Immunologische Methoden

3.2.3.1 Immunpräzipitation

Durch die Technik der Immunpräzipitation (IP) wird die Isolierung einzelner Proteine aus Proteingemischen wie Zelllysaten möglich.

Hierfür wurde zunächst aus den kultivierten Zellen bzw. aus den aus dem Dünndarm der Maus gewonnenen Epithelzellen wie unter 3.2.1.5 beschrieben ein Zelllysat hergestellt. Dieses Lysat wurde als erstes einer sogenannten Vorpräzipitation unterzogen. Nachdem CL4B-Sepharose-Matrix (Amersham Pharmacia, Freiburg) mehrmals durch Zentrifugation und anschließender Resuspension in Lysepuffer gewaschen wurde, wurde aus Matrix und Lysepuffer eine 1:1-Suspension hergestellt und hiervon 40µl dem Lysat zugegeben. In der folgenden einstündigen Inkubation unter Rotation bei 4°C sollten alle unspezifisch an CL4B-Sepharose bindenden Moleküle aus dem Lysat entfernt werden. Nach Abtrennung der Sepharose-Matrix durch Zentrifugation wurde in dem Überstand im zweiten Schritt die eigentliche Immunpräzipitation durchgeführt. Ein spezifisch gegen das aus der Lösung zu isolierende Protein gerichteter Antikörper wurde in einer Konzentration von 5µg / ml dem Lysat zugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 0°C wurden 40µl einer 1:1 - Suspension aus Lysepuffer und Protein A-gekoppelten CL4B-Sepharose-Matrix hinzugegeben. Die Matrix war zuvor dreimal durch Zentrifugation und anschließender Resuspension in Lysepuffer gewaschen worden, wobei im zweiten Waschschritt durch Zusatz von 1% BSA unspezifische Proteinbindungsstellen abgesättigt wurden. Der Fc-Teil der Antikörper konnte während einer erneuten Inkubation für 45min unter Rotation bei 4°C an Protein A-Sepharose binden. Nach Pelletierung der Sepharose-Matrix wurde diese jeweils dreimal in BSA- und in EDTA-Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurde sie mit einer 27gauge Kanüle über Vakuum trockengesaugt. Durch Zugabe von 50µl reduzierenden SDS-Probenpuffers, 5minütigem Schütteln und je nach präzipitiertem Protein 4 minütigem Aufkochen oder einstündiger Inkubation bei 37°C wurden Antikörper und Antigen von der Protein A-Sepharose Matrix in den Probenpuffer eluiert. Das Eluat wurde zum Nachweis des präzipitierten Proteins mittels SDS-PAGE und Westernblot weiter verwendet.

3.2.3.2 Markierung von Zellproteinen durch Biotinylierung

Ein Nachteil bei dem Nachweis immunpräzipitierter Proteine in SDS-PAGE und Westernblot besteht darin, dass die verwendeten Sekundärantikörper häufig nicht nur den jeweils spezifisch eingesetzten Primärantikörper erkennen, sondern zusätzlich auch die ebenfalls auf die Nitrocellulose transferierten IP-Antikörper. Um dies zu vermeiden, kann die Technik der Immunpräzipitation mit einer vorhergehenden Proteinmarkierung verbunden werden. Eine Methode zur nicht-radioaktiven Markierung von Proteinen ist die Inkubation von Zellen mit dem

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Reagenz N-Hydroxysulfosuccinimidyl-LC-Biotin (NHSS-LC-Biotin), welches in 0,1 M Natriumphosphatpuffer gelöst wurde. Zu einer Zellsuspension von 2 x 10⁴ Zellen in 200µl HBSS wurden 20µl der NHSS-LC-Biotin-Lösung zugegeben und eine Inkubation für 10min auf Eis angeschlossen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die Biotinmoleküle binden dabei kovalent an Lysingruppen zellulärer Proteine. Die Reaktion konnte dann durch Zugabe von 10ml 40mM Glyzin enthaltendem Zellkulturmedium abgestoppt werden, weil hierbei die freie Aminosäure Glyzin mit dem überschüssigen Biotinylierungsreagenz reagierte. Wurden intakte Zellen für die Biotinylierungsreaktion eingesetzt, erfolgte die Markierung nur an Zelloberflächenproteinen, da das wasserlösliche Biotinylierungsreagenz nicht durch die Plasmamambran diffundieren kann. Um auch Proteine im Inneren der Zellen zu erreichen, wurden die Zellen mit dem Detergenz Saponin behandelt (s.3.2.3.3.1). Die Plasmamembran wurde dadurch permeabilisiert, so dass das gelöste NHSS-LC-Biotin in das Zellinnere gelangen konnte.

Nach Beendigung der Biotinylierungsreaktion wurden die Zellen wie unter 3.2.1.5 beschrieben lysiert und dann eine IP, eine SDS-PAGE sowie ein Transfer der Proteine auf Nitrocellulose durchgeführt. Die biotinylierten Proteine konnten durch Bindung von HRP-gekoppeltem Streptavidin und nachfolgender ECL-Reaktion nachgewiesen werden.

3.2.3.3 Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie

Die Immunfluoreszenz wird genutzt, um die Lokalisation zellulärer Proteine über Kopplung mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern sichtbar zu machen.

Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren Licht einer für den jeweiligen Farbstoff charakteristischen Wellenlänge und emittieren es bei einer anderen, längeren Wellenlänge. Das Prinzip der Immunfluoreszenzmikroskopie beruht auf einer Kopplung eines Fluoreszenzfarbstoffs an ein für das gesuchte Protein spezifisches Antikörpermolekül. Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird das Präparat mit Licht im Bereich der jeweiligen absorbierenden Wellenlänge des Fluoreszenzfarbstoffs bestrahlt und dann durch einen Filter betrachtet, welcher nur für Licht der jeweils emittierten Wellenlänge durchlässig ist. Somit wirkt der Hintergrund dunkel und selbst eine sehr geringe Menge des Fluoreszenzfarbstoffes kann nachgewiesen werden.

3.2.3.3.1 Vorbereitung der Zellen

Zu Beginn wurden die Zellen wie bereits unter 3.2.1.4 beschrieben geerntet, gewaschen und gezählt. Für eine Immunfluoreszenzfärbung wird eine Zellzahl von etwa 1 x 10⁶ Zellen benötigt.

Bei Dünndarmepithelzellen wurde diese Menge visuell über die Dichte der Zellen abgeschätzt. Die Färbung wurde in einem 1,5ml Eppendorf Reaktionsgefäß durchgeführt. Die Zellen wurden durch Inkubation mit 500µl einer Lösung von 4% Paraformaldehyd in PBS für 10min fixiert. Die Fixierung wurde durch einmaliges Waschen in 500µl 20mM Ammoniumacetat in PBS abgestoppt. Die Zellen

wurden nun erneut zweimal in je 500µl PBS gewaschen und konnten dann zur Immunfluoreszenzfärbung herangezogen werden. Sollten nicht nur Proteine an der Zelloberfläche, sondern auch im Inneren der Zelle gefärbt werden, war nach dem Abstoppen der Fixierung eine Permeabilisierung der Zellmembran notwendig. Der Einsatz selbst sehr niedriger Konzentrationen und sehr geringer Einwirkzeiten von TX-100 erwies sich als zu aggressiv und führte zu einem hohen Verlust an fixierten Zellen. Als optimales Detergenz für diesen Zweck stellte sich Saponin heraus. Die Zellen wurden mit einer Lösung von 0,02% Saponin in PBS versetzt, für eine Minute bei etwa 30°C (in der Hand) erwärmt und dann für 15min auf Eis inkubiert. Um die Zellmembran permeabilisiert zu halten, musste in den folgenden Schritten beständig ein Anteil von 0,02%

Saponin in der Zellsuspension beibehalten werden.

3.2.3.3.2 Indirekte Immunfluoreszenz

Für die indirekte Immunfluoreszenz wurden zwei Antikörper benötigt. Im ersten Schritt wurden die Zellen mit 100µl eines spezifisch gegen das gesuchte Protein gerichteten Primärantikörpers in einer Konzentration von 5-10µg / ml in 1% BSA in PBS für eine Stunde auf Eis inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit PBS erfolgte nun eine 45minütige Inkubation mit 100µl eines den Primärantikörper erkennenden Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Sekundärantikörpers in einer Verdünnung von 1:100. Abschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit PBS, bevor die Zellsuspension im Verhältnis 3:1 mit Prolong „anti-fade“-Reagenz vermischt und auf einem Objektträger mit einem Deckglas eingedeckt wurde.

Bei der Betrachtung der Präparate unter dem Fluoreszenzmikroskop (Eclipse E800; Nikon, Düsseldorf) wurden Rhodaminund Alexa 546 mit Licht des Wellenlängenbereichs 510-560nm angeregt, emittiertes Licht wurde im Bereich von über 590 nm detektiert. FITC und Alexa 488 wurden mit Licht des Wellenlängenbereichs 465-495nm angeregt, das emittierte Licht wurde im Bereich von 515-555nm aufgefangen.

3.2.3.3.3 Direkte Immunfluoreszenz

Bei der direkten Immunfluoreszenzfärbung ist der Fluoreszenzfarbstoff bereits an den Primärantikörper gekoppelt. Nach einstündiger Inkubation mit dem Primärantikörper in einer Konzentration von 5-10µg / ml in 1% BSA in PBS erfolgten direkt zwei Waschschritte in PBS. Die Zellen wurden nun mit Prolong „anti-fade“-Reagenz vermischt und eingedeckt. Anschließend konnten die Präparate unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden.

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3.2.3.3.4 Anfärbung der Zellkerne mit Hoechst 33258

Sollen die Zellkerne angefärbt werden, so geschah dies mit dem speziell hierfür entwickelten, die DNA anfärbenden Hoechst-Farbstoff in einer Konzentration von 0,1 µg/ml (Hoechst 33258) durch 10minütige Inkubation der Zellsuspension auf Eis in 1% BSA in PBS. Nach zwei Waschschritten können die Zellen wie oben beschrieben eingedeckt werden. Zur Darstellung unter dem Fluoreszenzmikroskop wurde der Farbstoff mit Licht des Wellenlängenbereichs 340-380nm angeregt, das emittierte Licht wurde durch einen Filter auf den Bereich von 435-485nm begrenzt.

3.2.3.3.5 Doppelfärbungen

Um die Kolokalisation jeweils zweier Proteine (MHC II/ Invariante Kette; MHC II / lamp I) innerhalb von Dünndarmepithelzellen darstellen zu können, wurden Doppel-Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt. Hierfür erfolgte in demselben Zellansatz gleichzeitig eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem Erstantikörper In-I (Invariante Kette) bzw. ID4B (lamp I) und dem Alexa 546 konjugierten gegen Ratte gerichteten Ig als sekundärem Antikörper. Dieser Sekundärantikörper war zuvor gegen Maus Ig absorbiert worden, um eine Kreuzreaktion mit dem gleichzeitig in der direkten Immunfluoreszenz eingesetzten gegen MHC II gerichteten FITC-gekoppelten Antikörper 10.3.6.2 zu verhindern. Der Antikörper 10.3.6.2 wurde während der Inkubation des Zweitantikörpers der indirekten Immunfärbung zugegeben und parallel inkubiert.

Alle weiteren Schritte entsprechen denen der indirekten Immunfluoreszenzfärbung.

3.2.3.3.6 Bildliche Darstellung der Immunfluoreszenzfärbungen

Die Aufzeichnung der Bilder erfolgte über eine an das Fluoreszenzmikroskop angeschlossene Digitalkamera (Princeton Instruments). Die Belichtungszeit wurde der Fluoreszenzintensität angepaßt und lag zwischen 0,1 und 1 Sekunde. Die Aufnahmen wurden mit dem Programm IP-Lab (Scanalytics) mittels eines „frame grabbers“ aufgenommen. Zunächst wurden sie im IP-IP-Lab Format abgespeichert und durch Anwendung der „Pseudocolor“ Funktion eingefärbt. Zur weiteren Bearbeitung wurden sie über die Funktion „to byte as shown“ in das für das Programm Photoshop lesbare Tiff-Format überführt.

Sollten bei Doppelimmunfluoreszenzfärbung beide Färbungen überlagernd in einem Bild dargestellt werden, wurden die Aufnahmen in Photoshop (Adobe, Unterschleissheim) Format überführt. Es wurde ein neues Photoshop-Dokument erstellt, in welches beide Aufnahmen überlagernd hineinkopiert wurden. Im Anschluss wurden die Ebenen des Dokuments auf

„Differenz“ eingestellt.