Analyse von MHC II Molekülen und Beladungskofaktoren in gereinigten Dünndarmepithelzellen der Maus

Aus dem Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung Zellbiologie des Zentrums Anatomie

der Medizinischen Hochschule Hannover

Analyse von MHC II Molekülen und Beladungskofaktoren in gereinigten Dünndarmepithelzellen der Maus

Inaugural-Dissertation

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Gesa Meyer

aus Wildeshausen

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Hassan Naim für die Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. Ernst Ungewickell

für die Medizinische Hochschule Hannover Dr. Robert Lindner

1. Gutachter: Prof. Dr. Hassan Naim

2. Gutachter: Prof. Dr. Gerd Bicker

Tag der mündlichen Prüfung: 06.06.2003

meinem Vater

Inhaltsverzeichnis:

1. Einleitung ...1

2. Literaturübersicht ...2

2.1 Das Immunsystem ...2

2.1.1 Angeborene Immunantwort ...2

2.1.2 Adaptive Immunantwort ...3

2.2 MHC Moleküle...4

2.2.1 MHC Klasse I...4

2.2.2 MHC Klasse II ...5

2.3 Invariante Kette...7

2.4 Antigenprozessierung und Beladung von MHC II...8

2.4.1 Aufnahme des Antigens ...8

2.4.2 Antigenprozessierung...8

2.4.3 Transport und Beladung von MHC II Molekülen...9

2.5 Immunologische Verhältnisse im Dünndarm ...13

2.5.1 Einführung ...13

2.5.2 Anatomisch-morphologische Gegebenheiten ...14

2.5.3 Immunologische Einrichtungen des Dünndarms ...18

2.5.4 Dünndarmepithelzellen als immunologisch aktive Zellen...20

3. Materialien und Methoden...22

3.1 Materialien...22

3.1.1 Chemikalien ...22

3.1.2 Lösungen,Puffer und Medien...24

3.1.3 Molekulargewichtsstandards...27

3.1.4 Antikörper ...28

3.1.4.1 Primärantikörper ...28

3.1.4.2 Sekundärantikörper ...29

3.1.4.3 Brückenantikörper...29

3.1.5 Zelllinien ...29

3.2 Methoden ...30

3.2.1 Zellbiologische Methoden...30

3.2.1.1 Isolation von Dünndarmepithelzellen ...30

3.2.1.2 Isolation von Dünndarmepithelzellen nach D. Kaiserlian ...31

3.2.1.3 Isolation von dendritischen Zellen...31

3.2.1.4 Isolation von Lymphozyten aus der Milz...32

3.2.1.5 Kultivierung von Zellen ...32

3.2.1.6 Ernte und Zählen der Zellen...32

3.2.1.7 Lyse von Zellen...33

3.2.2 Biochemische Methoden...34

3.2.2.1 SDS-PAGE ...34

3.2.2.2 Westernblot ...34

3.2.2.3 Proteinbestimmung mittels BCA ...35

3.2.2.4 Abspaltung N-glykosidisch gebundener Zuckerkewtten ...36

3.2.3 Immunologische Methoden...37

3.2.3.1 Immunpräzipitation Markierung von Zellproteinen durch Biotinylierung ...37

3.2.3.2 Markierung von Zellproteinen durch Biotinylierung ...37

3.2.3.3 Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie ...38

3.2.4 Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie ...41

4. Ergebnisse ...42

4.1 Etablierung einer Methode zur Isolation von Dünndarmepithelzellen ...42

4.1.1 Einführung ...42

4.1.2 Etablierung der Methode...42

4.1.3 Versuche zur Abschätzung der Reinheit der Epithelzellpräparation ...47

4.2 Biochemischer Nachweis von MHC II und seinen Beladungskofaktoren ...49

4.2.1 Einführung ...49

4.2.2 Biochemischer Nachweis von MHC Klasse II ...49

4.2.3 Biochemischer Nachweis von invarianter Kette ...52

4.2.4 Biochemischer Nachweis von H2-M ...60

4.2.5 Lokalisierung von MHC II sowie invarianter Kette in Dünndarmepithelzellen ...61

4.2.6 Lokalisierung von MHC II im Verhältnis zu Lamp I...63

4.2.7 Lokalisierunge der invarianten Kette ...65

4.3.8 Lokalisierung von MHC II im Verhältnis zur invarianten Kette ...66

5. Diskussion...68

5.1 Etablierung einer Methode zur Isolation von Dünndarmepithelzellen ...68

5.2 Eexpression von MHC II in Dünndarmepithelzellen der Maus...71

5.3 Invariante Kette in Dünndarmepithelzellen der Maus ...73

5.4 H2-M in Dünndarmepithelzellen der Maus ...75

5.5 Schlussbetrachtung...76

6. Zusammenfassung...77

7. Summary ...79

8. Literaturverzeichnis ...80

8. Anhang...86

8.1 Abkürzungsverzeichnis ...86

8.3 Danksagung...88

1 Einleitung

Wirbeltiere besitzen zur Vermeidung von Infektionskrankheiten ein gut organisiertes Abwehrsystem, das sogenannte Immunsystem. Ein Teil dieses Immunsystems wird von der adaptiven Immunantwort gebildet. Sie basiert auf sogenannten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) mit der Funktion, Antigene, also Bruchstücke körperfremder Substanzen oder Organismen, einer bestimmten Klasse von Lymphozyten, den T-Zellen, zu präsentieren. Die Antigene müssen hierfür zunächst in kleine Peptidfragmente gespalten werden. Dieser Vorgang wird als

„Antigenprozessierung“ bezeichnet. Danach werden die Antigenfragmente mit Hilfe verschiedener Kofaktoren an bestimmte Proteine, sogenannte MHC-Moleküle, gebunden. Man kennt zwei Klassen von MHC Molekülen: I und II. MHC Klasse I Moleküle nehmen cytosolische Antigene auf;

MHC Klasse II Moleküle binden Antigene, die Zugang zu endozytischen Kompartimenten haben.

Zusammen mit den MHC Molekülen werden die Antigenfragmente an die Zelloberfläche transportiert und dort T-Zellen präsentiert. Diese sind dann in der Lage, die jeweils notwendigen Abwehrmechanismen in Gang zu setzen.

Chronisch entzündliche Erkrankungen des Darms beruhen darauf, dass die im physiologischen Zustand vorherrschende immunologische Toleranz gegenüber zugeführten Antigenen aus der Nahrung in immunologische Abwehr umschlägt. Um die hierfür verantwortlichen Mechanismen verstehen und daraus Therapieansätze ableiten zu können, müssen zuvor die zellulären und molekularen Grundlagen der immunologischen Mechanismen des Darms genau bekannt sein.

Welche Rolle spielen hierbei die Epithelzellen des Dünndarms?

Im Rahmen dieser Arbeit sollte begonnen werden, Enterozyten der Maus auf diese Frage hin zu untersuchen. Das Fernziel des gesamten Projektes liegt in der Charakterisierung ihrer Antigenprozessierung und Beladung von MHC Klasse II.

Als Ausgangspunkt sollte ein Verfahren zur Isolierung möglichst intakter Dünndarmepithelzellen aufgebaut werden. Kontaminationen durch andere, insbesondere durch zur Antigenpräsentation befähigte Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, sollten vermieden werden. Diese würden die Ergebnisse beeinflussen und damit verfälschen. Hierfür wurde eine 1989 von Dominique Kaiserlian und Mitarbeitern entwickelte Methode zur Isolation von intestinalen epithelialen Zellen (Kaiserlian et al., 1989) optimiert.

Die ersten Schritte zur Charakterisierung der Vorgänge der Antigenprozessierung und der Beladung von MHC II einer Dünndarmepithelzelle bildeten Untersuchungen zur Expression von MHC Klasse II sowie dessen Kofaktor invariante Kette. Als Kontrolle wurde die Expression dieser Moleküle unter Verwendung derselben Methodik vergleichend in einer professionellen APC überprüft. Im Anschluss wurde die Lokalisation von MHC II und invarianter Kette innerhalb von Dünndarmepithelzellen bestimmt.

Einleitung 2

2 Literaturübersicht

2.1 Das Immunsystem

Mit der Entdeckung des Erregers der Tuberkulose durch Robert Koch im Jahr 1882 wurde zum ersten Mal ein Mikroorganismus als Ursache einer Krankheit nachgewiesen. Der Begriff der Infektionskrankheit wurde eingeführt und es entstand eine neue Wissenschaft, die sich mit den Reaktionen des Körpers auf die Erreger dieser Krankheiten beschäftigt: die Immunologie.

Das Immunsystem hat sich bei Wirbeltieren als Antwort auf eindringende körperfremde Substanzen und Organismen entwickelt. Die ihm zugrundeliegenden Mechanismen lassen sich in die angeborene und die erworbene Immunantwort einteilen. Beide basieren auf den Reaktionen der weißen Blutkörperchen, den Leukozyten.

2.1.1 Angeborene Immunantwort

Mechanismen der angeborenen Immunantwort stellen den primären Schutz gegen Pathogene wie Viren, Bakterien, Pilze und tierische Parasiten. Der erste Abwehrmechanismus, auf den das eindringende Pathogen trifft, wird von der epithelialen Barriere des Körpers gebildet. Diese ist in erster Linie eine mechanische Schutzschicht; bietet aber außerdem noch chemischen Schutz durch die Produktion bestimmter kationischer Peptide. Als wichtigste Beispiele hierfür sind die Defensine zu nennen, welche auf der Haut und im Magen-Darm-Trakt zu finden sind, sowie die im Darm lokalisierten Cryptidine. Diese Peptide wirken vermutlich über die Zerstörung der Zellmembran der Mikroorganismen antibakteriell. Die in der Lunge sezernierten Oberflächenproteine A und D sind in der Lage, an Pathogene zu binden und ihre Oberfläche zu bedecken. Damit wird das Pathogen markiert (opsonisiert).

Wird der epithelialen Schutzwall durchbrochen, trifft das Pathogen auf eine zweite Abwehrlinie. Die wichtigste Rolle darin spielen dendritische Zellen, Makrophagen und neutrophile Leukozyten.

Diese phagozytotischen Zellen zeichnen sich durch Oberflächenrezeptoren aus, die allgemein vorkommende Bausteine von bakteriellen Oberflächen, zum Beispiel Lipopolysaccharide (LPS), erkennen und an diese binden. Ist dies geschehen, umfließt der Phagozyt den Erreger und nimmt ihn schließlich auf. Im Inneren der Zelle wird das Pathogen dann enzymatisch abgebaut.

Außerdem können Makrophagen und neutrophile Granulozyten toxische Substanzen, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid (H2O2), Superoxidradikale (O2

.-) und Stickstoffmonoxid (NO) produzieren, welche dazu beitragen, die aufgenommenen Mikroorganismen zu zerstören.

Das Binden von Pathogenen durch dendritische Zellen und aktivierte Makrophagen führt nicht nur zur Phagozytose der Pathogene, sondern auch zum Anstoß der „induzierten Immunantwort“ im Rahmen der angeborenen Immunität. Bisher am besten erforscht ist hierbei der Weg über Signalrezeptoren, die zur Familie der „Toll-like“-Rezeptoren gehören. Sie signalisieren das Vorhandensein bestimmter mikrobieller Strukturen. Der TLR-4 zum Beispiel reagiert auf die Anwesenheit von bakteriellem LPS, indem er mit CD14, dem Rezeptor der Makrophagen für LPS, assoz iiert. Dadurch kommt es zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB. Dieser wiederum aktiviert Gene, die für die Produktion Cytokinen und Chemokinen verantwortlich sind, welche als Entzündungsmediatoren fungieren und natürliche Killerzellen aktivieren können.

Außerdem werden für die Induktion der adaptiven Immunantwort essentielle, sogenannte

„kostimulierende Moleküle“ in dendritischen Zellen und Makrophagen induziert.

Eine weitere zu erwähnende Komponente des angeborenen Immunsystems ist das Komplementsystem. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit spielt es aber keine Rolle und so soll hier nicht weiter darauf eingegangen werden.

Da viele infektiöse Organismen durch das angeborene Immunsystem nicht vollständig beseitigt werden können, hat sich im Laufe der Evolution zusätzlich die sogenannte adaptive oder erworbene Immunantwort entwickelt.

2.1.2 Adaptive Immunantwort

Unter diesem Begriff werden Immunreaktionen zusammengefasst, die ein Wirbeltier im Laufe seines Lebens durch den Kontakt mit spezifischen Mikroorganismen entwickelt. Die Mediatoren der adaptiven Immunantwort sind Lymphozyten, welche in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden:

B-Lymphozyten und T-Lymphozyten. T-Lymphozyten stehen im Mittelpunkt der sogenannten zellvermittelten Immunantwort. Sie lassen sich in zwei große Gruppen unterteilen.

Cytotoxische T-Zellen (CD8+) reagieren auf Körperzellen, welche vom normalen Spektrum abweichende cytosolische Antigene enthalten. Hierbei handelt es sich vor allem um virale Antigene. Die Zielzellen werden direkt getötet. T-Helfer-Zellen (CD4+) sorgen für eine effektive Immunantwort bei der Bekämpfung von in der Regel extrazellulären Erregern. Diese Erreger oder ihre Antigene können in endozytische Organellen aufgenommen werden. Eine wichtige Untergruppe der Helferzellen, sogenannte TH1-Zellen, induzieren bei phagozytotischen Zellen die Verschmelzung von enzymhaltigen Lysosomen mit den Antigen enthaltenden Vesikeln. Auf diese Weise wird die Zerstörung des Erregers eingeleitet. Eine andere Untergruppe, sogenannte TH2- Zellen, regt B-Zellen zur Produktion von Antikörpern an. B-Zellen differenzieren dabei überwiegend zu sogenannten Plasmazellen, welche gegen das Antigen gerichtete Antikörper freisetzen.

Literaturübersicht 4

Ein solches Antikörpermolekül muss zum einen spezifisch Antigen binden können, zum anderen muss es in der Lage sein, andere Zellen und Moleküle heranzuziehen, die weiter zur Zerstörung z.B. eines Pathogens beitragen können. Strukturell besteht es aus vier Polypeptidketten, welche sich zu einem Y-förmigen Molekül zusammenlagern. Die beiden „Arme“ sind identisch und durch hohe Variabilität gekennzeichnet. Sie sind für die Bindung des Antigens zuständig und werden als Fab-Fragmente (fragment antigen binding) bezeichnet. Das Rumpf-Fragment ist in der Lage, mit anderen Zellen und Molekülen in Kontakt zu treten. Aufgrund seiner leichten Kristallisierbarkeit wird er Fc-Fragment (fragment crystallizable) genannt.

T-Lymphozyten erkennen ihre Zielzellen mittels spezifischer Rezeptoren. Diese Rezeptoren nehmen Antigene wahr, welche andere Zellen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Diese Präsentation erfolgt immer in Verbindung mit speziellen Proteinen, den MHC (major histocompatibility complex) - Molekülen.

2.2 MHC – Moleküle

Die Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) - Moleküle wurden nach ihrer Entdeckung im Zusammenhang mit Abstoßungsreaktionen bei Gewebstransplantationen benannt. Diese Moleküle werden neben weiteren in einem Genkomplex kodiert, welcher noch heute als Haupthistokompatibilitätskomplex bzw. MH-Komplex (MHC) bezeichnet wird. Bei den MHC Moleküle werden zwei Klassen unterschieden: MHC Klasse I und MHC Klasse II.

Während ihrer biosynthetischen Reifung binden die MHC-Moleküle an Peptide, bringen diese an die Zelloberfläche und sorgen so für eine kontuinuierliche Präsentation der Proteinbestandteile einer Zelle an ihrer Oberfläche. Alle diese an MHC-Moleküle gebundenen Peptidfragmente unterliegen der ständigen Kontrolle durch T-Zellen (Übersicht bei Watts,1997).

2.2.1 MHC Klasse I

MHC-Klasse-I-Moleküle präsentieren cytosolische Peptide einer Zelle. Dies geschieht mit unterschiedlichem Expressionsniveau auf allen Körperzellen, welche einen Zellkern besitzen.

Antigenfragmente auf MHC-Klasse-I-Molekülen werden von cytotoxischen T-Zellen erkannt.

Das MHC Klasse I - Molekül besteht aus zwei Polypeptidketten, welche vier Domänen bilden. Die α1, α2 und α3 - Domänen werden von der α - Kette gebildet, welche die Membran durchdringt. β2- Mikroglobulin stellt die vierte Domäne dar. Die α1- und α2-Domänen lagern sich zusammen und

bilden die sogenannte peptidbindende Grube. Der Boden dieses länglichen Spalts wird von einer flachen β-Faltblatt-Struktur gebildet, die beiden Seiten werden von den Innenseiten zweier α- Helices begrenzt. Die Grube ist an zwei Seiten geöffnet. Bei den MHC Klasse I - Molekülen ist diese Öffnung relativ schmal. Als Folge bindet das MHC Klasse I - Molekül in der Regel nur Peptide mit einer Länge von 8-9 Aminosäuren fest.

Abbildung 2.1

Links: Modell der peptidbinden Grube des MHC Klasse I Moleküls: Das Molekül interagiert mit dem Peptid (dargestellt ist das Rückgrad in gelb) über eine Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen und ionischen Wechselwirkungen (blaue Linien). Das aminoterminale Ende des Peptids befindet sich im Modell links, der Carboxyterminus rechts. Die Aminosäurereste, welche mit einem Peptid wechselwirken sind allen MHC I Molekülen gemein: Eine Reihe von Tyrosinresten (dargestellt als graue Punkt-Strich-Modelle) bildet Wasserstoffbrücken, andere Reste interagieren mit dem Peptidrückrad an dessen Carboxy-Terminus (aus Janeway et al., 1997).

Rechts: Schematische Darstellung der Struktur eines MHC Klasse I Moleküls.

α1, α2 und α3 bezeichnen die drei Domänen der α-Kette des Moleküls.

2.2.2 MHC Klasse II

MHC Klasse II Moleküle werden in Abwesenheit inflammatorischer Stimuli nur von sehr wenigen Zelltypen exprimiert, sogenannten professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APCs). Die häufigsten professionellen APCs sind dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen. Daneben gibt es aber noch weitere Zellen, welche andere Funktionen im Körper erfüllen, aber bei inflammatorischer Stimulation ebenfalls in der Lage sind, als antigenpräsentierende Zellen zu fungieren. Man bezeichnet sie als nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen. Hierzu gehören zum Beispiel die Epithelzellen der Lunge oder Endothelzellen.

Das MHC-Klasse-II-Molekül ist dem MHC-Klasse-I-Molekül in seiner Struktur sehr ähnlich. Es besteht aus einem nichtkovalenten Komplex zweier Polypeptidketten, welche α und β genannt

Literaturübersicht 6

werden. Beide durchdringen die Membran. Das Molekül lässt sich in vier Domänen einteilen: α1 und α2 werden von der α-Kette gebildet, β1 und β2 von der β-Kette. Die α1 und β1 - Domänen lagern sich zu einem Paar zusammen und schaffen damit einen peptidbindenden Spalt an der Oberfläche des Moleküls. Die beiden Seiten dieser Grube werden von den Innenseiten zweier α- Helices begrenzt, der Grubenboden wird von einer β-Faltblattstruktur gebildet. Die beiden Öffnungen der Grube sind relativ weit, so dass auch recht lange Peptide gebunden werden können.

Abbildung 2.2

Links: Modell der peptidbindenden Grube des MHC Klasse II Moleküls: Das Molekül interagiert mit dem gebundenen Peptid (dargestellt ist das Rückgrad in gelb) über eine Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen und ionischen Wechselwirkungen (blau). Das aminoterminale Ende des Peptids befindet sich im Modell links, der Carboxyterminus rechts. Das Peptid wird durch eine Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen, welche sich über das gesamte Molekül verteilen (blau Linien) festgehalten. Die relevanten Reste sind dabei als graue Punkt-Strich-Modelle dargestellt (aus Janeway/Travers S.127).

Rechts: Schematische Darstellung der Struktur eines MHC Klasse II Moleküls. Die Domänen α1 und α2 bilden die α-Kette, β1 und β2 bilden die β-Kette.

Der Peptid-MHC Komplex wird nach seinem Transport an die Zelloberfläche T-Zellen präsentiert.

Falls es sich um das für den jeweiligen T-Zell-Rezeptor spezifische Peptid handelt, kann dies zu einer Aktivierung der T-Zelle führen. Bei „naiven“, noch nicht aktivierten T-Zellen sind sogenannte kostimulierende Moleküle auf der Oberfläche der APC notwendig, welche mit bestimmten Oberflächenmolekülen der T-Zelle wechselwirken. Wichtige kostimulierende Proteine sind CD 80, CD 86 oder CD 40.

Eine „naive“ T-Zelle wird nach Antigenerkennung ohne costimulierendes Signal inaktiviert und in einen Zustand überführt, der als Anergie bezeichnet wird. Sie ist dann nicht mehr in der Lage, Interleukin 2 zu produzieren und zeigt ihrem Antigen gegenüber „immunologische Toleranz“.

2.3 Invariante Kette

Die invariante Kette ist ein 30 kD schweres Glykoprotein, welches die Plasmamembran der Zelle einmal durchdringt. Der kurze aminoterminale Rest des Proteins befindet sich auf der dem Zytoplasma zugewandten Seite der Membran. Der mit Zuckerketten versehene carboxyterminaler Abschnitt ist auf der extracytoplasmatischen Seite der Membran zu finden.

Durch unterschiedliches Spleißen können zwei etwas unterschiedlichen Formen der invarianten Kette entstehen: p31 sowie die längere Form p41. Diese besitzt 64 zusätzliche Aminosäuren auf der cytoplasmatischen Seite, die einen Proteasen-hemmenden Bereich (Proteaseinhibitordomäne) ausbilden (Bevec et al., 1996). Die Regel ist eine Koexpression von p31 und p41 in professionellen APCs. Das Verhältnis der beiden Formen zueinender kann hierbei variieren.

Jeweils drei Proteine invariante Kette lagern sich nach ihrer Synthese im endoplasmatischen Retikulum (ER) zu einem sogenannten Trimer zusammen. Jede dieser drei Untereinheiten kann im ER ein MHC Klasse II-Molekül binden und dabei als sogenanntes Chaperon dessen korrekte Faltung unterstützen (Anderson et al., 1992; Romagnoli et al., 1994). Die invariante Kette wird so von MHC II gebunden, dass ein Teil seiner Polypeptidkette, das sogenannte CLIP- (class-II- associated invariant chain peptide) Fragment, in der Peptidbindungsfurche des MHC II liegt (Ghosh et al., 1995). Auf diese Weise wird die Bindungsfurche blockiert und eine Bindung von Peptiden oder partiell gefaltete Proteine an die MHC Klasse II Moleküle im ER verhindert (Roche und Cresswell, 1991; Busch et al., 1996) (s. Abbildung 2.3).

Eine Sortierungssequenz im cytoplasmatischen Schwanz der invarianten Kette (Peters et al., 1991; Bakke und Dobberstein, 1990; Pieters et al., 1993; Übersicht bei Geuze, 1998) dirigiert die gebundenen MHC Klasse II-Moleküle zu einem späten endosomalen Kompartiment mit niedrigem pH-Wert, dem sogenannten MHC II-Beladungskompartiment.

Literaturübersicht 8

Abbildung 2.3

Modell eines Trimers der invarianten Kette (links) und eines MHC Klasse II - Invariante Kette - Komplexes (rechts): In der rechten Abbildung wurde der dritte MHC-Klasse-II-Komplex zur Erleichterung der Darstellung entfernt.

Die carboxyterminale Region zwischen den Resten 118 und 193 vermittelt die Trimer-Bildung, die Region zwischen den Resten 81 und 104, welche als CLIP (class-II-associated invariant chain peptide) bezeichnet wird, blockiert die peptidbindende Grube. (Cresswell, 1996)

2.4 Antigenprozessierung und Beladung von MHC Klasse II

2.4.1 Aufnahme des Antigens

In den verschiedenen professionellen antigenpräsentierenden Zellen werden exogene Antigene über rezeptorvermittelte Endozytose, Phagozytose und Micro- bzw. Macropinozytose in das Zellinnere aufgenommen. Hier durchlaufen sie den endozytotischen Weg bis zum Lysosom (Übersicht bei Geuze, 1998).

2.4.2 Antigenprozessierung

Für die effektive Präsentation müssen Antigene zunächst in kleinere Fragmente gespalten werden.

Die hierfür verantwortlichen Proteasen sind noch nicht vollständig charakterisiert. Die initiative Rolle scheint das Enzym AEP (asparaginyl endopeptidase) zu spielen (Manoury et al., 1998).

Weiterhin beteiligt sind Enzyme der Cathepsin-Familie, insbesondere Cathepsin B (Zhang et al., 2000), Cathepsin E (Nishioku et al., 2002) und für einige Antigene auch Cathepsin L und S (Hsieh

et al., 2002). GILT (gamma-interferon-inducible lysosomal thiol-reductase) ist für die Spaltung von Disulfidbrücken zuständig (Maric et al., 2001). Auch die p41 Form der invarianten Kette ist, wie erwähnt, in der Lage, die proteolytische Umgebung des Endosoms zu beeinflussen. Sie besitzt Homologien zur Cystatin Familie der Protease-Inhibitoren (Bevec et al., 1996). Hieraus lässt sich ein dementsprechender Einfluss der invarianten Kette auf die Protease-Aktivität vermuten.

Die in den endosomalen Kompartimenten jeweils vorzufindenden Proteasen, der herrschende pH- Wert und das Reduktionspotential nehmen einen wichtigen Einfluss auf die resultierende Antigenprozessierung. Sie geben einen jeweils unterschiedlichen Prozessierungsweg vor. So können aus ein und demselben Antigen viele verschiedene zu präsentierende Peptidfragmente entstehen (Übersicht bei Watts, 1997).

2.4.3 Transport und Beladung von MHC Klasse II Molekülen

Klasse II αβ−Dimere formen im ER mit der invarianten Kette einen Komplex, der noch nicht mit Peptiden wechselwirken kann, weil die peptidbindende Grube durch die CLIP-Region der invarianten Kette besetzt ist. Dieser Komplex wird aus dem Endoplasmatischen Retikulum transportiert, passiert den Golgi-Apparat und wird dann vom Trans-Golgi-Netzwerk aus zu frühen Endosomen transportiert. Der größte Teil dieser Komplexe gelangt von hier aus direkt weiter zu späten Endosomen, welche aufgenommene und prozessierte Antigene enthalten. Eine kleine Fraktion kann vorübergehend an die Zelloberfläche gelangen, wird aber schnell wieder in das Innere der Zelle aufgenommen (Lindner, 2002) (s. Abbildung 2.4).

Literaturübersicht 10

Abbildung 2.4

Modell für den Transport eines MHC II - invariante Kette - Komplexes zu den MHC II - Peptid – Beladungskompartimenten (nachLindner, 2002)

Bis heute ist es nicht gelungen, den Ort der Beladung von MHC Klasse II - Molekülen mit Peptiden genau zu charakterisieren. Wahrscheinlich handelt es sich nicht um ein einziges spezifisches Kompartiment, sondern um mehrere verschiedene Kompartimente, welche als Beladungsort genutzt werden können. Der Beladungsort hängt von der Herkunft des Peptids, dem MHC II - Haplotyp und der jeweiligen antigenpräsentierenden Zelle ab. Er kann sich auf der Ebene des frühen Endosoms bis zum Lysosom befinden (Geuze, 1998). Laut Literatur ist das Beladungskompartiment morphologisch als multivesikuläres Körperchen (Pieters et al.,1991;

Humbert et al., 1993; Calafat et al., 1994; Amigorena et al.,1994; Tulp et al.,1994) oder als multilamelläres Körperchen (Peters et al., 1991) charakterisiert.

Die invariante Kette wird eventuell bereits auf ihrem Weg zum MHC II Beladungskompartiment, spätestens aber, wenn sie dort angekommen ist, durch proteolytische Enzyme in mehreren Schritten gespalten. Bei den Proteasen handelt es sich vornehmlich um solche aus der Familie der

Cathepsine, nämlich Cathepsin D (Zhang et al., 2000), Cathepsin F (Shi et al.,2000) sowie die Cathepsine L und S (Hsieh et al., 2002). Die p41 Form der invarianten Kette scheint ihre Proteolyse direkt zu beeinflussen, da sein Proteaseinhibitorfragment an die lysosomale Protease Cathepsin L binden und sie inhibieren kann. (Lennon-Dumenil et al., 2001; Fineschi et al., 1995, Übersicht bei Turk et al, 1999). Die ersten Abbauschritte führen zu einem ~20-24kD Fragment und weitere zu ~10-12 kD Produkten. Diese werden dann wiederum zu einem am MHC-Klasse-II- Molekül gebunden bleibenden Fragment, CLIP (class-II-associated invariant chain peptide), zerlegt (Busch et al., 1996). Mit diesem bleibt die peptidbindende Grube zunächst blockiert.

Abbildung 2.5

Spaltung der invarianten Kette

a an die peptidbindende Grube von MHC Klasse II gebundene invariante Kette

b Die Spaltung der invarianten Kette hat begonnen. Noch ist ein membranverankertes Fragment an MHC II gebunden.

c Nach weiterem Abbau der invarianten Kette bleibt nur ein kurzes Peptidfragment, CLIP, an MHC II gebunden

Um die Bindung von Peptiden zu ermöglichen, muss das CLIP-Frament entweder abdissoziieren oder verdrängt werden. Hierzu lagert sich ein weiterer wichtiger MHC Klasse II-Beladungs-Kofaktor an den MHC Klasse II - invariante Kette - Komplex an. Er wird beim Menschen als HLA-DM, bei der Maus als H-2M bezeichnet. In seiner Struktur ähnelt er dem MHC Klasse II Molekül, die peptidbindende Grube ist allerdings fast vollständig geschlossen (Mosyak et al., 1998). HLA-DM bindet keine Peptide (Kropshofer et al., 1997). HLA-DM reichert sich in dem MHC II Beladungskompartiment an. Es fördert die Abspaltung des CLIP-Fragments und nur locker bindender Proteinfragmente und unterstützt gleichzeitig die Bindung von Peptiden, die eine hohe Affinität zur peptidbindenden Grube aufweisen (Denzin et al., 1995; Sloan et al., 1995; Sherman et al.,1995; Kropshofer et al., 1996). Zusätzlich stabilisiert HLA-DM die MHC Klasse II Moleküle, so dass sie nicht in ihre beiden Untereinheiten (α und β - Kette) zerfallen können (Denzin et al., 1996) (s.Abbildung 2.6).

Literaturübersicht 12

Abbildung 2.6

Schematische Darstellung der Funktionen von HLA-DM:

(a) HLA-DM fördert die Abspaltung des CLIP-Fragments aus der peptidbindenden Grube des MHC II Moleküls (b) HLA-DM stabilisiert MHC Klasse II Moleküle

(c) HLA-DM fördert die Abspaltung locker bindender Proteinfragmente und fördert die Bindung von Peptiden mit hoher Affinität zur peptidbindenden Grube des MHC II Moleküls

Hat das MHC II Molekül sein spezifisches Peptid gebunden, wird es zur Zelloberfläche transportiert. Eine Möglichkeit, wie die entstehenden MHC-II-Peptid-Komplexe zur Zelloberfläche gelangen, besteht darin, dass sie über Transportvesikel auf direktem Weg zur Plasmamembran gelangen und mit dieser fusionieren. So konnte in dendritischen Zellen gezeigt werden, wie nach Aktivierung der Zellen multivesikuläre Körperchen (MVBs) tubuläre Struktur ausbilden. Die Spitzen der neu ausgebildeten Tubuli „wachsen“ auf die Zellmembran zu und schnüren schließlich an ihrer Spitze Vesikel ab, welche zur Plasmamembran wandern und mit ihr fusionieren. Nimmt man an, dass es sich bei den MVBs um das MHC Beladungskompartiment handelt, so enthalten die abgeschnürten Vesikel vermutlich beladene MHC II Komplexe, die auf diesem Weg zur Zellmembran gelangen (Kleijmeer et al., 2001).

Eine andere Möglichkeit ist die Bildung von Exosomen innerhalb der MHC II Beladungskompartimente. Exosomen sind kleine Membranvesikel, welche durch Einstülpung der Membran des Beladungskompartiments entstehen. Das MHC II Beladungskompartiment kann dann zur Zelloberfläche wandern; seine Membran fusioniert mit der Zellmembran und die Exosomen werden in den extrazellulären Raum entlassen (van Niel et al, 2002).

A

B

Abbildung 2.7

A: Transport von MHC II Peptid Komplexen vom multivesikulären Körperchen zur Zellmembran in dendritischen Zellen:

In ruhenden dendritischen Zellen befindet sich MHC II auf internen Vesikeln in vakuolenförmigen multivesikulären Körperchen (MVBs). Nach Aktivierung der Zellen kommt es zu einer Rückfusion der Vesikel in die limitierende Membran, damit zum Kontakt des MHC II invariante Kette Komplexes mit dem in der Membran befindlichen HLA-DM und im weiteren zur Beladung von MHC II mit Peptid. Die MVBs bilden tubuläre Strukturen aus. An den Spitzen der Tubuli werden schließlich Vesikel abgeschnürt, welche zur Zellmembran wandern. Die in diesen Vesikeln enthaltenen MHC II Peptid Komplexe werden so an die Zelloberfläche transportiert. (aus: Kleijmeer et al., 2001)

B: Produktion und Freisetzung von Exosomen in profesionellen antigenpräsentierenden Zellen:

Exogene Antigene werden durch Endozytose an der Plasmamembrn aufgenommen und in Endosomen prozessiert. Im MHC II Beladungskompartiment entstehen durch Einstülpung der Membran interne Vesikel, das Kompartiment kann nun als multivesikuläres Körperchen (MVB) bezeichnet werden. Das MVB kann anschließend entweder zum Lysosom dirigiert werden oder mit der Zellmembran verschmelzen. Bei der Fusion der MVBs mit der Plasmamembran werden die internen Vesikel als sogenannte Exosomen in den extrazellulären Raum freigesetzt. (nach van Niel et al, 2002)

2.5 Immunologische Verhältnisse im Dünndarm

2.5.1 Einführung

Der Dünndarm, auch Mitteldarm genannt, setzt sich aus drei strukturell und funktionell variierenden aufeinander folgenden Abschnitten zusammen. In anatomischer Reihenfolge werden diese Duodenum (Zwölffingerdarm), Jejunum (Leerdarm) und Ileum (Krummdarm) genannt. Der Dünndarm dient dem Abschluss der bereits im Magen begonnenen Verdauungsprozesse der Nahrungsbestandteile und der Aufnahme der gespaltenen Nahrungsinhaltsstoffe.

Dabei spielt die Schleimhaut des Dünndarms eine zentrale Rolle. Vorrangig dient sie der Resorption von Wasser, Elektrolyten, Vitaminen und der Endprodukte des Verdauungsprozesses.

Alle diese Stoffe werden durch die freie Oberfläche des Epithels aufgenommen und an das Blut- oder gegebenenfalls an das Lymphgefäßsystem wieder abgegeben. Weiterhin erfolgt die Sekretion

Literaturübersicht 14

eines Teils des enzymhaltigen Darmsaftes, wie auch die Synthese und Abgabe von Schleim zum Schutz des Gewebes der inneren Darmoberfläche, über die Dünndarmschleimhaut. Die Bildung von Gewebshormonen findet ebenfalls hier statt.

Daneben kann die enterale Schleimhaut als das flächenmäßig größte lymphatische Organ des Körpers bezeichnet werden und ist dementsprechend aktiv an immunologischen Reaktionen beteiligt (nach Liebich, 1993).

2.5.2 Anatomisch-morphologische Gegebenheiten

Der Darm ist auf seiner gesamten Länge aus geschichteten Gewebeabschnitten aufgebaut. Geht man in der Betrachtung vom inneren Hohlraum, dem sogenannten Lumen, nach außen, stößt man zunächst auf die Tunica mucosa, die Schleimhautschicht. Ihr oberflächliches, einschichtiges, hochprismatisches Epithel bildet die Innenauskleidung des Darms. Sie wird durch eine sogenannte Basalmembran von dem darunterliegenden lockeren Bindegewebe, der Lamina propria mucosae, getrennt. Dieses subepitheliale Gewebe beinhaltet Blut- und Lymphgefäße, Nervenfasergeflechte sowie eine große Zahl von eingewanderten immunologisch aktiven Zellen wie Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen und T- und B-Lymphozyten. Die Tunica mucosa wird durch eine Muskelschicht, die Lamina muscularis mucosae abgeschlossen.

Die nach außen hin folgenden Schichten sind die Submucosa (Unterschleimhautbindegewebe), die Tunica muscularis (Muskelschichten), die Tunica adventitia (Bindegewebsschicht), die Subserosa und abschließend die Serosa.

Für die vorliegende Arbeit ist lediglich die Tunica mucosa von Bedeutung.

Abbildung 2.8

Schematische Darstellung des Wandbaus des Darmtrakts am Beispiel der Speiseröhre eines Pferdes aus: Liebich, 1993

Zur Bewältigung der Hauptaufgaben des Epithels im Dünndarm, welche wie beschrieben aus Resorption und Sekretion bestehen, findet man eine ausgeprägte Oberflächenvergrößerung durch Falten, Zotten, Krypten und Mikrovilli. Zotten werden durch fingerförmige Ausstülpungen der Lamina propria mucosae und des diese überziehenden Epithels gebildet. Die Zellmembran dieser Epithelzellen stülpt sich ihrerseits aus und bildet auf diese Weise einen dichten Besatz mit Mikrovilli. Die Schleimhaut ist außerdem durch Epitheleinsenkungen gekennzeichnet, welche als Lieberkühnsche Krypten bezeichnet werden. Im Bereich dieser Krypten befinden sich die undifferenzierten Stammzellen des Epithels, welche sich mitotisch teilen, entlang der Zottenachse Richtung Spitze wandern und währenddessen in die nachfolgend beschriebenen unterschiedlichen Zelltypen des Dünndarmepithels differenzieren (Cheng et al., 1974). Daneben weisen die Krypten verschiedene Drüsenzellen auf, die für die Sekretion von Bedeutung sind.

Literaturübersicht 16

Abbildung 2.9

Schema einer Zotte des Dünndarms:

Schiebler et al, 2000

Das Dünndarmepithel besteht aus vier vorherrschenden Zellformen:

Enterozyten

Enterozyten sind hochprismatische Epithelzellen, welche eine deutliche Polarität aufweisen. Ihre Zellmembran ist in einen apikalen (oberen) und einen basolateralen (unteren) Bereich zu unterteilen. Im Zellinneren befindet sich der längsovale, locker strukturierte Kern. Die Zellen sind reich an Mitochondrien und ER und weisen einen gut ausgebildeten Golgi-Apparat auf. Apikal bilden Enterozyten Mikrovilli aus, welche regelmäßig und dicht angeordnet sind. Sie haben eine Länge von 1-1,5µm und einen Durchmesser von ungefähr 0,1µm auf, ihre Anzahl pro Zelle beträgt etwa 2000-3000 bzw. bis zu 200 Millionen pro mm² Epitheloberfläche. Die Mikrovilli bilden in ihrer Gesamtheit einen sogenannten Bürstensaum, der bereits lichtmikroskopisch erkennbar ist. Die Membran ist in diesem Bereich außen von einer großen Anzahl an Zuckerketten überzogen, der sogenannten Glykokalix. Die Enterozyten sind im apikalen Bereich untereinander durch sogenannte Schlussleistenkomplexe verbunden. Diese bestehen aus Zonulae occludentes (Tight junctions), Zonulae adhaerentes (adhering junctions) und Maculae adhaerentes (Desmosomen).

Die Zonulae occludentes bilden zum einen eine Barriere, welche die Diffusion von Stoffen von luminal in den Interzellularraum verhindert; zum anderen wirken sie innerhalb der Membran als

"Zaun", der eine Vermischung von apikalen und lateralen Membranbereichen unterbindet und somit zur Aufrechterhaltung der Zellpolarität beiträgt. Zonulae adhaerentes und Desmosomen sind im wesentlichen Haftkomplexe, welche die Zytoskelette der benachbarten Epithelzellen miteinander verbinden. Des weiteren sind die Enterozyten über Nexus (gap junctions) miteinander verbunden, die einen interzellulären Stoffaustausch niedermolekularer Substanzen und Ionen ermöglichen. Basal stehen die Zellen in engem Kontakt zur Basalmembran.

Abbildung 2.10

Schema eines Enterozyten aus: Liebich, 1993

Becherzellen

Die Epithelschicht der Zottenoberfläche und der Krypten enthält neben den Enterozyten Becherzellen, die in ihrer Zahl vom Duodenum über das Jejunum bis zum Ileum zunehmen.

Becherzellen sind einzellige intraepitheliale Drüsen, die einen glykoprotein- und glykolipidreichen Schleim produzieren, welcher merokrin auf die Oberfläche der intestinalen Schleimhaut abgegeben wird. Dort wirkt er wirkt zytoprotektiv und bakterizid (Liebich, 1993).

Endokrine Zellen

Die endokrinen Zellen des Darms gehören zusammen mit vergleichbaren endokrinen Zellen des Magens und des Pankreas zu den Zellen des sogenannten gastroentero-pankreatischen endokrinen Systems. Sie liegen intraepithelial bevorzugt in der Wand der Krypten (s. Abb 1.10) und geben ihre Sekretgranula inkretorisch an das eng anliegende subepitheliale Kapillarnetz ab.

Ihre Wirkstoffe beeinflussen stimulierend bzw. hemmend die Abgabe von Verdauungsenzymen und die Darmmotorik (Liebich, 1993).

Literaturübersicht 18

Paneth-Zellen

Paneth-Zellen liegen am Grund der Lieberkühnschen Krypten (s. Abb. 1.10). Sie sind gekennzeichnet durch eine große Anzahl azidophiler Granula, die sich apikal im Zytoplasma häufen. Paneth-Zellen geben exokrin ein seröses Sekret ab, das unter anderem reich ist an anti- mikrobiellen Substanzen wie Lysozym und Defensinen (Porter et al., 2002; Ganz, 2000; Ouellette et al., 2001).

2.5.3 Immunologische Einrichtungen des Dünndarms

Die Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts kommt zeitlebens mit einer Vielzahl körperfremder Stoffe und Mikroorganismen (Nahrungsmittelantigene, Viren, Bakterien, Pilze, tierische Parasiten) in Kontakt. Um ein Übertreten in das Körperinnere zu verhindern, besitzt die Tunica mucosa unspezifische und spezifische Schutzmechanismen, die in ihrer Gesamtheit eine Schleimhautbarriere bilden.

An unspezifischen Mechanismen ist zuallererst die bakterizide Wirkung des von den Becherzellen produzierten Schleims auf die Mikroorganismen zu nennen, welche zudem durch die zähe Konsistenz des Schleims in ihrer „Bewegungsfähigkeit“ gebremst werden (Übersicht bei Spezian et al., 1991). Zudem hat Laktoferrin als Bestandteil der Darmsekrete bakteriostatische Wirkung (Übersicht bei McNabb und Tomasi, 1981). Weiterhin wird von den Paneth-Zellen am Grund der Lieberkühnschen Krypten ein antimikrobielles Sekret abgegeben, welches Lysozym und Defensine enthält (Porter et al., 2002). Darüberhinaus verhindert die physiologische Darmflora oftmals eine pathogene Keimbesiedelung durch Konkurrenzwirkung.

Der wichtigste spezifische Schutzmechanismus geht auf die lymphatischen Zellsysteme der Dünndarmschleimhaut zurück, welche unter dem Begriff GALT (gut associated lymphoid tissue = darmassoziiertes lymphatisches Gewebe) zusammengefaßt werden. Dazu gehören die Gaumen- und Rachenmandeln sowie das lymphatische Gewebe des Darmtrakts, welches als einzelne Follikel oder in Gruppen von Lymphfollikeln, den sogenannten Peyerschen Platten, organisiert ist.

Peyersche Platten sind besonders zahlreich im Ileum vertreten. Sie sind in der Submucosa gelagert, schieben sich aber meist weit in die Tunica mucosa vor, so dass sie sich kuppelartig in das Darmlumen vorwölben und häufig sogar die Darmzotten verdrängen.

In der Umgebung eines Lymphfollikels befinden sich cytotoxische T-Zellen. T-Helferzellen, Makrophagen und dendritische Zellen sind am Rand des Keimzentrums zu finden. Im Zentrum der Lymphfollikel finden sich B-Lymphozyten, die sich im Rahmen einer immunologischen Aktivierung zu Immunglobulin-produzierenden Plasmazellen differenzieren. Von besonderer Bedeutung ist hierbei IgA, dessen Transportweg durch die polare Epithelzelle mit Hilfe des sogenannten polymeren Immunglobulinrezeptors (pIgR) bisher auch am besten untersucht ist. Der pIgR bindet

IgA an der basolateralen Oberfläche der Epithelzelle und wird dann durch Endozytose in das Innere der Zelle aufgenommen. Hier zunächst im Endosom zu finden, wird er nun in Vesikel sortiert, die an die apikale Zelloberfläche wandern. Dort angekommen, fusioniert das Transportvesikel mit der Zellmembran (Exozytose), es erfolgt ein proteolytischer Abbau des pIgRs und sein großes extrazelluläres Fragment, auch sekretorische Komponente genannt, wird zusammen mit dem gebundenen Immunglobulin nach außen abgegeben. Den gesamten Vorgang bezeichnet man als Transzytose (Mostov, 1994). Das sekretorische Immunglobulin ist widerstandsfähig gegenüber proteolytischem Abbau und weist daher eine lange Wirksamkeit auf.

Es verhindert die Bindung von Bakterien an die Schleimhaut, agglutiniert Bakterien und neutralisiert Viren und Toxine (Janeway et al., 1997).

Die direkt über dem lymphatischen Gewebe gelegenen Epithelzellen des Dünndarms sind spezialisiert und werden als M-Zellen (membraneous cells) bezeichnet. Sie können abgeflacht sein und tragen kürzere, dickere und weniger dicht stehende Mikrovilli. Als charakteristisches Merkmal der M-Zellen ist ihre basale Plasmamembran in Form einer tiefen Tasche eingestülpt. In der Membran finden sich Adhäsionsmoleküle, welche mit den häufig in denTaschen befindlichen T- Lymphozyten und auch mit Ausläufern von Makrophagen wechselwirken. M-Zellen „sammeln“

mittels clathrin-vermittelter Endocytose, Makro- und Mikropinozytose oder Phagozytose kontinuierlich Antigene aus dem intestinalen Lumen. Sie transportieren sie zunächst über den endosomalen Weg weiter, dann aber nicht zu den Lysosomen, sondern im sogenannten transzytotischen Transport direkt zur basolateralen Oberfläche und geben sie dort in die taschenförmige Einstülpung ab (Übersicht bei Neutra et al., 2001).

Abbildung 2.11

Schematische Darstellung einer M-Zelle, flankiert von zwei Enterozyten.

In dem taschenförmigen Raum, den die Einstülpung der M-Zelle bildet, befindet sich ein Lymphozyt.

Die vorherrschende Antwort auf oral zugeführte nicht invasive Antigene ist die immunologische Toleranz. Das Immunsystem des Darms kann aber, bedingt durch zeitgleich ablaufende Entzündungen oder eine zufällige Kopplung an ein immunstimulierendes Antigen eine sowohl regionale als auch systemische Antwort auf fremde Antigene einleiten. Einige wichtige klinischen

Literaturübersicht 20

Störungen / Krankheiten wie z.B. Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa sind gekennzeichnet durch anhaltende entzündliche Reaktionen der intestinalen Mukosa (Übersicht bei Strobel et al.,1998).

2.5.4 Dünndarmepithelzellen als immunologisch aktive Zellen

Die intestinalen epithelialen Zellen (IECs, intestinal epithelial cells) haben direkten Kontakt zu T- Zellen innerhalb der Epithelzellschicht, den sogenannten intra-epithelialen Lymphozyten (IELs) wie auch zu T-Zellen in der tieferliegenden lamina propria (LPLs, Lamina propria Lymphozyten).

Abbildung 2.12

Kontakt von Enterozyten zu Lymphozyten der Mukosa des Dünndarms

LPL = Lamina propria Lymphozyten; IEL = intra-epitheliale Lymphozyten; TJ = tight junction Der Pfeil bezeichnet eine Pore in der Basalmembran, durch die die Enterozyten mittels sogenannter „basolateraler Projektionen“ mit den Lymphozyten der Mukosa in Kontakt treten. aus: Hershberg et al., 2000

Könnten intestinale epitheliale Zellen in diesem Zusammenhang als antigenpräsentierende Zellen fungieren und die jeweiligen Antworten der T-Zellen regulieren?

Ein wichtiges Kriterium für antigenpräsentierende Zellen ist ihre Fähigkeit, MHC Klasse II zu exprimieren. Die Expression von MHC Klasse II Molekülen auf Dünndarmenterozyten wurde zum ersten Mal 1978 beim Meerschweinchen nachgewiesen (Wiman et al., 1978); dann in rascher Folge ebenfalls bei Maus (Kirby und Parr, 1979; Curman et al., 1979), Ratte (Mason et al., 1981) und dem Menschen (Scott et al., 1980). Sie scheint an der basolateralen Membran des Enterozyten lokalisiert zu sein sowie in Assoziation mit endosomalen Organellen, vermutlich multivesikulären Körperchen (Bland et al., 1986; Mayrhofer et al., 1989; Gonnella et al., 1993).

Eine geringe Expression ist konstitutiv vorhanden, durch Simulation entzündlicher Bedingungen wie z.B. durch die Gabe von γ-Interferon kann sie gesteigert werden (Mayer et al., 1991).

Die Expression des MHC II Beladungskofaktors invariante Kette in Dünndarmenterozyten wurde bisher lediglich auf mRNA-Ebene im Northern Blot nachgewiesen. Quantitative Immunfluoreszenzmessungen ergaben keine Hinweise auf eine Expression auf Proteinniveau (Vidal et al., 1993).

Es konnte aber gezeigt werden, dass Enterozyten der Maus in der Lage sind, lösliche Antigene T- Zell-Hybridomazellen zu präsentieren, welche daraufhin Interleukin 2 produzieren (Kaiserlian et al., 1989). Diese Ergebnisse legten eine besondere Rolle von Dünndarmepithelzellen bei der Präsentation von Antigenen nahe und stellten den Ausgangspunkt für diese Arbeit dar.

Materialien und Methoden 22

3 Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Chemikalien

Chemikalie Hersteller

Acrylamid Bio-Rad, München, BRD

Ammoniumperoxydisulfat (APS) Bio-Rad, München, BRD

Bisacrylamid Bio-Rad, München, BRD

Bleinitrat Merck, Darmstadt, BRD

Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma, Taufkirchen, BRD

Bromphenolblau Sigma, Taufkirchen, BRD

Complete Mini Proteaseinhibitor Roche, Mannheim, BRD

D-Glukose Sigma, Taufkirchen, BRD

Dimethylarsinsäure Natriumsalz-Trihydrat Merck, Darmstadt, BRD ECL-Reagenz Renaissance Westernblot Chemoluminescence

Reagent Plus

NEN Research Products, Boston, USA

EDTA Sigma, Taufkirchen, BRD

Ethanol absolut 99,9% Merck, Darmstadt, BRD

fetales Kälberserum (FKS) SERO-med, Wien, Österreich

Ficoll Pharmacia GmbH, Freiburg, BRD

Glutaraldehyd 25% Polysciences, Warrington, USA

Glycerin Sigma, Taufkirchen, BRD

Glycidether Serva, Heidelberg, BRD

Hank`s buffered saline solution (HBSS) 10x Gibco, Karlsruhe, BRD

HEPES Lösung 1M Sigma, Taufkirchen, BRD

Hoechst 33258 Molecular Probes, Eugene, USA

Leupeptin Sigma, Taufkirchen, BRD

Magermilchpulver Uelzena, Uelzen, BRD

Magnesiumchlorid Sigma, Taufkirchen, BRD

Methanol Merck, Darmstadt, BRD

Methylnadic Anhydrid (MNA) Serva, Heidelberg, BRD

Chemikalie Hersteller

Natriumazid Merck, Darmstadt, BRD

Natriumcitrat Sigma, Taufkirchen, BRD

Natriumdodecylsulfat (SDS) Bio-Rad, München, BRD

Natriumphosphat Sigma, Taufkirchen, BRD

Natriumpyruvat Lösung 100mM Gibco, Karlsruhe, BRD

Natrium-Tetraborat Merck, Darmstadt, BRD

NHSS-LC-Biotin Pierce, Rockford, USA

Nonidet P 40 Fluka, Buchs, Schweiz

Osmiumtetroxid Polysciences, Warrington, USA

Paraformaldehyd Fluka, Taufkirchen, BRD

Penicillin/Streptomycin-Mix (PenStrep) 10000 units/ml Gibco, Karlsruhe, BRD

Pepstatin Sigma, Taufkirchen, BRD

PMSF Sigma, Taufkirchen, BRD

Ponceau S Chroma Gesellschaft, Stuttgart,

BRD

Prolong Antifade Kit Molecular Probes, Eugene, USA TEMED (Tetramethylethylendiamin) Bio-Rad, München, BRD

Toluidinblau Merck, Darmstadt, BRD

Tris (Tris(hydroxymethyl)-aminoethan) Sigma, Taufkirchen, BRD Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyetoxyethanol) Sigma, Taufkirchen, BRD

Trypanblau Sigma, Taufkirchen, BRD

Trypsin-EDTA Gibco, Karlsruhe, BRD

Tween 20 (Polyoxyethylensorbitenmonolaurat) Sigma, Taufkirchen, BRD

Uranylacetat Merck, Darmstadt, BRD

Zellkulturmedium RPMI 1640 Gibco, Karlsruhe, BRD

β-Mercaptoethanol Sigma, Taufkirchen, BRD

2-Dodecenylsuccinic acid anhydride (DDSA) Serva, Heidelberg, BRD 2,4,6 Tris (dimethyl-aminomethyl) phenol (DMP 30) Serva, Heidelberg, BRD

Die Säuren wurden von Riedel-de Haen bezogen.

Materialien und Methoden 24

3.1.2 Lösungen, Puffer und Medien

Zur Herstellung aller Lösungen wurde Wasser aus der Reinstwasseranlage (Milli-Q, Millipore) verwendet.

Puffer / Lösung Zusammensetzung

Acrylamidlösung für Trenngel 30 % Acrylamid 0,8 % Bisacrylamid

über eine 0,2 µm Membran filtriert Acrylamidlösung für Sammelgel 30 % Acrylamid

1,6 % Bisacrylamid

über eine 0,2 µm Membran filtriert

Biotinylierungsreagenz 5 mg/ml NHSS-LC-Biotin in Na/PO4-Puffer Bleicitratlösung (Reynolds, 1965) 1,33 g Bleinitrat

1,76 g Natriumcitrat 50 ml H2O

8 ml 1N NaOH

Blockierlösung 10 % Magermilchpulver

0,1 % Tween in PBS gelöst

BSA-Waschpuffer für Immunpräzipitation 0,5 M Tris/HCl, pH = 7,4 1 % Triton X-100

1 % BSA

0,02 % NaN3

Denaturierungspuffer 10x 5% SDS

10% β-Mercaptoethanol in H2O

EDTA-Waschpuffer für Immunpräzipitation 0,5M Tris/HCl, pH = 7,4 1 % Triton X-100 1 mM EDTA

0,02 % NaN3

Puffer / Lösung Zusammensetzung

Epoxidharz 291,9 g Glycidether

165,8 g MNA 126,6 g DDSA mischen

kurz vor Gebrauch zu 50mg des Gemisches 0,75 ml DMP 30 hinzufügen

HBSS 1x HBSS 10x 1:10 in H2Odd

Isolationspuffer für Dünndarmepithelzellen NaCl 120 mM Tris 20 mM K2HPO4 3 mM MgCl2 1 mM CaCl2 1 mM Glucose 10 mM BSA 10 % 1 mg/ml PenStrep 0,5 % in Reinstwasser

pH-Wert auf 7,4 einstellen sterilfiltrieren

Lysepuffer TBST

Complete Mini Proteaseinhibitor 1 Tablette / 10 ml TBST

Natrium-Cacodylat-HCl-Puffer 0,2M Dimethylarsinsäure Natriumsalz-Trihydrat in H2O

pH mit HCl auf 7,3 titriert Na/PO4-Puffer 0,1 M Na2HPO4 x H2O

pH = 7,2

Osmiumtetroxidlösung 4% 4% Osmiumtetroxid in H2O

PBN 1 % BSA

in PBS

PBS 137 mM NaCl

2,7 mM KCl 1,9 mM KH2PO4

8,2 mM Na2HPO4 x H2O pH = 7,2

Materialien und Methoden 26

Puffer / Lösung Zusammensetzung

PBS-Tween 0,1 % Tween 20

in PBS

Ponceau S Färbelösung 2,5 g Ponceau S 400 ml Methanol 150 ml Essigsäure

Puffer G7 10x 0,5 M Na2HPO4

in H2O pH = 7,5

Sammelgellösung 125 mM Tris, pH 6,8

3 % Acrylamidlösung für Sammelgel 0,1 % SDS

in H2O

TBST 150 mM NaCl

50 mM Tris 1 % Triton X-100 0,02 % Natriumazid pH = 7,2

Toluidinblaulösung 1% Toluidinblau

1% Natrium-Tetraborat in H2O

Transferpuffer 48 mM Tris

39 mM Glycin 0,037 % SDS 20 % Methanol

Trenngellösung 375 mM Tris, pH 8,8

11 bzw. 15 % Acrylamidlösung für Trenngel 0,1 % SDS

in H2O vierfach Probenpuffer

(reduzierend)

1 mM EDTA (20 % β-Mercaptoethanol) 10 % SDS 40 % Glycerin

1 M Tris

pH 6,8 angefärbt mit Bromphenolblau

Puffer / Lösung Zusammensetzung Gebrauchsfertiges Medium Zusammensetzung

R10F 500 ml RPMI 1640

50 ml FKS (hitzeinaktiviert) 5 ml Natrium-Pyruvat Lösung 5 ml HEPES Lösung

5 ml Pen-Strep

500 µl β-Mercaptoethanol

3.1.3 Molekulargewichtsstandards

Standard Zusammensetzung

BioRad Prestained Standards Low Range Phosphorylase b (101 kDa) BSA (79 kDa)

Ovalbumin (50,1 kDa) Carbanhydrase (34,7 kDa)

Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (28,4 kDa) Lysozym (20,8 kDa)

Sigma S6H β-Galaktosidase (116 kDa)

Phosphorylase b (97 kDA) BSA (66 kDa)

Ovalbumin (45 kDa) Carbanhydrase (29 kDa)

Materialien und Methoden 28

3.1.4 Antikörper

Sämtliche Antikörper wurden in einer Lösung von 1% BSA in PBS-Tween verdünnt.

3.1.4.1 Primärantikörper

Antikörper Spezies Antigen Bezugsquelle / Referenz α 2 Kaninchen MHC II; A^K; α-Kette Robert Lindner

Η 116−32 Maus MHC II; A^K; α-Kette Landais et al., 1986 Η150−13 Maus MHC II; A^K; α-Kette Landais et al., 1986 Κ22−203 Maus MHC II; A^K; β-Kette Landais et al., 1986 mab 10.2.16 Maus MHC II; A^K; β-Kette Oi et al., 1978 mab 40F Maus MHC II; A^K; β-Kette Pierres et al., 1989 mab 10.3.6.2- FITC Maus MHC II; A^K; β-Kette Oi et al., 1978 mab In-I Ratte cytosolischer Schwanz der

invarianten Kette

Koch et al., 1982

1B9A Ratte H2-M; β-Kette Lars Karlsson

mab ID4B Ratte lamp I Developmental Studies Hybridoma

Bank, Iowa City, USA

mab gegen CD11c Hamster CD11c Pharmingen/Becton-Dickinson, Heidelberg, BRD

mab gegen B220 Ratte CD 45 Pharmingen/Becton-Dickinson, Heidelberg, BRD

mab 53-6.7 Ratte CD 8 Pharmingen/Becton-Dickinson,

Heidelberg, BRD

3.1.4.2 Sekundärantikörper

Antikörper Bezugsquelle / Referenz

Alexa 488-konjugiertes IgG gegen Maus Molecular Probes, Eugene, USA Alexa 546-konjugiertes IgG gegen Ratte Molecular Probes, Eugene, USA HRP-konjugiertes IgG gegen Maus Cappel/ICN, Eschwege, BRD HRP-konjugiertes IgG gegen Ratte Dako, Hamburg, BRD

HRP-konjugiertes Neutravidin Pierce, Rockford, USA

HRP-konjugiertes Streptavidin Molecular Probes, Eugene, USA Rhodamin-konjugiertes Ig gegen Maus Dianova, Hamburg, BRD

3.1.4.3 Brückenantikörper

Antikörper Bezugsquelle / Referenz

MAR ; Maus anti Ratte Ig κ−Kette Lanier et al, 1982

3.1.5 Zelllinien

Bei der verwendeten Zelllinie C3F6 handelt es sich um eine B-Lymphomazelllinie der Maus.

Materialien und Methoden 30

3.2 Methoden

3.2.1 Zellbiologische Methoden

3.2.1.1 Isolation von Dünndarmepithelzellen

Die Dünndarmepithelzellen, welche in dieser Arbeit verwendet werden sollten, wurden aus dem Darm erwachsener, männlicher Mäuse des Stammes C3H/HeN gewonnen. Es handelte sich hierbei um etwa sechs bis zehn Wochen alte Tiere, die unter SPF- (spezifisch pathogen-frei) Bedingungen aufgezogen wurden. Zur Gewinnung der Dünndarmenterozyten wurde eine von Kaiserlian und Mitarbeitern entwickelte Methode zur Isolation von Dünndarmepithelzellen (Kaiserlian et al., 1989), wie unter 4.1 dargestellt, modifiziert:

Die Maus wurde durch zervikale Dislokation getötet, auf den Rücken gelegt und das Fell an der Bauchseite mit 70% Ethanol desinfiziert. Anschließend wurde die Bauchhaut durchtrennt und zu den Seiten geklappt, so dass der Blick auf die Muskulatur des Unterbauches fiel. Diese wurde mit 70% Ethanol desinfiziert, bevor im Anschluss die Bauchhöhle geöffnet wurde. Das Duodenum wurde hinter dem Magenausgang abgetrennt und der Dünndarm wurde einschließlich des Ileums entnommen. Mit Hilfe einer 20ml-Spritze mit aufgesetzter Pipettenspitze wurde das Innere des entnommenen Darmabschnitts mit etwa 40ml 0°C kaltem Isolationspuffer gespült, um Darminhalt zu entfernen. Anschließend wurde der Darmabschnitt unter ständiger Zuleitung von Luftsauerstoff in auf 37°C erwärmtem Isolationspuffer inkubiert, womit fortlaufende Kontraktionen der Muskulatur des Darms ausgelöst wurden. Nach 15minütiger Inkubation wurde der Darm wieder aus der Pufferlösung herausgenommen. Nun erfolgte ein Ausstreifen der Dünndarmepithelzellen durch wiederholtes Aufziehen des Darmabschnitts auf eine Glasspirale (Durchmesser 3mm). Die sich nach und nach lösenden Zellverbände wurden in 80ml warmem Isolationspuffer aufgefangen und suspendiert. Diese Zellsuspension wurde dann einem Vibrationsschritt unterzogen, wobei für 10min bei 60Hz eine an einen Vibromixer (Chemap AG, Schweiz) angeschlossene Glasspirale in die Suspension getaucht wurde. Hierbei konnten die relativ großen Zellverbände weiter verkleinert werden bis zur teilweisen Vereinzelung der Zellen. Im Anschluss erfolgte eine sogenannte differentielle Zentrifugation. die Zellen wurden dreimal bei 900 rpm für 1min zentrifugiert (Variofuge 3.0 R, Heraeus), der Überstand abgenommen und die sedimentierten Zellen erneut resuspendiert.

Durch diese Zentrifugationsschritte wurde erreicht, dass die schweren Epithelzellen bzw.

Epithelzellverbände sedimentierten, während die leichteren übrigen Zellen, wie zum Beispiel Lymphozyten und dendritische Zellen, im Überstand blieben und abgenommen werden konnten.

Die so gewonnenen Darmepithelzellen wurden direkt für Experimente eingesetzt und nicht weiterkultiviert.

3.2.1.2 Isolation von Dünndarmepithelzellen nach D. Kaiserlian

Die Maus wurde durch zervikale Dislokation getötet, auf den Rücken gelegt und das Fell an der Bauchseite mit 70% Ethanol desinfiziert. Nach Durchtrennung der Bauchhaut und Desinfektion der Muskulatur des Unterbauches wurde die Bauchhöhle geöffnet. Ein 12-15 cm langer Abschnitt von Duodenum und Jejunum wurde entnommen und mit 40 ml eiskaltem Isolationspuffer gespült.

Anschließend erfolgte eine Inkubation für 20 min bei 37°C in demselben Puffer. Im Anschluss wurde der entnommene Darmabschnitt unter Umkehren der Innenseite nach außen auf eine Glasspirale (Durchmesser 3mm) gestülpt und die Glasspirale an einen Vibro-Mixer angeschlossen.

Der Darm wurde dann in 120 ml auf 37°C erwärmten Isolationspuffer getaucht und ein Vibrationsschritt für 10 min bei 60 Hertz angeschlossen. Die gewonnenen Zellen wurden einer differentielle Zentrifugation unterworfen, indem sie zweimal bei 200 x g für 1min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die sedimentierten Zellen erneut resuspendiert wurden. So konnten kontaminierende Zellen von den schwereren, sedimentierenden Epithelzellverbänden abgetrennt werden. Um die Zellen zu vereinzeln, wurden sie anschließend durch eine 18,5 gauge Kanüle gezogen, gefolgt von einer 25 gauge Kanüle. Sollten hierbei Zellen zerstört werden, war damit zu rechnen, dass DNA freigesetzt werden würde. Zum Abschluss des Isolationsverfahrens erfolgte eine Behandlung der Zellen mit DNAse I, um durch zerstörte Zellen eventuell freigesetzte DNA zu beseitigen (Kaiserlian et al., 1989).

3.2.1.3 Isolation von dendritischen Zellen

Die dendritischen Zellen wurden aus dem Knochenmark etwa sechs Wochen alter männlicher Mäuse des Stammes C3H/HeN gewonnen. Die Tiere sind unter SPF- (spezifisch pathogen-frei) Bedingungen aufgezogen worden. Die Maus wurde durch zervikale Dislokation getötet. Die Hinterbeine der Tiere wurden abgetrennt, der Oberschenkelknochen so sauber wie möglich von umgebendem Gewebe befreit und kurz mit 70% Ethanol gespült. Danach wurden die Knochen mit R10F gewaschen und die Enden abgetrennt. Nach Überführung in frisches R10F wurde das Stammzellen enthaltende Knochenmark mit R10F aus dem Inneren des Knochens herausgespült.

Die Stammzellen wurden vorsichtig resuspendiert, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und zweimal durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 4min (Variofuge 3.0 R, Heraeus) in R10F gewaschen. Die Zellen wurden gezählt und in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml in R10F kultiviert. Dem Medium wurden 10% Kulturüberstand von GM-CSF-transfizierten X63-Zellen zugesetzt. Das Kulturmedium wurde alle zwei Tage durch frisches ersetzt und die Zellen nach 6 Tagen geerntet.

Materialien und Methoden 32

3.2.1.2 Isolation von Lymphozyten aus der Milz

Wie unter 3.2.1.1 beschrieben, wurde die Maus getötet und die Bauchhöhle geöffnet. Die Milz wurde von dem umgebenden Gewebe abgetrennt und in einen „cell strainer“ (Becton-Dickinson) überführt. Die Lymphozyten wurden freigesetzt, indem die Milz mit dem Stempel einer 10ml Spritze durch den „cell strainer“ gedrückt wurde. Die Zellen wurden aufgefangen, bei 1500rpm für 4min (Variofuge 3.0 R, Heraeus) abzentrifugiert und das Sediment anschließend in 3ml PBS resuspendiert. In ein 15ml Reaktionsgefäß wurden 5ml sterile Ficolllösung gegeben und diese Lösung dann mit den 3ml Zellsuspension überschichtet. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 3000 rpm für 15min ohne Bremse (Variofuge 3.0 R, Heraeus). Erythrozyten, Granulozyten, Makrophagen und Bindegewebsstücke sedimentierten hierbei durch die Ficollschicht. Die Lymphozyten sammelten sich in der Interphase an, welche im Anschluss abgezogen, verdünnt und einmal durch Zentrifugation bei 4°C für 5min bei 1100 rpm in PBS gewaschen wurde. Das Sediment wurde in Zellkulturmedium resuspendiert. In eine 10 cm Zellkulturschale wurden 10 ml 10 % FKS enthaltendes RPMI vorgelegt und dann die Lymphozytensuspension in diesem Medium kultiviert. Es erfolgte eine Induktion mit Hilfe von 40µg/ml LPS über einen Zeitraum von 48 Stunden, bevor die Zellen geerntet wurden.

3.2.1.3 Kultivierung von Zellen

Die semi-adhärent wachsende Maus B-Lymphomazelllinie C3F6 wurde in dem Medium R10F im Brutschrank (Hera Cell, Heraeus) bei 37°C und einem CO2-Gehalt von 5% kultiviert (Zellkulturschalen: Nunclon Surface, Nalge Nunc). Sie wurden regelmäßig alle zwei Tage passagiert. Hierzu wurden die Zellen mit ihrem Kulturmedium von der Bodenfläche der Zellkulturschale abgespült, im Verhältnis 1:7,5 mit frischem Medium versetzt und in eine neue Zellkulturschale ausgesät.

3.2.1.4 Ernte und Zählen der Zellen

Der erste Schritt in der Bearbeitung der kultivierten B-Lymphomazellen bestand in der Ernte der Zellen. Hierzu wurden sie mit dem Medium, in dem sie kultiviert wurden, von der Bodenfläche der Zellkulturschale abgespült. Die entstandene Zellsuspension wurde in ein 50ml-Falcon Röhrchen überführt. Alle nun folgenden Schritte wurden auf Eis bei 0°C bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal in HBSS gewaschen, indem sie bei 1200rpm für 4min zentrifugiert (Variofuge 3.0 R, Heraeus), der Überstand verworfen und das Zellsediment erneut in HBSS aufgenommen wurde. Zur Bestimmung der gewonnenen Zellzahl wurden die Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (VWR) gezählt. Bei der Vorbereitung der Kammer wurde zum Erreichen einer optimalen Kammerhöhe ein Deckglas angefeuchtet und so auf die Kammerstege aufgeschoben, dass Newtonsche Ringe sichtbar wurden und auch bei Nachlassen des

Fingerdrucks bestehen blieben. Die zu untersuchende Zellsuspension wurde 1:1 mit Trypanblau verdünnt und mittels Pipette in den Raum zwischen Zählkammerboden und Deckglas gefüllt.

Gezählt wurden die Zellen unter Verwendung eines binokularen Phasenkontrastmikroskops bei 100-facher Vergrößerung. Es erscheint ein großes Quadrat, welches in 4 kleinere, sogenannte B- Felder unterteilt ist. Der Raum eines B-Feldes entspricht dem Volumen von 0,1µl. Zwei dieser Felder wurden ausgezählt und der Mittelwert bestimmt. Aus diesem Wert wurde jeweils unter Berücksichtigung des Ausgangsvolumens der Zellsuspension die Zellzahl pro ml berechnet.

3.2.1.5 Lyse von Zellen

Um eine biochemische Analyse von Zellproteinen zu ermöglichen, mussten die Zellen zunächst lysiert werden. Die hierfür verwendete Menge an Lysepuffer richtete sich nach der Anzahl der zu lysierenden Zellen. Die kultivierten B-Lymphomazellen wurden zunächst wie unter 3.2.1.4 beschrieben gezählt und dann mit Lysepuffer auf eine Zahl von 2 x 10⁴ Zellen pro µl eingestellt.

Ein Zählen der gewonnenen Dünndarmepithelzellen erwies sich als nicht möglich, da diese in der Regel zu Zellverbänden zusammengeschlossen waren. Hier wurde die ungefähre Dichte der Zellen visuell abgeschätzt und wie bei den kultivierten Zellen mit dem eingesetzten Lysepuffer eine Zellzahl von 2 x 10⁴ Zellen pro µl angestrebt. Durch eine Proteinbestimmung im Lysat wurde eine Vergleichbarkeit der Proben über die Proteinkonzentration hergestellt.

Die Lyse der Zellen selbst erfolgte für mindestens eine Stunde auf Eis in Lysepuffer. Anschließend wurden durch Zentrifugation bei 16400rpm für 10min (5417R, Eppendorf) die nicht gelösten Zellbestandteile sowie die Zellkerne abgetrennt. Durch eine hierauf folgende Ultrazentrifugation (Optima TL Ultrazentrifuge, Beckman; Rotor TLA 45) des Überstandes bei 40000 rpm wurden alle restlichen nicht lysierten Bestandteile der Zellen sowie Proteinaggregate abgetrennt. Die Dauer der Zentrifugation wurde dabei der Menge des Lysats angepaßt. Für 800µl wurde eine Zeit von 45min eingestellt. Der Überstand nach der Ultrazentrifugation stellt nun das reine Zelllysat dar.

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3.2.2 Biochemische Methoden

3.2.2.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Nach Aufschluss der Zellen wurde zur Analyse der Zellproteine die diskontinuierliche SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Lämmli (Lämmli, 1970) durchgeführt. Hierbei wird zwischen einem großporigen Sammelgel, das nach Auftrag der Proben zuerst durchlaufen wird, und dem kleinporigen Trenngel unterschieden. In dieser Arbeit wurden Minigele mit einer Konzentration von 11% bzw. 15% Acrylamid im Trenngel verwendet. Das Gießen erfolgte in einer Hoefer „Mighty Small“ Gelgießkammer für 5 Gele. Der Trenn- bzw. Sammelgelllösung wurden vor dem Gießen 0,1% APS und 0,1% Temed zugefügt, um die Polymerisationsreaktion zu initiieren.

Zur Vorbereitung der Proben wurde dem gewonnenen Zelllysat im Verhältnis 1:4 vierfach konzentrierter SDS-Probenpuffer ( Lämmli, 1970) zugesetzt, wobei man je nach Zielsetzung des jeweiligen Experiments nicht reduzierenden oder reduzierenden Probenpuffer einsetzen konnte.

Reduzierender Probenpuffer enthält zusätzlich β-Mercaptoethanol, welches in der Lage ist, Disulfidbrücken zu spalten. Nach Zusatz des Probenpuffers wurden die Proben kurz bei Raumtemperatur inkubiert oder bei 95°C für 3-5min aufgekocht.

In die Taschen des Sammelgels wurden in der Regel 10µl einer Probe aufgetragen. Eine Tasche des Gels wurde mit einem Molekulargewichtsstandard befüllt. Die Auftrennung der Proteine erfolgte unter Wasserkühlung in einer mit Laufpuffer gefüllten Elektrophoresekammer (Mighty Small II, SE 250, Hoefer). Zu Beginn wurde eine Spannung von 80V angelegt, bis die Proben das Trenngel erreicht haben und anschließend eine Spannung von 200V, bis die Proben das Trenngel durchlaufen haben.

3.2.2.2 Westernblot

Zur Westernblot-Analyse wurden die aufgetrennten Proteine mittels Elektrotransfer auf Nitrozellulosemembran übertragen. In dieser Arbeit wurde dazu die „semi-dry“-Technik angewendet. Hierbei wurden 5 in Transferpuffer getränkte Whatman Papierstreifen in eine Elektrotransferapparatur für „halbtrockene“ Westernblots („semi-dry“ Elektrotransferkammer, Forschungswerkstätten Medizinische Hochschule Hannover) geschichtet. Darauf folgten die mit Reinstwasser befeuchtete Nitrozellulosemembran und das Gel aus der vorangegangenen SDS- PAGE. Abschließend wurden auf das Gel 5 in Transferpuffer getränkte Whatman Papierstreifen geschichtet. Für 45min wurde eine Spannung von 10V angelegt. Die negativ geladenen SDS- Proteinkomplexe konnten so in dem aufgebauten elektrischen Feld aus dem Gel auf die Nitrozellulosemembran wandern und wurden hier fest gebunden.

Die Qualität des Transfers wurde durch kurze Färbung mit Ponceau S überprüft. Die einzelnen Proteinbanden konnten durch Spülen mit Reinstwasser sichtbar gemacht werden. Die Banden des