Etablierung der Methode

Die von der Arbeitsgruppe um Dominique Kaiserlian beschriebene Methode zur Isolation von Dünndarmepithelzellen (Kaiserlian et al., 1989) bestand im wesentlichen aus vier Schritten.

Zunächst wurde der frisch entnommene Darm unter Umkehrung der Innenseite nach außen auf eine Glasspirale aufgezogen. Im zweiten Schritt wurde die Glasspirale in den Vibro-Mixer eingespannt und in warmen Isolationspuffer getaucht. Durch Vibration wurden die Epithelzellen abdissoziiert und dann einer differentiellen Zentrifugation unterworfen. Abschließend erfolgte eine Vereinzelung der Zellen aus den bis zu diesem Schritt gewonnenen Epithelzellverbänden über Passagen durch englumige Kanülen.

Die Durchführung dieser Methode führte in einzelnen Punkten zu Schwierigkeiten, welche im folgenden näher beschrieben werden.

4.1.2.1 Abdissoziation der Dünndarmepithelzellen von der Darmwand

Das Aufziehen des Darmabschnitts auf die Glasspirale unter Umkehren der Innenseite des Darmes nach außen erwies sich als nicht immer durchführbar. Die Ursache hierfür lag in dem variierenden Durchmessers und der wechselnden Kontraktilität des Darmrohres. Bei der Suche nach einer alternativen Methode stellte sich das Ausstreifen der Zellen durch wiederholtes Aufschieben des entnommenen und dem Protokoll entsprechend vorbehandelten Darms auf eine Glasspirale als effektiv heraus. Auf diese Weise ließen sich schnell und leicht eine große Anzahl an Epithelzellverbänden gewinnen. Zur Überprüfung der Abstreifprozedur wurden Dünndarmabschnitte vor und nach dem Abstreifen in Kunstharz eingebettet und Schnitte für die lichtmikroskopische Betrachtung hergestellt. Ein Vergleich zeigte, dass bei Einsatz dieser Methode die Zotten im Bereich des Übergangs zur Kryptregion abgerissen wurden (siehe Abbildung 4.1 und Abbildung 4.2). Die gewonnenen Zellverbände stammten also aus dem Bereich der Darmzotten., Kryptzellen verblieben überwiegend im Darm.

Abbildung 4.1

Übersichtsbild des Ileums der Maus vor Isolation der Epithelzellen der Balken entspricht 100 µm

Ergebnisse 44

Abbildung 4.2

Übersichtsbild des Ileums der Maus nach Isolation der Epithelzellen der Balken entspricht 100 µm

4.1.2.2 Partielle Dissoziation von Epithelzellverbänden

Nach dem Ausstreifen der Zellen aus dem Lumen des Darms hatte man eine Suspension von sehr großen Zellverbänden bis zu ganzen Zotten in Isolationspuffer gewonnen. Um eine differentielle Zentrifugation anschließen zu können, mussten diese Zellverbände zunächst weiter vereinzelt werden. Hierfür wurde der Vibromixer eingesetzt. Eine Glasspirale wurde in das Gerät eingespannt und in die gewonnene Epithelzellsuspension eingetaucht. Anschließend erfolgte eine Vibration der Zellsuspension bei 60 Hz, welche durch die Glasspirale übertragen wurde. Unterstützt wurde der Prozess durch ein zusätzliches Auf- und Ab- Pipettieren der Suspension mittels Pasteurpipette. Als optimale Vibrationszeit wurde eine Zeit von 10min ermittelt. Eine Erhöhung der Zeitspanne auf 15min führte zu einer zu starken Zerkleinerung der Zellverbände mit der Folge eines starken Vitalitätsverlusts der gewonnenen Zellen, bei Vibrationszeiten unter 10min blieben zu große Zellverbände bestehen.

Im Verlauf der differentiellen Zentrifugation erfolgte durch die mechanische Belastung bei der Resuspension der Sedimente eine weitere Verkleinerung der Zellverbände. Die optimale Größe war nach dem dritten Zentrifugationsschritt erreicht, jede weitere Zentrifugation führte zu einem zu hohen Verlust an ebenfalls vermehrt anfallenden einzelnen Epithelzellen in den Überstand (siehe Abbildung 4.3)

Abbildung 4.3

Änderung der Grössenverteilung im Laufe der differentiellen Zentrifugation A : vor dem ersten Zentrifugationsschritt

B-D: 1.-3. Zentrifugationsschritt der Balken entspricht 100µm

4.1.2.3 Vitalität der Einzelzellen

Die Vitalität der isolierten Epithelzellen wurde mittels Färbung der Zellen mit Trypanblau oder Hoechst 33258 überprüft. Bei denjenigen Zellen, deren Plasmamembran nicht mehr intakt war, konnte Farbstoff in das Zellinnere vordringen und aufgrund seiner Affinität zur DNA die Zellkerne anfärben. Nach Vereinzelung der Zellen durch die erwähnte Passage durch englumige Kanülen wurde der Prozentsatz nicht gefärbter und somit noch intakter und lebensfähiger Zellen ausgezählt. Dieser lag bei nur etwa 20%, zudem wurden viele Zellen vollständig zerstört. Um hier Verbesserungen zu erzielen, wurde zunächst nach einer Möglichkeit gesucht, die Vitalität der Epithelzellen bereits durch schonendere Behandlung des entnommenen Darms zu erhöhen. So wurde dem entnommenen und gespülten Darm für die Zeit der Inkubation in warmer Pufferlösung Luftsauerstoff zugeführt, um so die physiologischen Stoffwechselvorgänge zu aufrecht zu erhalten.

Der Pufferlösung wurde mittels eines an eine Peristaltikpumpe angeschlossenen Kunststoffschlauches Außenluft zugeleitet. Als Folge stellten sich Kontraktionsbewegungen des gesamten Darmabschnitts ein. In der nachfolgenden Präparation konnte eine deutlich höhere Menge an Dünndarmepithelzellen isoliert werden. Vermutliche Konsequenz der Kontraktionsbewegungen des Darms könnte gewesen sein, dass die glatte Muskulatur des Darms geschmeidiger bliebt und so ein effektiveres Ausstreifen der Zellen möglich war.

Ergebnisse 46

Die Vitalität der Zellen konnte durch die Einführung dieses Schrittes allerdings nicht gesteigert werden. So wurde nach einer alternativen Methode zur Vereinzelung der Zellen aus den gewonnenen Verbänden gesucht:

- Kurzzeitige Behandlung der Zellsuspension mit dem proteolytischen Enzym Trypsin - Kurzzeitige Behandlung der Zellsuspension mit EDTA

- Langsames Passieren der Zellen durch eine sogenannte „ball-bearing-machine“ (EMBL) (Spaltbreite 10 µm, ohne Ausübung von Widerstand)

Die bei diesen Verfahren erreichte Vitalität der Zellen lag sogar bei noch geringeren Werten als bei Einsatz der Ausgangsmethode. Diese Alternativmethoden versprachen damit keinen Erfolg und wurden nicht weiter verfolgt.

Unabhängig von der verwendeten Methode waren die Zellen nach Vereinzelung also zum größten Teil nicht mehr intakt. In erhaltenen kleinen Verbänden dagegen war die Vitalität recht hoch, es starben nur einzelne Randzellen (Abbildung 4.4). Aus diesem Grund wurden von nun an die kleinen Zellverbänden, welche nach dem dritten Schritt der differentiellen Zentrifugation vorlagen, für Experimente eingesetzt. Eine Vereinzelung wurde nicht weiter angestrebt.

Abbildung 4.4

Färbung der Zellverbände mit Hoechst 33258 der Balken entspricht 100µm

Die Morphologie der Epithelzellen, welche nach der nun etablierten Methode isoliert wurden, wurde elektronenmikroskopisch beurteilt. Die Zellen lagen in kleinen Verbänden vor und wiesen eine gut erhaltene charakteristische Ultrastruktur ihrer Organellen auf. In einigen Zellen war eine geringe Vakuolenbildung zu beobachten. Insbesondere bei einzelnen Zellen oder Randzellen eines Verbandes wurden Beschädigungen der Plasmamembran festgestellt. (siehe Abbildung 4.5)

Abbildung 4.5

Darstellung isolierter Dünndarmepithelzellen im Transmissionselektronenmikroskop der Balken entspricht 1 µm