4. Ergebnisse
4.1 Etablierung einer Methode zur Isolation von Dünndarmepithelzellen
4.1.3 Versuche zur Abschätzung der Reinheit der Epithelzellpräparation
Für die weitere Bearbeitung der isolierten Dünndarmepithelzellen war es von Bedeutung, nachzuweisen, dass keine Kontamination mit anderen Zelltypen aus dem Dünndarm vorlag. Sind professionelle antigenpräsentierende Zellen wie dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen in der Epithelzell-Präparation enthalten, so würde im gesamten Zelllysat die Expression der für APCs charakteristischen Moleküle nachweisbar sein. Eine Aussage über die Expression dieser Proteine in Dünndarmepithelzellen wäre dann aber nicht mehr möglich.
Ergebnisse 48
Um eine solche Kontamination ausschließen zu können, wurde zunächst mittels Western-Blot ein Vorhandensein von dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Lymphozyten überprüft.
Dünndarmepithelzellen wurden wie unter 3.2.1.6 beschrieben lysiert, die Proben für die SDS-PAGE vorbereitet und im Anschluss SDS-SDS-PAGE und Western-Blot durchgeführt. Für den Nachweis möglicherweise vorhandener kontaminierender Zellen wurden Antikörper eingesetzt, welche sich gegen für die jeweiligen Zellart spezifische Oberflächenproteine richteten. Dendritische Zellen wurden über das Oberflächenmolekül Cd11c detektiert, B-Lymphozyten über B220, Makrophagen über CD11b. Keine der drei genannten Zelltypen konnten mit dieser Methode nachgewiesen werden. Da Hinweise auf das Vorkommen dendritischer Zellen innerhalb der Epithelzellschicht des Dünndarms bei Ratten vorliegen (Maric et al., 1996), wurde die Epithelzell-Präparation zur Sicherheit mittels Immunfluoreszenz auf das Vorliegen einer Kontamination mit dendritischen Zellen untersucht. Hierfür wurde wiederum ein Primärantikörper verwendet, welcher gegen das zellartspezifische Oberflächenmolekül CD11c gerichtet ist. Es konnte nur eine einzige angefärbte Zelle auf mehrern tausend Dünndarmepithelzellen gefunden werden. Die Kontamination mit dendritischen Zellen lag also bei weniger als 0,1%.
Morphologisch war eine Kontamination der isolierten Epithelzellen mit lymphozyten-ähnlichen Zellen zu beobachten, welche etwa 1% der Einzelzellen ausmachte. Da T-Zellen physiologischerweise in die Epithelzellschicht des Dünndarms eingeschlossen zu finden sind und deshalb damit zu rechnen war, dass sie durch die differentielle Zentrifugation nicht restlos entfernt werden konnten, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung der Epithelzell-Präparation gegen CD 8 positive T-Lymphozyten durchgeführt. Ein großer Teil der morphologisch als Lymphozyten zu charakterisierenden Zellen wurde hierbei als cytotoxische T-Zellen identifiziert. Bei den restlichen Zellen mit Lymphozytenmorphologie könnte es sich entweder um T-Helferzellen (CD4+) oder um B-Lymphozyten handeln. Zur Differenzierung zwischen diesen beiden Zelltypen wurde eine Immunfluoreszenzfärbung gegen B-Lymphozyten durchgeführt. Der verwendete Antikörper richtete sich gegen das B-Zell-spezifische Oberflächenprotein B220. Mit diesem Antikörper konnten keine der morphologisch identifizierten Lymphozyten angefärbt werden, überraschenderweise allerdings Proteine im Bürstensaum der Enterozyten. Vermutlich handelte es sich um eine Kreuzreaktion, nähere Untersuchungen wurden nicht angeschlossen.
Da die nicht CD8 positiven T-Zellen offensichtlich nicht als B-Lymphozyten charakterisiert werden konnten, wurde davon ausgegangen, dass es sich um CD4 positive T-Lymphozyten handelte. Da diese nicht zu den antigenpräsentierenden Zellen gehören, hatte eine solche Kontamination im Rahmen dieser Arbeit keinen negativen Einfluss.
4.2 Biochemischer Nachweis von MHC Klasse II und seinen Beladungskofaktoren in Dünndarmepithel-zellen
4.2.1 Einführung
Wie in der Literaturübersicht beschrieben, exprimieren antigenpräsentierende Zellen MHC-Moleküle, um Antigene in Verbindung mit diesen auf ihrer Zelloberfläche präsentieren zu können.
Bei der Beladung der MHC Klasse II Komplexe mit Peptiden wirken verschiedene Beladungskofaktoren mit. Professionelle antigenpräsentierende Zellen exprimieren ständig MHC-Klasse II sowie auch die Beladungskofaktoren invariante Kette und HLA-DM. Bei nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen geschieht dies erst nach inflammatorischer Stimulation (Referenz). Um nun den Status der Dünndarmepithelzellen in diesem Feld einordnen zu können, wurde mit Hilfe biochemischer Methoden nachgeprüft, ob MHC Klasse II Moleküle sowie ihre Beladungskofaktoren konstitutiv von den Zellen exprimiert werden.
4.2.2 Biochemischer Nachweis von MHC Klasse II
4.2.2.1 Nachweis von MHC II im Lysat von Dünndarmepithelzellen mittels Western-Blot Dünndarmepithelzellen wurden wie unter 3.2.1 beschrieben gewonnen und lysiert. Das Lysat wurde mit Probenpuffer versetzt und die Auftrennung der Proteine erfolgte in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. Die anschließende Detektion der MHC Klasse II Moleküle wurde im Western-Blot unter Einsatz zweier verschiedener Primärantikörper, 10.2.16 und α2, durchgeführt. Die in der Literatur beschriebene Expression von MHC Klasse II in Enterozyten des Dünndarms der Maus in Abwesenheit inflammatorischer Stimulation (Parr et al., 1979; Curman et al., 1979) konnte bestätigt werden (siehe Abbildung 4.6). Vergleicht man die Resultate der beiden Antikörper miteinander, so fällt auf, dass der Antikörper α2 die Banden der freien α-Kette jeweils gut erkennt, die α-Kette im SDS-stabilen Komplex aber nur schwach detektierte. Bei dem Antikörper 10.2.16, welcher ein konformationsabhängiges Epitop in der β-Kette erkennt, zeigt eine starke Präferenz für SDS-stabile Komplexe. Die Proteinkonzentrationen der aufgetragenen Proben wurden nicht bestimmt und ließen so keine vergleichenden Aussagen über die jeweilige Menge des exprimierten MHC II zu.
Ergebnisse 50
α2 10.2.16
Abbildung 4.6
Nachweis von MHC Klasse II mittels Western-Blot in Zellen einer B-Lymphoma-Zelllinie (C3F6) sowie in Dünndarmepithelzellen über den Einsatz zweier unterschiedlicher Primärantikörper. Der Antikörper α2 erkennt die α-Kette des MHC II Komplexes. In den nicht gekochten Proben ist die α-Kette im SDS-stabilen Komplex sowie die Bande der freien α-Kette zu erkennen. Bei Kochen der Proben zerfällt der SDS-stabile Komplex in seine Bestandteile. Deshalb verschwindet das Signal der α-Kette aus der Position um 50 kD und taucht an der Position der freien α-Kette wieder auf. Der Antikörper 10.2.16 erkennt die β-Kette des MHC II Komplexes. Bei Kochen der Proben verschwindet das Signal der β-Kette aus der Position um 50 kD und taucht an der Position der freien β -Kette wieder auf. Die Bande des stabilen Komplexes verschwindet, während die der β-Kette sichtbar wird.
4.2.2.2 Nachweis von MHC II im Lysat von Dünndarmepithelzellen unter Einsatz der Immunpräzipitationstechnik
Im nächsten Schritt wurde dem Nachweis des MHC II mittels Western-Blot eine wie unter 3.2.4.
beschriebene Immunpräzipitation (IP) vorangestellt. Hierdurch wurde das Protein zunächst aus dem Zelllysat isoliert, bevor mit dem Nachweis begonnen wurde. Die Zellen wurden mit Saponin permeabilisiert und die Zellproteine mit Biotin markiert. Für die Immunpräzipitation wurde der gegen MHC Klasse II gerichtete Antikörper 40F verwendet. Der Komplex aus Antikörper und seinem „gefangenen“ Protein wurde über den Fc-Teil des Antikörpers an Protein-A-Sepharose gebunden. Nach Waschen der Protein-A-Sepharose wurden die Biotin-markierten Proteine abgelöst, indem sie direkt in dem SDS-haltigen Laemmli-Probenpuffer aufgekocht wurden. Nach Abtrennung der Protein-A-Sepharose mittels Zentrifugation erfolgte die Auftrennung der Proteine in der SDS-PAGE sowie ihre Detektion mittels Western-Blot über HRP-gekoppeltes Streptavidin. Es konnte wiederum MHC II im Lysat von Dünndarmepithelzellen nachgewiesen werden. Bei Kochen der Probe zerfällt der SDS-stabile Komplex in die α- und die β-Kette, welche beide durch Biotin markiert wurden. Erstaunlicherweise taucht das in der stabilen Bande vorhandene Biotin nach dem
Kochen nur wesentlich abgeschwächt an den Positionen der Untereinheiten wieder auf. Die Ursache hierfür blieb ungeklärt.
Abbildung 4.7
Nachweis von MHC Klasse II mittels Western-Blot in Dünndarmepithelzellen nach Immunpräzipitation. Der SDS-stabile αβ−Komplex des MHC II Moleküls zerfällt bei Kochen der Probe in seine Bestandteile. Das in der SDS-stabilen Bande detektierte Biotin taucht dennoch nach Kochen der Probe an den Positionen der Untereinheiten nur abgeschwächt auf.
Ergebnisse 52
4.2.3 Biochemischer Nachweis von invarianter Kette in intestinalen Epithelzellen
4.2.3.1 Nachweis von Invarianter Kette mittels Western-Blot in Dünndarmepithelzellen und professionellen antigenpräsentierenden Zellen
Wie unter 3.2.1 beschrieben wurden Epithelzellen aus dem Dünndarm einer Maus isoliert sowie kultivierte Zellen der B-Lymphoma-Zelllinie C3F6 geerntet und lysiert. Nachdem die Zelllysate mit Probenpuffer versetzt und aufgekocht worden waren, wurden die Proteine in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die Detektion der invarianten Kette erfolgte mittels Western-Blot. Es wurde der spezifische Primärantikörpers In-I in Kombination mit einem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper gegen Ratte eingesetzt. Die invariante Kette konnte in beiden Zelllysaten nachgewiesen werden.
Bei Betrachtung des Bandenmusters in Dünndarmepithelzellen fiel eine Abweichung gegenüber dem aus profesionellen antigenpräsentierenden Zellen bekannten charakteristischen Bandenmuster der invarianten Kette auf. In der Regel sind in variierendem Verhältnis zueinander die p41- und die p31-Form des Moleküls nachzuweisen, das heißt, es wird eine 31kD schwere Bande sowie eine 41kD schwere Bande im Western Blot detektiert. C3F6-Zellen exprimieren nur die p31-Form. In Dünndarmepithelzellen wurden vier unterschiedliche Formen detektiert, die Molekulargewichte lagen bei 41, 38, 31 und 28 kD. Sowohl die Bande des p41-Fragments als auch die des p31-Fragments schienen also zu einem Teil auf eine um 3kD leichtere Bande abgesunken zu sein. Hier stellte sich die Frage, ob die zusätzlich auftretenden Varianten in dieser Form bereits von der Zelle exprimiert wurden oder ob sie im nachhinein bei der Lyse der Zellen durch die Wirkung eines Enzyms entstanden waren. Die Untersuchungen zu dieser Frage werden später beschrieben (siehe 4.2.3.4, 4.2.3.5und4.2.3.6). Zudem ließ sich bei Vergleich der p31 Bande der Dünndarmepithelzellen mit der p31 Bande der C3F6 Zellen ein geringfügiger Unterschied im Laufverhalten feststellen. Die Bande der p31-Form der invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen schien ein etwas geringeres Molekulargewicht zu besitzen als die entsprechende Bande in C3F6-Zellen. (siehe Abbildung 4.8). Die Proteinkonzentrationen der aufgetragenen Proben wurden nicht bestimmt und ließen so keine vergleichenden Aussagen über die jeweilige Menge der exprimierten invarianten Kette zu.
Abbildung 4.8
Nachweis von Invarianter Kette mittels Western-Blot im Lysat einer professionellen antigenpräsentierenden Zelle (C3F6) sowie vergleichend im Lysat von Dünndarmepithelzellen. P41 und p31 bezeichnen die charakteristischen bekannten Banden der invarianten Kette; P41* und p31* bezeichnen die in Dünndarmepithelzellen auftretenden leichteren Varianten von p41 und p31
4.2.3.2 Vergleichender Nachweis von Invarianter Kette in Dünndarmepithelzellen und in professionellen antigenpräsentierenden Zellen
Die Zellen wurden zunächst wie unter 3.2.1 beschrieben isoliert. Anschließend erfolgte eine Permeabilisierung eines Teils der Dünndarmepithelzellen mittels Saponin und im Anschluss wie unter 3.2.4.1 und 3.2.4.2 beschrieben eine Biotinylierung der Zellproteine und eine Immunpräzipitation der invarianten Kette unter Verwendung des Antikörpers In-I. Anschließend wurden die Proteine in der SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Die Detektion im Western-Blot erfolgte unter Einsatz des gegen Biotin gerichteten HRP-gekoppelten Streptavidins. Erneut fiel die Abweichung des Bandenmusters der invarianten Kette gegenüber dem aus profesionellen antigenpräsentierenden Zellen bekannten auf. In Saponin-permeabilisierten Enterozyten waren jeweils beide Varianten der p41- und der p31-Form zu finden, während in den nicht permeabilisierten Zellen nur jeweils die um 3 kD leichtere Variante auftrat.
Sollte letztere nicht von vornherein in der Zelle existieren, sondern erst im Verlauf der Lyse durch die Wirkung eines Enzyms entstehen, so ließe es sich erklären, dass sie in permeabilisierten Zellen in geringerem Umfang auftrat: im Verlauf der Permeabilisierung könnte das für die Spaltung verantwortliche Enzym zu einem Großteil aus dem Inneren der Zelle ausgewaschen worden sein (siehe Abbildung 4.9).
Ergebnisse 54
Abbildung 4.9
Nachweis der invarianten Kette im Western-Blot nach Immunpräzipitation
4.2.3.3 Nachweis von invarianter Kette im Lysat von LPS-induzierten Lymphozyten aus der Milz sowie in dendritischen Zellen im Vergleich zu Dünndarmepithelzellen
Um die beschriebene Differenz im Molekulargewicht der invarianten Kette der Dünndarmepithelzellen gegenüber den bekannten Formen des Moleküls näher zu verdeutlichen, wurden dendritische Zellen aus dem Knochenmark einer Maus gewonnen und differenziert (siehe 3.2.1.2) sowie Lymphozyten aus der Milz einer Maus isoliert und mit LPS aktiviert (siehe 3.2.1.3).
Die Zellen wurden lysiert, das Lysat mit Probenpuffer versetzt und aufgekocht. Die Proteine wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Die Detektion erfolgte im Western-Blot. Das Bandenmuster der invarianten Kette in dendritischen Zellen sowie in Lymphozyten aus der Milz einer Maus konnte nun mit dem der invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen verglichen werden (siehe Abbildung 4.10). Sowohl dendritische Zellen als auch Milzzellen zeigten beide charakteristischen Banden der invarianten Kette bei 31 kD und bei 41 kD. Das Verhältnis der beiden Formen zueinander war bei dendritischen Zellen ausgeglichen, während bei Milzzellen die p31 Form stärker exprimiert wurde. In Dünndarmepithelzellen waren entweder lediglich die jeweiligen, um etwa 3 kD leichteren, Varianten der p31 bzw. der p41 zu detektieren oder aber alle vier möglichen Formen, wobei dann die Expression der leichteren Varianten stärker ausgeprägt war.
In dendritischen Zellen ist weiterhin ein kleineres Abbauprodukt nachzuweisen, welches sich auch in Dünndarmepithelzellen findet.
Abbildung 4.10
Nachweis von invarianter Kette in Dünndarmepithelzellen („Dünndarm“), Lymphozyten der Milz („Milz“) und dendritischen Zellen („DZ“). Die Auftrennung der Proteine der dendritischen Zellen erfolgte abweichend zu den ansonsten verwendeten Gelen mit 11% Acrylamid über ein Gel mit einem Gehalt von 15% Acrylamid.
DZ = Dendritische Zellen
4.2.3.4 De-novo Synthese oder enzymatische Produktion veränderter Formen der invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen ?
Bei einem Anteil der nachzuweisenden invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen schienen also Formen zu existieren, die im Vergleich zu bekannten Formen des Moleküls Differenzen im Molekulargewicht aufwiesen. Zunächst sollte geklärt werden, ob es sich bei der Ursache für die Existenz von Varianten mit verringertem Molekulargewicht um Produkte eines enzymatischen Abbaus handelte. Das verantwortliche Enzym sollte sich im Lysat der Dünndarmepithelzellen befinden und müsste daher in der Lage sein, auf das Bandenmuster der invarianten Kette im Lysat eines anderen Zelltyps nachträglich Einfluss zu nehmen. Um dies zu überprüfen, wurde wiederum die B-Lymphoma-Zelllinie C3F6 herangezogen. Die kultivierten Zellen wurden geerntet und lysiert.
Gleichzeitig wurden Dünndarmepithelzellen einer Maus isoliert und ebenfalls lysiert. Die Zelllysate von C3F6-Zellen und Dünndarmepithelzellen wurden auf die gleichen Proteinkonzentrationen eingestellt, um einen Vergleich der in den verschiedenen Zelltypen exprimierten Menge an MHC II und invariante Kette zu ermöglichen. Anschließend wurden die Lysate in drei verschiedenen Ansätzen zu gleichen Volumenanteilen gemischt und für jeweils 5min bei 0°C, bei
Ergebnisse 56
Raumtemperatur oder bei 37°C inkubiert. Die Ansätze wurden dann mit Probenpuffer versetzt, aufgekocht und einer SDS-PAGE unterworfen. Mittels Western-Blot wurden sowohl MHC II als auch invariante Kette analysiert. Im Lysat der C3F6-Zellen bewirkte die Zugabe des Lysats der Enterozyten bereits bei Inkubation bei 0°C ein Absinken des Molekulargewichts eines Anteils der invarianten Kette. Mit steigender Temperatur erhöhte sich der Anteil der leichteren Form der invarianten Kette. Für die Verringerung des Molekulargewichts der invarianten Kette schien also in der Tat ein Enzym im Lysat von Dünndarmepithelzellen verantwortlich zu sein. Auf MHC Klasse II hatte dieses unbekannte Enzym dabei offenbar keinerlei Einfluss, da eine Verringerung des Molekulargewichts von MHC II unabhängig von der Temperatur nicht zu beobachten war (siehe Abbildung 4.11).
Verglich man die beiden Zelltypen hinsichtlich der Menge der von ihnen exprimierten Moleküle MHC Klasse II und invariante Kette, so ließ sich feststellen, dass Dünndarmepithelzellen die gleiche Menge an MHC II exprimierten wie eine professionelle APC, aber nur ein Zehntel der Menge an invarianter Kette (siehe Abbildung 4.11).
Abbildung 4.11
Nachweis der Formen der von invarianter Kette sowie von MHC Klasse II in Lysaten von C3F6-Zellen und von Dünndarmepithelzellen sowie in einem Gemisch beider Lysate
4.2.3.5 Überprüfung der invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen auf ihre N- bzw. O-Glykosylierung
Bei dem Enzym, welches bei Lyse von Dünndarmepithelzellen einen Anteil der invarianten Kette abspaltete, konnte es sich entweder um eine Protease handeln oder auch um eine Glykosidase.
Bei letzerer kam sowohl eine N-Glykosidase als auch eine O-Glykosidase in Betracht. Zunächst sollte untersucht werden, ob es sich bei dem gesuchten Enzym um eine N-Glykosidase handelt.
Hierfür wurden Dünndarmepithelzellen aus der Maus isoliert und lysiert sowie gleichzeitig C3F6-Zellen geerntet und lysiert. Beide Zelllysate wurden wie unter 3.2.2.4 beschrieben mit der N-Glykosidase „Endo F“ behandelt, welche N-glykosidisch gebundene Zucker von Polypeptiden entfernt. Im Anschluss wurden die mit Endo F behandelten Proben sowie die Kontrollproben mit Probenpuffer versetzt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Die Proteine wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose übertragen. Die Detektion der invarianten Kette erfolgte im Western-Blot mit Hilfe des Antikörpers In-I. Es war eine Endo F induzierte Verringerung des Molekulargewichts sowohl der p31 als auch der p41 Form der invarianten Kette wie auch ihrer in Dünndarmepithelzellen auftretenden Varianten zu erkennen. Hätte es sich bei dem gesuchten Enzym um eine N-Glykosidase gehandelt, so hätte in den varianten Formen der invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen keine durch Endo F induzierte Molekulargewichtsverschiebung mehr stattfinden dürfen. Das gesuchte Enzym war also keine N- Glykosidase (siehe Abbildung 4.12).
Ergebnisse 58
Abbildung 4.12
Nachweis der Auswirkungen der N-Glykosidase Endo F auf die verschiedenen Formen der invarianten Kette in C3F6-Zellen und in Dünndarmepithelzellen
Auch die Abspaltung von O-glykosidisch angehängten Zuckerketten scheidet als Ursache für die Verringerung des Molekulargewichts der invarianten Kette in Dünndarmepithelzellen aus, da Inhibitoren der O-Glykosilierung eine kleinere Verschiebung als 3 kD des Molekulargewichts der invarianten Kette verursachen (Robert Lindner, persönliche Mitteilung).
4.2.3.6 Ein post-Lyse Artefakt als Ursache für die Molekulargewichtsverschiebung der invarianten Kette
Es stellte sich die Frage, ob die Ursache für die Molekulargewichtsverschiebung der invarianten Kette bereits vor der Lyse der Zellen stattfindet, dementsprechend eine physiologische Rolle spielt oder aber erst bei Durchführung der Lyse auftritt. Frisch gewonnene Dünndarmepithelzellen wurden direkt nach Ausstreifen in heißem Probenpuffer aufgenommen und für weitere 5 min darin aufgekocht. Enzyme sollten auf diesem Weg sofort zerstört werden. Die Proteine der Probe wurden im Anschluss in der SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und im Western-Blot mit dem mab In-I analysiert. In dieser Probe waren lediglich die bekannten Formen der invarianten Kette p41 sowie p31 nachzuweisen. Es sind keine varianten Formen mit verringertem Molekulargewicht mehr zu detektieren. Es scheint dementsprechend eine Enzym,
welches bei Durchführung der Lyse der Zellen nicht inhibiert werden konnte, für das bisher aufgefallene veränderte Molekulargewicht der invarianten Kette verantwortlich gewesen zu sein (siehe Abbildung 4.13). Da bereits ausgeschlossen wurde, dass es sich hierbei um eine Glykosidase handelt, handelt es sich wahrscheinlich um eine Protease. Die Wirkung der Proteasen hätte durch den Zusatz von Proteaseinhibitoren bei der Lyse der Zellen eigentlich verhindert werden sollen. Im Enterozyten des Darms ist die Konzentration an Proteasen möglicherweise so hoch, dass die Wirkung der eingesetzten Inhibitoren in diesem Fall nicht ausreichend war.
Abbildung 4.13
Demonstration der Molekulargewichtsverschiebung der invarianten Kette bei unterschiedlicher Vorbehandlung der Proben
C3F6-Zellen wurden zum Vergleich mit aufgetragen 1: C3F6-Zellen
2: Dünndarmepithelzellen, direkt nach Isolation in Probenpuffer aufgekocht; es ist keine Molekulargewichtsverschiebung zu beobachten
3: Dünndarmepithelzellen, 10min in Lysepuffer lysiert, neben p31 und p41 sind jeweils um 3 kD leichtere Varianten zu detektieren
Ergebnisse 60
4.2.4 Biochemischer Nachweis des MHC Klasse II Beladungskofaktors H2-M
Aus dem Dünndarm einer Maus wurden wie unter 3.2.1.1 beschrieben Epithelzellen isoliert. Ein Teil der Zelllysate wurde nach Abtrennung der unlöslichen Zellbestandteile einem Ultrazentrifugationsschritt unterworfen. Im Anschluss wurde der Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt, während das Sediment direkt in heißem Probenpuffer aufgekocht wurde. Nun waren drei Proben vorhanden: das gesamte Zelllysat sowie der Überstand und das Sediment nach Ultrazentrifugation des Gesamtlysats. Jede Probe wurde mit Probenpuffer versetzt und die Proteine in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die Detektion der invarianten Kette erfolgte mittels Western-Blot. Der spezifische Primärantikörpers 1B9A wurde in Kombination mit einem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper gegen Ratte eingesetzt. Im gesamten Zelllysat sowie in dem Sediment nach Ultrazentrifugation konnte eine Banden im Molekulargewichtsbereich von H2-M nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden aber auch weitere Banden mit niedrigerem Molekulargewicht detektiert. Hierbei könnte es sich um Abbauprodukte des Proteins H2-M gehandelt haben oder aber auch um unspezifische Banden. Da letzteres nicht auszuschließen war, wurde dieses Ergebnis lediglich als Hinweis auf eine Expression von H2-M in Dünndarmepithelzellen der Maus angesehen.
Im Überstand des Zelllysats nach Ultrazentrifugation war kein H2-M nachzuweisen. Unter den gewählten Lysebedingungen schien H2-M nicht löslich zu sein.