Zellbiologische Methoden

3.2.1.1 Isolation von Dünndarmepithelzellen

Die Dünndarmepithelzellen, welche in dieser Arbeit verwendet werden sollten, wurden aus dem Darm erwachsener, männlicher Mäuse des Stammes C3H/HeN gewonnen. Es handelte sich hierbei um etwa sechs bis zehn Wochen alte Tiere, die unter SPF- (spezifisch pathogen-frei) Bedingungen aufgezogen wurden. Zur Gewinnung der Dünndarmenterozyten wurde eine von Kaiserlian und Mitarbeitern entwickelte Methode zur Isolation von Dünndarmepithelzellen (Kaiserlian et al., 1989), wie unter 4.1 dargestellt, modifiziert:

Die Maus wurde durch zervikale Dislokation getötet, auf den Rücken gelegt und das Fell an der Bauchseite mit 70% Ethanol desinfiziert. Anschließend wurde die Bauchhaut durchtrennt und zu den Seiten geklappt, so dass der Blick auf die Muskulatur des Unterbauches fiel. Diese wurde mit 70% Ethanol desinfiziert, bevor im Anschluss die Bauchhöhle geöffnet wurde. Das Duodenum wurde hinter dem Magenausgang abgetrennt und der Dünndarm wurde einschließlich des Ileums entnommen. Mit Hilfe einer 20ml-Spritze mit aufgesetzter Pipettenspitze wurde das Innere des entnommenen Darmabschnitts mit etwa 40ml 0°C kaltem Isolationspuffer gespült, um Darminhalt zu entfernen. Anschließend wurde der Darmabschnitt unter ständiger Zuleitung von Luftsauerstoff in auf 37°C erwärmtem Isolationspuffer inkubiert, womit fortlaufende Kontraktionen der Muskulatur des Darms ausgelöst wurden. Nach 15minütiger Inkubation wurde der Darm wieder aus der Pufferlösung herausgenommen. Nun erfolgte ein Ausstreifen der Dünndarmepithelzellen durch wiederholtes Aufziehen des Darmabschnitts auf eine Glasspirale (Durchmesser 3mm). Die sich nach und nach lösenden Zellverbände wurden in 80ml warmem Isolationspuffer aufgefangen und suspendiert. Diese Zellsuspension wurde dann einem Vibrationsschritt unterzogen, wobei für 10min bei 60Hz eine an einen Vibromixer (Chemap AG, Schweiz) angeschlossene Glasspirale in die Suspension getaucht wurde. Hierbei konnten die relativ großen Zellverbände weiter verkleinert werden bis zur teilweisen Vereinzelung der Zellen. Im Anschluss erfolgte eine sogenannte differentielle Zentrifugation. die Zellen wurden dreimal bei 900 rpm für 1min zentrifugiert (Variofuge 3.0 R, Heraeus), der Überstand abgenommen und die sedimentierten Zellen erneut resuspendiert.

Durch diese Zentrifugationsschritte wurde erreicht, dass die schweren Epithelzellen bzw.

Epithelzellverbände sedimentierten, während die leichteren übrigen Zellen, wie zum Beispiel Lymphozyten und dendritische Zellen, im Überstand blieben und abgenommen werden konnten.

Die so gewonnenen Darmepithelzellen wurden direkt für Experimente eingesetzt und nicht weiterkultiviert.

3.2.1.2 Isolation von Dünndarmepithelzellen nach D. Kaiserlian

Die Maus wurde durch zervikale Dislokation getötet, auf den Rücken gelegt und das Fell an der Bauchseite mit 70% Ethanol desinfiziert. Nach Durchtrennung der Bauchhaut und Desinfektion der Muskulatur des Unterbauches wurde die Bauchhöhle geöffnet. Ein 12-15 cm langer Abschnitt von Duodenum und Jejunum wurde entnommen und mit 40 ml eiskaltem Isolationspuffer gespült.

Anschließend erfolgte eine Inkubation für 20 min bei 37°C in demselben Puffer. Im Anschluss wurde der entnommene Darmabschnitt unter Umkehren der Innenseite nach außen auf eine Glasspirale (Durchmesser 3mm) gestülpt und die Glasspirale an einen Vibro-Mixer angeschlossen.

Der Darm wurde dann in 120 ml auf 37°C erwärmten Isolationspuffer getaucht und ein Vibrationsschritt für 10 min bei 60 Hertz angeschlossen. Die gewonnenen Zellen wurden einer differentielle Zentrifugation unterworfen, indem sie zweimal bei 200 x g für 1min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die sedimentierten Zellen erneut resuspendiert wurden. So konnten kontaminierende Zellen von den schwereren, sedimentierenden Epithelzellverbänden abgetrennt werden. Um die Zellen zu vereinzeln, wurden sie anschließend durch eine 18,5 gauge Kanüle gezogen, gefolgt von einer 25 gauge Kanüle. Sollten hierbei Zellen zerstört werden, war damit zu rechnen, dass DNA freigesetzt werden würde. Zum Abschluss des Isolationsverfahrens erfolgte eine Behandlung der Zellen mit DNAse I, um durch zerstörte Zellen eventuell freigesetzte DNA zu beseitigen (Kaiserlian et al., 1989).

3.2.1.3 Isolation von dendritischen Zellen

Die dendritischen Zellen wurden aus dem Knochenmark etwa sechs Wochen alter männlicher Mäuse des Stammes C3H/HeN gewonnen. Die Tiere sind unter SPF- (spezifisch pathogen-frei) Bedingungen aufgezogen worden. Die Maus wurde durch zervikale Dislokation getötet. Die Hinterbeine der Tiere wurden abgetrennt, der Oberschenkelknochen so sauber wie möglich von umgebendem Gewebe befreit und kurz mit 70% Ethanol gespült. Danach wurden die Knochen mit R10F gewaschen und die Enden abgetrennt. Nach Überführung in frisches R10F wurde das Stammzellen enthaltende Knochenmark mit R10F aus dem Inneren des Knochens herausgespült.

Die Stammzellen wurden vorsichtig resuspendiert, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und zweimal durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 4min (Variofuge 3.0 R, Heraeus) in R10F gewaschen. Die Zellen wurden gezählt und in einer Konzentration von 2 x 10⁵ Zellen/ml in R10F kultiviert. Dem Medium wurden 10% Kulturüberstand von GM-CSF-transfizierten X63-Zellen zugesetzt. Das Kulturmedium wurde alle zwei Tage durch frisches ersetzt und die Zellen nach 6 Tagen geerntet.

Materialien und Methoden 32

3.2.1.2 Isolation von Lymphozyten aus der Milz

Wie unter 3.2.1.1 beschrieben, wurde die Maus getötet und die Bauchhöhle geöffnet. Die Milz wurde von dem umgebenden Gewebe abgetrennt und in einen „cell strainer“ (Becton-Dickinson) überführt. Die Lymphozyten wurden freigesetzt, indem die Milz mit dem Stempel einer 10ml Spritze durch den „cell strainer“ gedrückt wurde. Die Zellen wurden aufgefangen, bei 1500rpm für 4min (Variofuge 3.0 R, Heraeus) abzentrifugiert und das Sediment anschließend in 3ml PBS resuspendiert. In ein 15ml Reaktionsgefäß wurden 5ml sterile Ficolllösung gegeben und diese Lösung dann mit den 3ml Zellsuspension überschichtet. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 3000 rpm für 15min ohne Bremse (Variofuge 3.0 R, Heraeus). Erythrozyten, Granulozyten, Makrophagen und Bindegewebsstücke sedimentierten hierbei durch die Ficollschicht. Die Lymphozyten sammelten sich in der Interphase an, welche im Anschluss abgezogen, verdünnt und einmal durch Zentrifugation bei 4°C für 5min bei 1100 rpm in PBS gewaschen wurde. Das Sediment wurde in Zellkulturmedium resuspendiert. In eine 10 cm Zellkulturschale wurden 10 ml 10 % FKS enthaltendes RPMI vorgelegt und dann die Lymphozytensuspension in diesem Medium kultiviert. Es erfolgte eine Induktion mit Hilfe von 40µg/ml LPS über einen Zeitraum von 48 Stunden, bevor die Zellen geerntet wurden.

3.2.1.3 Kultivierung von Zellen

Die semi-adhärent wachsende Maus B-Lymphomazelllinie C3F6 wurde in dem Medium R10F im Brutschrank (Hera Cell, Heraeus) bei 37°C und einem CO2-Gehalt von 5% kultiviert (Zellkulturschalen: Nunclon Surface, Nalge Nunc). Sie wurden regelmäßig alle zwei Tage passagiert. Hierzu wurden die Zellen mit ihrem Kulturmedium von der Bodenfläche der Zellkulturschale abgespült, im Verhältnis 1:7,5 mit frischem Medium versetzt und in eine neue Zellkulturschale ausgesät.

3.2.1.4 Ernte und Zählen der Zellen

Der erste Schritt in der Bearbeitung der kultivierten B-Lymphomazellen bestand in der Ernte der Zellen. Hierzu wurden sie mit dem Medium, in dem sie kultiviert wurden, von der Bodenfläche der Zellkulturschale abgespült. Die entstandene Zellsuspension wurde in ein 50ml-Falcon Röhrchen überführt. Alle nun folgenden Schritte wurden auf Eis bei 0°C bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal in HBSS gewaschen, indem sie bei 1200rpm für 4min zentrifugiert (Variofuge 3.0 R, Heraeus), der Überstand verworfen und das Zellsediment erneut in HBSS aufgenommen wurde. Zur Bestimmung der gewonnenen Zellzahl wurden die Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (VWR) gezählt. Bei der Vorbereitung der Kammer wurde zum Erreichen einer optimalen Kammerhöhe ein Deckglas angefeuchtet und so auf die Kammerstege aufgeschoben, dass Newtonsche Ringe sichtbar wurden und auch bei Nachlassen des

Fingerdrucks bestehen blieben. Die zu untersuchende Zellsuspension wurde 1:1 mit Trypanblau verdünnt und mittels Pipette in den Raum zwischen Zählkammerboden und Deckglas gefüllt.

Gezählt wurden die Zellen unter Verwendung eines binokularen Phasenkontrastmikroskops bei 100-facher Vergrößerung. Es erscheint ein großes Quadrat, welches in 4 kleinere, sogenannte B-Felder unterteilt ist. Der Raum eines B-Feldes entspricht dem Volumen von 0,1µl. Zwei dieser Felder wurden ausgezählt und der Mittelwert bestimmt. Aus diesem Wert wurde jeweils unter Berücksichtigung des Ausgangsvolumens der Zellsuspension die Zellzahl pro ml berechnet.

3.2.1.5 Lyse von Zellen

Um eine biochemische Analyse von Zellproteinen zu ermöglichen, mussten die Zellen zunächst lysiert werden. Die hierfür verwendete Menge an Lysepuffer richtete sich nach der Anzahl der zu lysierenden Zellen. Die kultivierten B-Lymphomazellen wurden zunächst wie unter 3.2.1.4 beschrieben gezählt und dann mit Lysepuffer auf eine Zahl von 2 x 10⁴ Zellen pro µl eingestellt.

Ein Zählen der gewonnenen Dünndarmepithelzellen erwies sich als nicht möglich, da diese in der Regel zu Zellverbänden zusammengeschlossen waren. Hier wurde die ungefähre Dichte der Zellen visuell abgeschätzt und wie bei den kultivierten Zellen mit dem eingesetzten Lysepuffer eine Zellzahl von 2 x 10⁴ Zellen pro µl angestrebt. Durch eine Proteinbestimmung im Lysat wurde eine Vergleichbarkeit der Proben über die Proteinkonzentration hergestellt.

Die Lyse der Zellen selbst erfolgte für mindestens eine Stunde auf Eis in Lysepuffer. Anschließend wurden durch Zentrifugation bei 16400rpm für 10min (5417R, Eppendorf) die nicht gelösten Zellbestandteile sowie die Zellkerne abgetrennt. Durch eine hierauf folgende Ultrazentrifugation (Optima TL Ultrazentrifuge, Beckman; Rotor TLA 45) des Überstandes bei 40000 rpm wurden alle restlichen nicht lysierten Bestandteile der Zellen sowie Proteinaggregate abgetrennt. Die Dauer der Zentrifugation wurde dabei der Menge des Lysats angepaßt. Für 800µl wurde eine Zeit von 45min eingestellt. Der Überstand nach der Ultrazentrifugation stellt nun das reine Zelllysat dar.

Materialien und Methoden 34