN et al. 2004), ist dieser Unterschied essentiell (Abb. 30A).
Analog dazu weist die Proteinsequenz des RGS3 an der Bindungstelle zu Gαq ein Phenylalanin statt des Tyrosins bei RGS4 auf (Abb. 30B). So ist die Bindung zwischen RGS3 und Gαq nicht identisch mit der Bindung zwischen RGS4 und Gαi. Durch die nachgewiesene hohe Spezifität des Inhibitors ist eine Interaktion zwischen Inhibitor und RGS3 nicht möglich. Somit wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Substanz nicht geeignet ist, die Verminderung des Rezeptorsignals durch RGS3 zu verhindern.
4 Diskussion 67
A.)
GNAI1 1 MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAG 60 M C LS E K A + I+R LR D A RE+KLLLLG GESGKST +KQM+IIH +G GNAQ 7 MACCLSEEAKEARRINDEIERQLRRDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGSG 66 GNAI1 61 YSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFG---DSARADDARQLFVLAGAAEEG 117 YS+E+ + + +VY N ++ A+IRAM LKI + + A A R++ V +A E GNAQ 67 YSDEDKRGFTKLVYQNIFTAMQAMIRAMDTLKIPYKYEHNKAHAQLVREVDVEKVSAFEN 126 GNAI1 118 FMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRT 177 IK LW D G+Q C++R REYQL+DS YYLNDLDR+A P Y+PTQQDVLR GNAQ 127 ----PYVDAIKSLWNDPGIQECYDRRREYQLSDSTKYYLNDLDRVADPAYLPTQQDVLRV 182 GNAI1 178 RVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVAAIIFCVALSDYDLVLAED 237 RV TTGI+E F + + F+M DVGGQRSER+KWIHCFE V +I+F VALS+YD VL E GNAQ 183 RVPTTGIIEYPFDLQSVIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIMFLVALSEYDQVLVES 242 GNAI1 238 EEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYQEYAGSNTYE 297 + NRM ES LF +I WF ++S+ILFLNKKDL EEKI S L + EY G GNAQ 243 DNENRMEESKALFRTIITYPWFQNSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDA 302 GNAI1 298 EAA-AYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGL 353 +AA +I F DLN D K IY+HFTCATDT+N++FVF AV D I++ NLK+ L GNAQ 303 QAAREFILKMFVDLNPDSD-KIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNL 358
B.)
RGS3 1 MKNKLGIFRRRNESPGAPPA-GKADKMMKSFKPTSEEALKWGESLEKLLVHKYGLAVFQA 59 MK++LG ++++S + K DK++ + + EE KW ESLE L+ H+ GLA F+A RGS4 19 MKHRLGFLLQKSDSCEHNSSHNKKDKVVICQRVSQEEVKKWAESLENLISHECGLAAFKA 78 RGS3 60 FLRTEFSEENLEFWLACEDFXXXXXXXXXXXXXXXIFAEYIAIQACKEVNLDSYTREHTK 119 FL++E+SEEN++FW++CE++KK+KS SK++ KAKKI+ E+I++QA KEVNLDS TRE T RGS4 79 FLKSEYSEENIDFWISCEEYKKIKSPSKLSPKAKKIYNEFISVQATKEVNLDSCTREETS 138 RGS3 120 DNLQSVTRGCFDLAQKRIFGLMEKDSYPRFLRSDLYLDLIN 160
N+ T CFD AQK+IF LMEKDSY RFL+S YLDL+N RGS4 139 RNMLEPTITCFDEAQKKIFNLMEKDSYRRFLKSRFYLDLVN 179
Galphaq-Galphai Unterschiede in grün
Lys-Pro
RGS3-RGS4 Unterschiede in magenta
rot: backbone vom RGS, blau: backbone vom G-alpha, magenta: AS die im RGS3 anders sind als im RGS4, grün: AS die im G-alpha q anders sind als im G-alpha i1 Abb. 30: Vergleich der Sequenzen von Gαq und Gαi1 (A) und RGS3 und RGS4 (B und C)
A.) Homologievergleich der Proteinsequenzen von Gα i1 (GNA1, Genebank (gi) 20072863) mit Gαq (GNAQ, gi 40254462) mit dem Programm Blast2. Unterstrichen ist die Switch 1- Region von Gαi1, welche 3/4 der RGS4 Bindungstasche füllt. Fettdruck markiert zwei Aminosäurereste, die essentiell für eine feste GNAI1/RGS4 Bindung sind.
B.) Homologievergleich der RGS3 (gi 19913392) und RGS4 (gi-Proteinsequenz. 5032039) Proteinsequenz. Unterstrichene Aminosäuren bilden die Bindungstasche für das G alpha Protein (JIN et al. 2004)
C.) Strukturvergleich von RGS3 und RGS4
In dieser Graphik sind die Strukturen von RGS3 und RGS4, bzw. Gαq und Gαi1 abgebildet. Das Grundgerüst von RGS ist rot markiert, die Aminosäuren, die im RGS3-Protein anders sind als im RGS4-Protein magenta. Dementsprechend ist auch das Grundgerüst von Gα in blau dargestellt, die Aminosäuren, die im Gαq-Protein anders sind als im Gαi1-Protein grün.
Die Substanzen, die im virtuellen Screening ausgewählt wurden, erwiesen sich nicht als Inhibitoren der RGS3/Gαq-Bindung.
Substanz 1 (HTS 07963) zeigt in einem ersten Versuch zwar eine Erniedrigung des Signals, die jedoch nicht reproduzierbar ist (Abb.28). Bei einer Erhöhung der Inhibitorkonzentration im Folgeversuch wird eine Signalverstärkung gemessen, was auf unspezifische Beeinflussung des Bindungsverhältnisses schließen lässt. Ferner wird bei einer sehr geringen Konzentration des Inhibitors keine Verminderung des Signals
4 Diskussion 69
gemessen. Das wäre allerdings zu erwarten, denn bei geringen Konzentrationen könnten nicht alle Bindungen beeinträchtigt werden und somit müsste das Bindungssignal wieder ansteigen und das Ausgangsniveau erreichen.
Da dies nicht der Fall ist, kann gefolgert werden, dass Substanz 1 (HTS 07963) keine spezifische Veränderung des Bindungssignals bewirkt.
Der Einsatz der Substanzen 2 (SCR 01461), 3 (HTS 05503) und 4 (ChemBridge 6372993) bewirkt ebenfalls keine spezifische Veränderung des Bindungssignals (Abb.
29).
Da bei ihrer Auswahl die Röntgenstrukturanalysen von Gαi und RGS4 als Grundlage herangezogen werden mussten, da keine Röntgenstrukturanalysen für die Wechselwirkung von RGS3/Gαq vorliegen, überrascht das nicht. Denn, wie besprochen, weist die Switch-Region der Gα-Untereinheiten Unterschiede auf. So wird für weitere Untersuchungen die Röntgenstrukturanalyse von Gαq herangezogen und als Basis für die Suche nach neuen Inhibitoren verwendet.
Darüberhinaus liefert dieser in-vitro-Assay leider keinen Hinweis auf Zellgängigkeit oder Toxizität der getesteten Substanzen, von daher sollte in einem nächsten Schritt ein Zellassay zur Verifizierung der Ergebnisse durchgeführt werden. Hier bietet sich ein funktioneller Assay mit Kontrolle der IP3-Aktivität, die im direkten Zusammenhang mit dem Rezeptorsignal steht, an. Durch eine Verlängerung des Rezeptorsignals durch die inhibierte Hydrolysebeschleunigung durch RGS3 sollte zu einem Anstieg der IP3-Konzentration führen. Erste Versuche auf diesem Gebiet werden momentan durchgeführt.
5 Zusammenfassung
Eva-Christina Schliewert
Regulatoren der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion (RGS) als Zielgruppe für neue Medikamente – Entwicklung eines Testsystems zur Suche nach RGS3-Inhibitoren RGS-Proteine verkürzen die Dauer der Rezeptoraktivität von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Beschleunigung der Hydrolyse von GTP zu GDP. Eine Überexpression von RGS-Proteinen kann somit zu Krankheitsbildern wie Parkinson, Herzversagen oder Epilepsie führen. Demzufolge wird nach Wirkstoffen, die die RGS-Proteine in ihrer Funktion inhibieren, gesucht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei an der Signaltransduktion maßgeblich beteiligte Proteine, RGS3 und Gαq, kloniert und in eine Testplattform, den AlphaScreen-Assay, eingefügt. Der Assay wurde etabliert.
Es wurde ein publizierter RGS4-Inhibitor getestet, diese Substanz ist allerdings kein Inhibitor für RGS3. Anhand der Röntgenstruktur von RGS4 und Gαi ausgewählte Substanzen, HTS 07963, SCR 01461, HTS 05503 und ChemBridge 6372993 wurden ebenfalls in dem Assay getestet. Auch hier konnte keine Inhibition von RGS3 gezeigt werden.
6 Summary 71
6 Summary
Eva-Christina Schliewert
Regulators of G-Protein Signalling as Drug Target - Development of a Screening Assay for the search for RGS3-Inhibitors
RGS-Proteins shorten the receptor activity of G-protein coupled receptors by accelerating the hydrolosis of GTP to GDP. An overexpression of RGS-Proteins can therefore lead to diseases such as Parkinson, chronic heart failure or epilepsy. As a result substances that inhibit the function of RGS-proteins are searched for.
In this work two proteins that play a major role in the signal transduction cascade, RGS3 and Gαq, were cloned and inserted into an assay platform, the AlphaScreen-Assay. The assay was then established.
A published RGS4-Inhibitor was tested, this substance showed no inhibition of RGS3-protein. Other substances, HTS 07963, SCR 01461, HTS 05503 und ChemBridge 6372993, that had been chosen based on the x-ray structure of RGS4 and Gαi were also tested. They did not show an inhibition of RGS3 either.
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