Nachweis von Anabolika im Schweif- und Mähnenhaar von Pferden

Aus dem Institut für Tierzucht, Mariensee Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)

Nachweis von Anabolika im

Schweif- und Mähnenhaar von Pferden

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Alexandra Schlupp

aus Solingen

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. F. Ellendorff

1. Gutachter: Prof. Dr. F. Ellendorff 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-O. Hoppen

Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2003

Meinen Eltern

INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis

I. EINLEITUNG

II. LITERATUR

1. Zusammenfassung einiger allgemeiner pharmakokinetischer 14 Grundprinzipien

1.1 Resorption 14

1.2 Verteilung 16

1.3 Metabolismus 17

1.4 Elimination 18

2. Pharmakologie von Clenbuterol und Nandrolon 21

2.1 Clenbuterol 21

2.1.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften 21

2.1.2 Wirkungen und therapeutische Anwendungen 22

2.1.3 Pharmakokinetik 24

2.2 Nandrolon 26

2.2.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften 29

2.2.2 Wirkungen und therapeutische Anwendungen 29

2.2.3 Pharmakokinetik 32

2.3 Nachweis von Clenbuterol und Nandrolon beim Pferd 35

2.3.1 Nachweis von Clenbuterol 37

2.3.2 Nachweis von Nandrolon 39

3. Aufbau und Biologie des Pferdehaares 43

3.1 Histologischer und chemischer Aufbau des Haares 43

3.2 Haarwachstum 46

3.3 Einlagerungsmechanismen 48

4. Zusammenfassung der wichtigsten Kenntnisse zum Nachweis 50 von Clenbuterol und Nandrolon beim Pferd

III. EIGENE UNTERSUCHUNG

1. Material und Methoden 53

1.1 Wachstumsgeschwindigkeit von Schweif- und Mähnenhaar 53

1.1.1 Pferde 54

1.1.2 Haltung und Fütterung 54

1.1.3 Versuchsdurchführung 54

1.2 Versuche mit Applikation von Clenbuterol und Nandrolon 55

1.2.1 Pferde 55

1.2.2 Clenbuterolapplikation 57

1.2.3 Nandrolon nach mehrmaliger Applikation 58 1.2.4 Nandrolon im Schweiß nach einmaliger Applikation 59 1.2.5 Entnahme und Aufbewahrung des Probenmaterials 61 1.2.6 Vorbereitung der Haarproben zur Analyse 63

1.2.7 Analytik 63

1.2.7.1 Nachweis von Clenbuterol 64

1.2.7.2 Nachweis von Nandrolon 67

1.2.7.3 Kontrollproben 75

1.3 Felduntersuchung: Untersuchung der Schweifhaarproben von 75 Körungs- und Vergleichshengsten

1.3.1 Pferde 75

1.3.2 Entnahme und Aufbewahrung des Probenmaterials 76 1.3.3 Vorbereitung des Probenmaterials zur Analyse 76

1.3.4 Analyse der Fremdpferdproben 77

2. Ergebnisse 78

2.1 Wachstumsgeschwindigkeit von Mähnen- und Schweifhaar 78

2.2 Nachweis von Clenbuterol 80

2.2.1 Clenbuterol im Blut 80

2.2.2 Clenbuterol im Urin 81

2.2.3 Clenbuterol im Haar 82

2.2.4 Vergleich der Nachweisbarkeit von Clenbuterol in 88 den Untersuchungsmedien Blut, Urin und Haar

2.3 Nachweis von Nandrolon nach mehrmaliger Applikation 89

2.3.1 Nandrolon im Blut 89

2.3.2 Nandrolon im Urin 91

2.3.3 Nandrolon im Haar 93 2.3.4 Vergleich der Nachweisbarkeit von Nandrolon in 100

den Untersuchungsmedien Blut, Urin und Haar 2.4 Nachweis von Nandrolon im Schweiß nach einmaliger Applikation 101

2.4.1 Nandrolon im Schweiß 101

2.4.2 Nandrolon im Schweifhaar 102

2.4.3 Nandrolon im Fellhaar 103

2.4.4 Vergleich der Ergebnisse in Schweiß, Schweif- und Fellhaar 103

2.4.5 Nandrolon im Blut 104

2.4.6 Nandrolon im Urin 105

2.5 Untersuchung von Hengst-Schweifhaaren auf Nandrolon und Testosteron sowie deren Metaboliten 106

2.5.1 Vergleichshengste 106

2.5.2 Körungshengste 108

2.5.3 Vergleich der Ergebnisse der Körungs- und Vergleichshengste 112

IV. DISKUSSION

1. Wachstum von Mähnen- und Schweifhaar 114

2. Nachweis von Clenbuterol 115

3. Nachweis von anabolen Steroiden 118

4. Felduntersuchung auf Clenbuterol, Nandrolon und Testosteron 121

sowie deren Metaboliten 5. Schweif- und Mähnenhaar als Untersuchungsmedium 123

6. Einführung des Verfahrens in die Praxis 125

V. ZUSAMMENFASSUNG

VI. SUMMARY

VII. LITERATURVERZEICHNIS

Anhang

Abbildungsverzeichnis 146

Tabellenverzeichnis 149

Grunddatentabellen 154

Abkürzungsverzeichnis

4-Dion 4-Estren-3,17-dion

5-Estran-diol 5(10)-Estran-3ß,17a-diol 5-Estren-diol 5(10)-Estren-3a,17ß-diol

Abb. Abbildung

Aqua bidest. Aqua bidestillata Aqua dest. Aqua destillata

COPD chronic obstructive pulmonary desease = chronisch obstruktive Bronchitis

ELISA Enzym linked Immunosorband Assay

et al. et alii

FAL Forschungsanstalt für Landwitschaft

ff freie Fraktion

GC Gac Chromatography = Gaschromatographie

gf glucuronid Fraktion

h Stunde

HPLC High performance liquid chromatography = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HRMS High resolution mass spectrometry =

hochauflösende Massenspectrometrie

i. m. intramuskulär

i. v. intravenös

IOC Internationales Olympisches Komitee

IS Interner Standard

kg Kilogramm

KM Körpermasse

Konz. Konzentration

LC Liquid Chromatography =

Flüssigkeitschromatographie

LOD Limit of Detection = Nachweisgrenze

LOQ Limit of Quantification = Quantifizierungsgrenze

µ Mittelwert

m Meter

mg Milligramm

ml Milliliter

MS Mass Spectrometry = Massenspektrometrie MSTFA N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid

n Anzahl

ng Nanogramm

pg Picogramm

r Wiederholbarkeit

RIA Radioimmunoassay

rT Retentionszeit

s Standardabweichung

sd Standardabweichung

sf Sulfatfraktion

Tab. Tabelle

TMS Trimethylsilyl

UV Ultraviolett

z. B. zum Beispiel

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

I. EINLEITUNG

Auch wenn in den letzen Jahren Doping in immer stärkerem Maße in die Schlagzeilen gekommen ist und fast kein sportliches Ereignis ohne positive Dopingfälle vorübergeht, ist Doping keine Erfindung der Neuzeit. Erste Berichte über „gedopte“ Sportler gibt es schon aus dem antiken Griechenland vor Christus und auch im antiken Rom wurden Pferde schon von ihren Wagenlenkern mit „Mitteln“ versorgt, die deren Leistungsfähigkeit steigern sollten.

1666 wurde das erste Dekret zum Verbot von „Leistungssteigernden“ Substanzen in England erlassen und unter Strafe gestellt. Mit der Entwicklung der Pharmazie wurden auch immer mehr Medikamente entwickelt, um vor allem die Leistung von Rennpferden positiv oder negativ zu beeinflussen. Erst in den letzten Jahrzehnten gewann das Doping auch in den anderen Pferdesportdisziplinen immer stärkere Bedeutung. Aber Doping ist nicht nur im Pferdeleistungssport ein ernstzunehmendes Problem, es hat auch in immer stärkerem Maße in die Pferdezucht Einzug gehalten (DUNNETT 2002). Heute haben nur noch wenige Pferdesportorganisationen keine Dopingbestimmungen. Die Bestimmungen der einzelnen Verbände haben jedoch recht unterschiedliches Ausmaß.

Der Hauptverband für Traber-Zucht und Rennen e. V. gibt in seiner Trabrennordnung keine explizite Definition von „Doping“, sondern bestimmt „Doping“ in § 93 als Anwendung von unerlaubten Substanzen, die in einer Dopingliste gesondert aufgeführt werden: „ Ein Pferd darf in seinen Geweben, seinen Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen in der Zeit zwischen dem Beginn der Rennveranstaltung und dem Ende des Rennens, an dem das Pferd teilgenommen hat oder für welches das Pferd als Starter angegeben worden ist, keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen aufweisen.... Die Dopingliste in der jeweils gültigen Fassung ist Bestandteil der Trabrennordnung...“ Die Anwendung von Dopingmitteln ist also nur insofern nicht erlaubt, als im Körper des Tieres nur während des Wettkampfes keine nachweisbaren Medikamentenspuren mehr vorhanden sein dürfen (HAUPTVERBAND FÜR TRABER-ZUCHT UND -RENNEN E.V. 2003).

Das Direktorium für Vollblut -Zucht und –Rennen e. V. definiert den Begriff „Doping“ als den Einsatz und die Billigung des Einsatzes unerlaubter Mittel, die geeignet sind, die

natürliche Leistungsfähigkeit eines Pferdes regelwidrig zu verändern. Im Gegensatz zum Trabrennverband ist die Anwendung auch während des Trainings verboten (DIREKTORIUM FÜR VOLLBLUTZUCHT UND RENNEN E.V. 1995).

Die einzige wirkliche Definition des Begriffes Doping findet sich in § 67a der Leistungsprüfungsordnung der Deutschen Reiterlichen Vereinigung. Danach sind

„Dopingsubstanzen Substanzen, die geeignet sind, die Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen“. Im Weiteren werden die Wirkstoffgruppen näher genannt, darunter auch die Gruppe der anabolen Wirkstoffe, die auch immer in den entsprechenden Dopinglisten der anderen Verbände als verbotene Substanzen aufgeführt sind. Nach § 66 3.8 sind „Pferde/Ponys, denen eine Dopingsubstanz oder ein verbotenes Arzneimittel verabreicht oder an denen eine verbotene Methode angewendet oder zur Beeinflussung der Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft irgendein Eingriff oder eine Manipulation vorgenommen wurde“ nicht zu Wettbewerben und Leistungsprüfungen zugelassen (DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG E.V. 2000b).

Unabhängig von den Bestimmungen der einzelnen Pferdesportverbände, die auf sportethischen Gedanken beruhen, ist das Doping auch im Tierschutzgesetz selbst geregelt (TIERSCHUTZGESETZ 1998). Dort heißt es in § 3: Es ist verboten,

5. ein Tier auszubilden, sofern damit erhebliche Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier verbunden sind,

11. an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Dopingmittel anzuwenden“

Nicht zuletzt ist es auch seit 1998 nach § 6a des Arzneimittelgesetzes ausdrücklich verboten, Arzneimittel zu Dopingzwecken im Sport in den Verkehr zu bringen, zu verschreiben oder anzuwenden (ARZNEIMITTELGESETZ 1976).

In die Diskussion geraten sind in letzter Zeit Substanzen, die neben dem Einsatz zur Leistungssteigerung im Sport auch im Einsatz während der Aufzucht von Junghengsten und – Stuten finden (DUNNETT 2002). Die 3 bis 4 jährig zur Leistungsprüfung vorgestellten Tiere,

sollen zu diesem Zeitpunkt einen möglichst weit entwickelten Eindruck erwecken. Dies soll durch den Einsatz anabol wirkender Substanzen vom Absetzen bis zu einem Zeitpunkt vor der Vorstellung erreicht werden. Die bislang häufig negativen Ergebnisse von Dopingproben beruhen vermutlich darauf, dass die Applikation der Medikamente früh genug vor der Vorstellung beendet wird. Der anabole Effekt vieler Substanzen ist häufig deutlich länger wirksam als Ausscheidungsprodukte nachgewiesen werden können.

Zielsetzung dieser Arbeit ist es, am Beispiel von Clenbuterol und Nandrolon lange Zeit zurückliegende Anwendung von Dopingsubstanzen nachzuweisen und diesen Nachweis, wenn möglich, zur Anwendungsreife zu bringen. Dazu sollen Rückstandsuntersuchungen im Mähnen und Schweifhaar durchgeführt werden.

Im Einzelnen diente dazu die Beantwortung folgender Fragestellungen.

1. Lassen sich ß-Agonisten und Steroide (am Beispiel von Clenbuterol und Nandrolon) nach Applikation im Mähnen- und Schweifhaar auch über den Zeitraum von mindestens einem Jahr nachweisen und wie lange verbleiben die beiden untersuchten Substanzen im Blut und Urin?

2. Lässt sich Nandrolon, das endogen bei Hengst und Stute produziert wird, bei Jung und Althengsten im Mähnen- und/oder Schweifhaar nachweisen?

3. Sind Clenbuterol und/oder Nandrolon bei der Vorauswahl zur Körung und/oder bei der Körung selbst im Mähnen- und/oder Schweifhaar nachweisbar.

Ebenfalls Bestandteil dieser Arbeit ist eine Untersuchung zur Wachstumsgeschwindigkeit von Mähnen- und Schweifhaar, um eine bessere Bestimmung des Zeitpunktes des Medikamenteneinsatzes gewährleisten zu können.

II. LITERATUR

1. Zusammenfassung einiger allgemeiner pharmakokinetischer Grundprinzipien

Bei den in diesem Abschnitt beschriebenen allgemeinen pharmakologischen Grundprinzipien handelt es sich um allgemein gültiges Lehrbuchwissen (FREY 1996) und ist hier der Vollständigkeit halber aufgeführt. Mit Pharmakokinetik im Allgemeinen werden die Prozesse bezeichnet, die im Körper mit einer verabreichten Substanz geschehen. Im engeren Sinne beschreibt die Pharmakokinetik die Konzentrationsverläufe des Pharmakon im Organismus.

Im Folgenden werden die für das Verständnis der Pharmakokinetik der im Versuch eingesetzten Substanzen erforderlichen Grundlagen der Resorption näher erläutert. Der Weg des Pharmakon in einem Körper wird vor allem durch folgende Schritte gekennzeichnet: die Resorption, also Aufnahme des Stoffes in den Körper, die je nach Applikationsart stark variieren kann, die Verteilung des Medikamentes in den einzelnen Flüssigkeitsräumen und Geweben, die Metabolisierung, also der Umbau der verabreichten Substanz in wirksame oder unwirksame Metaboliten und letztendlich die Elimination, also Ausscheidung der Produkte.

1.1 Resorption

Für den Vorgang der Resorption sind vor allem die Art und der Ort der Applikation von Bedeutung sowie die Galenik der verabreichten Substanz. Bei der intravasalen (zumeist intravenösen) Injektion wird der Vorgang der Resorption vollständig umgangen und das Arzneimittel ist sofort vollständig verfügbar, die Bioverfügbarkeit beträgt also 100%.

Intramuskulär injizierte Stoffe werden im Allgemeinen rasch resorbiert, da die Muskulatur zumeist sehr gut durchblutet ist. Bei einer guten Kreislaufsituation gelangen die Stoffe schnell in die Blutbahn und ein Wirkungseintritt ist je nach Wirkstoff schon nach wenigen Minuten möglich.

Die Resorption nach subkutaner Injektion kann, wenn die Injektion in schlechter durchblutete Gebiete geht, nur sehr langsam oder gar nicht erfolgen, erfolgt die Injektion jedoch in gut durchblutete Gebiete, so ist die Resorption häufig nicht langsamer als bei intramuskulärer

Injektion. Die subkutane Injektion eignet sich nicht zur Applikation lokal reizender Substanzen.

Auch die intraperitoneale Injektion führt zu einem schnellen Wirkungseintritt, jedoch kann es zu einem ausgeprägten First-Pass-Effekt bei der Leberpassage kommen. Dies wird möglich, weil die im abdominalen Bereich resorbierten Arzneimittel mit dem venösen Pfortaderblut zuerst die Leber passieren, bevor sie in den großen Kreislauf gelangen. Dabei wird ein Teil der resorbierten Medikamente enzymatisch inaktiviert und kann somit keine Wirkung entfalten.

Eher lokale als systemische Wirkung entfalten Medikamente die intrauterin oder intrazisternal appliziert werden sowie perkutan angewandte Substanzen.

Bei einer Resorption über die Lunge entfalten inhalierte Arzneimittel aufgrund der großen alveolären Oberfläche und der sehr guten Durchblutung fast so schnell ihre Wirksamkeit wie bei intravasaler Applikation. Entscheidend für die Resorbierbarkeit ist die Tröpfchengröße der Aerosole, da Stoffe, die > 2 µm sind, in den oberen Luftwegen hängen bleiben.

Die Resorption bei oraler Applikation ist wesentlich komplexer. Die Resorption direkt aus dem Magen ist bei non-Ruminanten weniger bedeutend, da die Aufenthaltsdauer im Magen nur sehr kurz ist. Grundsätzlich ist eine Resorption im Magen möglich, wenn Medikamente beim stark sauren pH des Magens in der ungeladenen Form vorliegen und dann zusätzlich ausreichend lipidlöslich sind, um durch die Magenwand diffundieren zu können. Oral verabreichte Substanzen können unter Umständen in großem Maße einem First-Pass-Effekt unterliegen.

Der überwiegende Anteil der Resorption eines Stoffes findet im Darm mit seiner großen Oberfläche und der langen Verweildauer der Medikamente statt. Als Mechanismus werden sowohl passive Diffusion durch die Darmschleimhaut als auch Transport über spezielle Carrier-Systeme angenommen. Die passive Diffusion ist stark abhängig vom vorliegenden pH-Wert im Darm. Die Resorption basischer Arzneimittel kann durch Alkalisierung, die von sauren Arzneimitteln durch Ansäuern verbessert werden. Somit ist auch der Darmabschnitt, in dem bestimmte Substanzen überwiegend resorbiert werden bestimmt. Saure Arzneimittel werden besser im vorderen Dünndarm, in dem noch ein relativ saurer pH vorliegt, basische Arzneimittel besser im Dickdarm, wo der pH deutlich über 7 liegt, resorbiert. Zusätzlich ist

aber auch im Darm immer noch die Lipidlöslichkeit der Substanz von Bedeutung, so können Stoffe mit gleichem pKa-Wert (Ionisationskonstante) Unterschiede in der Resorption aufweisen, da eine stark unterschiedliche Lipophilie vorliegen kann. Nicht zuletzt ist die absolute Löslichkeit des Stoffes von Bedeutung, denn Stoffe, die so gut wie unlöslich sind, werden fast überhaupt nicht oder nur sehr langsam im Magen-Darm-Trakt resorbiert.

Einen großen Einfluss auf die Resorption eines Stoffes hat auch die Galenik des verabreichten Medikamentes. Inhalierbare Substanzen sind zumeist extrem gut resorbierbar, schwer lösliche Stoffe können nach oraler Gabe im Magen-Darm-Trakt nur sehr langsam oder auch gar nicht resorbiert werden. So genannte „Depot-Präparate werden aufgrund ihrer Formulierung nur sehr langsam zu ihren resorbierbaren Metaboliten abgebaut und haben daher eine verlängerte Wirkdauer. Besondere Formen der Arzneimittelapplikation sind Implantate, die zum Teil über Monate kontinuierlich eine geringe Wirkstoffmenge zur Resorption zur Verfügung stellen.

1.2 Verteilung

Nachdem ein Stoff resorbiert ist, beginnt gleichzeitig die Verteilung im und auch schon die Elimination aus dem Organismus. Jedes Pharmakon besitzt ein spezifisches Verteilungsmuster, welches Auskunft darüber gibt, in welchem Gewebe es zu welcher Zeit und in welcher Form vorliegt. Maßgebende Faktoren für die individuellen Verteilungsmuster einer Substanz sind die Ionisationskonstante der Verbindung und der pH-Wert des Verteilungsraumes, die Affinität eines Stoffes für bestimmte Gewebe (z. B. Fettgewebe) und die Existenz von impermeablen Membranen.

Die Verteilung eines verabreichten Arzneimittels aus dem Intrazellularraum in die Gewebe ist von mehreren Parametern abhängig. Medikamente, die in starkem Maße an Proteine, meist Albumin, gebunden werden, sind in ihrer Verteilung gehemmt, da sie in gebundener Form den Intravasalraum nicht verlassen können. Diese Bindungen sind jedoch reversibel und können sowohl durch Konzentrations- und Ladungsgefälle als auch durch Wechselwirkung mit anderen Medikamenten wieder gespalten werden. Ungebundene Substanzen mit einem

Molekulargewicht unter 60.000 Dalton können durch die Endothelporen der Kapillarwand gelangen, größere können, wenn sie lipophil und ungeladen sind, durch die Wand diffundieren oder müssen durch Pinozytose aus dem Intravasalraum geschleust werden.

Danach können sie durch Diffusion oder aktiven Transport durch die Zellmembranen in die Gewebezellen gelangen.

Für pharmakokinetische Berechnungen der Verteilung einer Substanz auf die Gewebe wird eine Proportionalitätskonstante, das scheinbare Verteilungsvolumen eines Pharmakon herangezogen. Das scheinbare Verteilungsvolumen gibt Auskunft darüber, in welchem Maße eine Substanz in Körpergewebe eingelagert wird. Sie kann primär nur nach intravenöser Injektion berechnet werden, da bei allen anderen Verabreichungsformen während der Resorption der Stoffe bereits die Elimination einsetzt damit und eine gemessene Plasmakonzentration nicht nur auf die Verteilung des Pharmakon ins Gewebe sondern auch auf die Vorgänge der Resorption und Elimination zurückzuführen ist. Zur Berechnung des scheinbaren Verteilungsvolumens setzt man die gegebene Gesamtdosis, bzw. die Dosis per kg KM in Verhältnis zur Konzentration des Stoffes im Plasma. Ist das scheinbare Verteilungsvolumen größer als 1, so liegt ein Stoff vorwiegend an Gewebe (z. B. Fettgewebe) gebunden vor, ist er hingegen kleiner als 1, so kann man davon ausgehen, dass der Stoff größtenteils intravasal vorliegt. Allerdings gibt dieser Wert nicht 100%igen Aufschluss über die wahre Verteilung, da bei stark proteingebundenen Arzneimitteln das Verteilungsvolumen sehr gering erscheint, bei Stoffen, die sehr schnell renal ausgeschieden werden, dagegen sehr viel höher, als sie in Wirklichkeit ist.

1.3 Metabolismus

Der Metabolismus beschreibt den Umbau und Abbau des Pharmakon durch den Körper.

Dieser Umbauvorgang kann zur Aktivierung, zur Verstärkung oder Verringerung der Wirkung und auch zur Deaktivierung der Wirkung des eingesetzten Arzneimittels führen und endet schließlich damit, dass das Pharmakon wieder aus dem Körper eliminiert werden kann.

Man unterscheidet vor allem 2 Phasen in diesem Umbauprozess. In der Phase I Reaktion werden Stoffe häufig stärker polarisiert um eine Kopplung dieser Metaboliten in der Phase II

Reaktion zu ermöglichen. Diese gekoppelten Produkte sind zumeist gut wasserlöslich und können somit renal rasch ausgeschieden werden.

Bei den Phase I Reaktionen kann man zwischen oxidativen Stoffwechselvorgängen (N- Dealkylierung, O-Dealkylierung, aromatische Hydroxylierung, oxidative Deaminierung, Sulfoxid-Bildung, Seitenkettenoxidation und Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenierung), die überwiegend in den Lebermikrosomen lokalisiert sind und den reduktiven Stoffwechselvorgängen (Azo-Reduktase und Nitro-Reduktase) unterscheiden. Die Spaltung der Esterbindungen kann nahezu in allen Geweben stattfinden, da die notwendigen Esterasen ubiquitär vorhanden sind, die Säureamid-Bindungen können jedoch nur in der Leber gespalten werden. Das Pharmakon kann an N- oder O- Verbindungen alkyliert werden und es kann auch ein Austausch von Schwefel gegen Sauerstoff in der Leber stattfinden.

Bei den Phase II Reaktionen werden die entstandenen Phenol-, Hydroxy-, Carboxy-, Amino- oder Sulfhydrydryl-Gruppen acetyliert, glucuronidiert oder sulfatiert, selten auch mit Cystein oder Mercaptursäure gekoppelt. Bei der Phase II Reaktion der Pharmaka gibt es starke tierartliche Unterschiede. Der Hund ist z. B. nicht zur Acetylierung befähigt, die Katze nicht zur Glucuronidierung, die bei anderen Tierarten den wichtigsten Metaboliten hervorbringt.

1.4 Elimination

Ein verabreichtes Arzneimittel kann sowohl unverändert oder aber auch nach Umwandlung in Kopplungsprodukte ausgeschieden werden. Hauptausscheidungsorgan sind die Nieren, aber die Ausscheidung kann auch über Darm, Lunge und auch über Speichel, Haut und Milchdrüse erfolgen. Für die Ausscheidung über die Nieren gilt, dass, je wasserlöslicher ein Stoff ist, er umso schneller ausgeschieden werden kann. Eine starke Speicherung von Substanzen in bestimmte Gewebe (z. B. Fettgewebe oder Augen) kann eine deutlich verlängerte Eliminationszeit zur Folge haben und einige Substanzen, z. B. Clenbuterol, können auch lange Zeit nachdem sie nicht mehr mit dem Urin ausgeschieden werden noch in den verschiedensten Geweben aufgefunden werden (BLANCHFLOWER et. al. 1993).

Für die Geschwindigkeit der Elimination ist auch die Verteilung des Arzneimittels im enterohepatischen Kreislauf von Bedeutung. Dabei werden bereits mit den Faezes ausgeschiedene Stoffe im Darm wieder aufgenommen und gelangen so nicht zur Ausscheidung, sondern zurück durch die Leber in den Kreislauf.

An der renalen Elimination eines Arzneimittels können die Prozesse der glomerulären Filtatrion, der tubulären Sekretion und der tubulären Rückresorption beteiligt sein. In der Phase der glomerulären Filtration können alle Stoffe, die nicht proteingebunden im Plasma vorliegen, in den Primärharn ausgeschieden werden. In der tubulären Sekretion können dann auch proteingebundene und vor allem stark saure oder basische Stoffe durch aktiven Transport ausgeschieden werden. Während der passiv ablaufenden, durch pH – Wertänderungen zu beeinflussenden tubulären Rückresorption können alle Stoffe auf der gesamten Länge des Nephrons zurück in den Blutkreislauf gelangen. Dies wird vor allem bei stark lipoidlöslichen Substanzen der Fall sein, so dass solche Substanzen in einem hohen Maße rückresorbiert werden und annähernd nicht ausgeschieden werden können. Für die Ausscheidung dieser Substanzen sind die Umbauvorgänge der Phase I und II Reaktionen von hoher Bedeutung, da die Substanzen dadurch gut wasserlöslich und weniger lipophil gemacht werden.

Kennwert für die renale Ausscheidung von Substanzen ist die renale Clearance:

K_u (mg/ml) x V_u (ml/min) renale Clearance (ml/min) = ---

Plasmakonzentration (mg/ml)

wobei K_u die Konzentration des Stoffes im Urin und V_u das Volumen des produzierten Urins pro Zeit ist. Die renale Clearance gibt also an, wie viel ml Plasma pro Minute von dem Stoff befreit werden. Aus dem Verhältnis der renalen Clearance eines Stoffes zur renalen Clearance der Modellsubstanz Inulin kann man Rückschlüsse auf den überwiegenden Vorgang ziehen, der zur Elimination einer Substanz führt. Ist die Clearance kleiner, wird der Stoff zwar glomerulär filtriert, aber tubulär rückresorbiert; ist er annähernd gleich, so wird er filtriert, aber nicht rückresorbiert; ist er größer, wird er zusätzlich zur Filtration auch noch tubulär sezerniert. Entspricht die renale Clearance dem effektiven renalen Plasmafluss, kann man

davon ausgehen, dass es sich um eine maximale Ausscheidung handelt und somit der Stoff innerhalb eines Plasmadurchflusses durch die Nieren eliminiert werden kann.

Die Ausscheidung über die Lunge ist hauptsächlich für gasförmig verabreichte Arzneimittel wie Inhalationsnarkotika von Bedeutung.

Bei der Ausscheidung einer Substanz über die Galle wird diese im günstigsten Falle direkt mit den Fäzes ausgeschieden. Meist unterliegen Arzneimittel aber im Dünndarm weiteren Umbauprozessen, so dass sie dann über die Darmwände wieder aufgenommen werden können. Es kommt zu einem entero-hepatischen Kreislauf, der die Wirkungsdauer einer Substanz sehr stark verlängern kann.

Im weiteren Sinne handelt es sich auch bei der Einlagerung von Substanzen in die Haare um einen Ausscheidungsprozess, da die Stoffe dem Kreislauf nach der Verhornung nicht mehr zur Verfügung stehen.

2. Pharmakologie von Clenbuterol und Nandrolon

Der Einsatz von anabolen Substanzen zum Zwecke der Leistungssteigerung ist in der Veterinärmedizin illegal. Dennoch werden immer wieder Fälle bekannt, in denen dennoch eine Applikation nachgewiesen werden konnte (DÜE 1998). Auf zwei Substanzgruppen, die auch Gegenstand der eigenen Untersuchungen sind, wird nachfolgend näher eingegangen: ß- Agonisten, speziell Clenbuterol und anabole Steroide, im Besonderen Nandrolon.

2.1 Clenbuterol

Der Wirkstoff Clenbuterol (NAB 365) wurden Anfang der siebziger Jahre als ß₂-selektives Sympathomimetikum entwickelt (ENGELHARDT 1976).

2.1.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften

Clenbuterol hat eine Molekülmasse von 277,18 Dalton und besitzt die Summenformel C12H18Cl2N2O. Der chemische Name nach IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) lautet:

4-Amino-a[(tert-butylamino)methyl]-3,5-dichlorbenzylalkohol.

Die Strukturformel ist in Abb. 1 dargestellt.

Cl

N H

N H OH

CH

CH

CH

Cl

Abb. 1 (nach ZIMMER 1976): Clenbuterol

In Arzneimitteln liegt Clenbuterol als Hydrochlorid vor und hat dann ein Molekulargewicht von 313,64 Dalton und einen Schmelzpunkt von 174 – 175,5°C. Clenbuterol ist ein farbloses, mikrokristallines Pulver, leicht löslich in Wasser, Methanol und Ethanol, jedoch schwer löslich in Chloroform und unlöslich in Benzol (WINDHOLZ et. al. 1983).

2.1.2 Wirkungen und therapeutische Anwendungen

Clenbuterol ist ein selektives ß2-Sympathomimetikum und zurzeit in Deutschland nach Anlage I der Verordnung 2377/90 des Rates vom 15.1.2003 für Rinder und Pferde, die der Lebensmittelgewinnung dienen, als Therapeutikum zugelassen. Als Präparate sind in Deutschland Ventipulmin-Gel^® und Venti-Plus Granulat^® als oral zu verabreichendes Bronchospasmolytikum beim Pferd und Planipart^® (alle Boehringer, Ingelheim, Deutschland) als intravenös zu verabreichendes Tokolytikum beim Rind zugelassen.

Wirkungen auf den Bewegungsapparat

In 5-10fach höherer als der therapeutischen Dosis wurde Clenbuterol illegal als Wachstumsförderer beim Rind angewendet (BLASS et. al. 1999; PETERS 1989). Dabei macht man sich die Wirkungen von Clenbuterol auf den Fett- und Proteinstoffwechsel zu Nutze (MERSMANN 1998). Clenbuterol beeinflusst die Calpain und Calpastatin (calziumabhängiges Proteinasen System: Calpain I, II und Calpastatin) Aktivität in den Muskelzellen (BARDSLEY et. al. 1992). Unter Anwendung von Clenbuterol kommt es durch die Aktivierung von ß₂-Adrenozeptoren schon nach wenigen Tagen zu einer Reduktion von Körperfett und einem Aufbau von Muskelmasse. (CHOO et. al. 1992; MCMANUS u.

FITZGERALD 2003). Dieser Effekt der Umverteilung wird auch als „Repartitioning“

bezeichnet und kann auch schon bei therapeutischer Dosierung beobachtet werden (KEARNS et. al. 2001). Chronische Clenbuterolapplikation führt zu einer Veränderung der Anordnung am Kopf der Myosinfilamente (BEEKLEY et. al. 2003). Es kommt zu einer Verringerung der langsamen, weißen Typ II zugunsten einer Erhöhung der schnellen, roten Typ I Muskelfasern (ZEMAN et. al. 1988). Clenbuterol reduziert eine Atrophie denervierter Muskeln (ZEMAN et. al. 1987).

Wirkungen auf den Respirationstrakt

Clenbuterol findet schon seit Mitte der siebziger Jahre zunehmend Bedeutung in der Behandlung von chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD) beim Pferd.

Clenbuterol wirkt stark relaxierend auf die glatte Bronchialmuskulatur (TORNEKE et. al.

1998), und die Herabsetzung des nicht-elastischen Widerstandes der Lunge führt zu einer erhöhten Sauerstoffaufnahme (SHAPLAND et. al. 1981). Beim gesunden Pferd kommt es nach Applikation nicht zu einem erhöhten Atemvolumen, einer erhöhten Frequenz oder verändertem Lungenwiderstand (SLOCOMBE et. al. 1992). Clenbuterol bedingt einen erhöhten arteriellen Blutfluss in den Bronchien (SANDERS et. al. 1991). Clenbuterol verstärkt zusätzlich in den Bronchien die sekretorische (DIXON 1992; TURGUT u. SASSE 1989) und ziliäre Aktivität der Becherzellen (KASTNER et. al. 1999), was in einer erhöhten mukoziliären Clearence resultiert. Dies beruht möglicherweise auf einer Dehnung der Mukusschicht bei Bronchodilatation (DIXON 1992). Nachteil einer länger dauernden Therapie mit Clenbuterol ist die Ausbildung einer Tachyphylaxie durch eine Verminderung der Rezeptorendichte im Bronchialgewebe, die jedoch durch die Gabe von Glukokortikoiden verhindert werden kann (ABRAHAM et. al. 2002). Die Dosierung von Clenbuterol zur Therapie der COPD beim Pferd wird mit 2x täglich 0,8 µg pro KG Körpermasse angegeben (SASSE u. HAJER 1977). Eine therapeutische Gabe hat keinen Einfluss auf Laktatwerte, Gesamtprotein und den Hämatokrit im Blut von Pferden während der Belastung, erniedrigt jedoch die aerobe Leistung (KEARNS et. al. 2001). Clenbuterol hat keinen positiven Einfluss auf klinische Anzeichen und Laborparameter bei Gabe während einer Influenza A Infektion (KASTNER et. al. 1999).

Sonstige Wirkungen von Clenbuterol

Neben dem Einsatz als Bronchotherapeutikum wird Clenbuterol als Tokolytikum eingesetzt.

Die Dosierung von 0,3 mg Clenbuterol führt beim Pferd generell zu einer nachhaltigen Tokolyse, die für die meisten geburtshilflichen Manipulationen ausreichend ist (BOSTEDT 1988). Clenbuterol kann als Tokolytikum auch zur Behandlung von Uterusverlagerungen und –torsionen sowie drohendem Abort eingesetzt werden (BOENING u. LEENDERTSE 1993).

Clenbuterol bewirkt in fast allen Trächtigkeitsstadien (außer am 19. Trächtigkeitstag) eine Abnahme des Uterustonus und der Kontraktilität des Uterus, die Reduktion des Uterustonus

ab dem 19. Tag ist mit einer Änderung des Fötus zu einer mehr rundlichen Form assoziiert (GASTAL et. al. 1998).

Im Gegensatz zu anderen ß-Agonisten besitzt Clenbuterol nur noch sehr geringe Affinität zu ß1-Rezeptoren, so dass erst Konzentrationen deutlich oberhalb der therapeutischen Dosierung starke kardiale Nebenwirkungen zur Folge haben. Clenbuterol zeigt dann ß1-blockierende Eigenschaften (ENGELHARDT 1976). Bei therapeutischer Dosierung bewirkt Clenbuterol überwiegend eine aktive Vasodilatation der bronchialen Gefäße (SANDERS et. al. 1991). Die oft zu beobachtende Tachykardie unter Clenbuterolbehandlung kommt reflektorisch durch die ausgelöste periphere Vasodilatation zu Stande (ENGELHARDT 1976). Der vorübergehende Abfall des arteriellen Blutdruckes und die Steigerung der Herzfrequenz sowie der Anstieg des arteriellen Sauerstoffdruckes hat jedoch keinen negativen Einfluss auf das Herzkreislaufsystem von Pferden (ROSE et. al. 1983; SHAPLAND et. al. 1981). Beim Pferd treten nach Clenbuterolapplikation zuweilen Muskeltremor und Schweißausbruch auf (SASSE u. HAJER 1977). Aufgrund der extrem hohen Dosierung können bei der Anwendung von Clenbuterol als Anabolikum erhebliche Nebenwirkungen im Herz-Kreislaufsystem beobachtet werden (PAYNE et. al. 1999). Clenbuterol löste nach 8wöchiger Verabreichung an Pferde jeweils unmittelbar nach der Applikation eine Erweiterung der Aorta aus, was gegebenenfalls in einem plötzlichen Herztod und einer Veränderung der Herzmuskelstruktur resultieren kann (SLEEPER et. al. 2002). Bei anästhesierten Pferden kann Clenbuterol erfolgreich zu einer Anhebung eines niedrigen arteriellen Sauerstoffpartialdruckes eingesetzt werden (KEEGAN et. al. 1991).

2.1.3 Pharmakokinetik

Im Gegensatz zu anderen beta-Agonisten, die zwar sehr gut oral absorbiert werden, unterliegt Clenbuterol nicht deren ausgeprägtem First-Pass-Effekt und hat eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation (ENGELHARDT 1976; MORGAN 1990). Beim Pferd beträgt die Bioverfügbarkeit nahezu 100% (LÖSCHER 1996). Wie bei anderen Substanzen wird der Ort der Resorption von Clenbuterol wahrscheinlich vom pH-Wert im Magen-Darm-Trakt beeinflusst. Im niedrigen pH- im Magen von nicht-ruminanten und im

Labmagen von ruminanten liegt Clenbuterol überwiegend als Kation vor, in den pH- neutraleren Bereichen des Dünndarms eher ungeladen, was die passive Resorption durch die Schleimhaut erhöht (SMITH 1998). Clenbuterol kann neben der oralen Applikation auch intravenös und intratracheal verabreicht werden (LEHNER et. al. 2001).

Die mittlere Absorptionshalbwertszeit (Zeit, in der die halbe Konzentration im Plasma erreicht ist, die nach i. v. Injektion erreicht worden wäre) beträgt beim Pferd bei 2,2h mit Plasmakonzentrationen zwischen 0,45 und 0,75 ng/ml und einer Plasmahalbwertszeit von 10h (KALLINGS et. al. 1991). Nach einmaliger oraler Clenbuterolapplikation kommt es zu einem zweigipfligen Verlauf der Plasmakonzentration. Der erste und höchste Maximalwert liegt schon nach einer Zeit von bis zu 30 Minuten, der zweite, etwas niedrigere und schwacher ausgeprägte Gipfel liegt bei einer Zeit von 3-8 Stunden nach Applikation. Als Erklärung für das sehr frühe Maximum und den zweigipfligen Verlauf wird eine Absorption von großen Mengen an Clenbuterol schon über die Maulschleimhaut vermutet. Der zweite Gipfel stammt dann vermutlich aus der Resorption im Bereich des Jejunums (SEINSCH 1997). Ein enterohepatischer Kreislauf wird hauptsächlich bei Tieren mit Gallenblase angenommen und ein derartiger Kreislauf ist beim Pferd für Clenbuterol bislang nicht beschrieben (DUMASIA u. HOUGHTON 1991; KALLINGS et. al. 1991).

Die Verteilung von Clenbuterol in die Gewebe ist nach oraler Gabe hoch, was zum Teil auf seiner geringen Plasmaproteinbindung beruht (MORGAN 1990).

Clenbuterol kann sowohl die Blut-Hirnschranke (SAUX et. al. 1986) als auch die Plazentrarschranke (KOPITAR u. ZIMMER 1976; MORGAN 1990) überwinden und geht bei laktierenden Tieren in die Milch über (SMITH 1998).

Der Metabolismus von Clenbuterol ist stark speziesabhängig. Für Mensch, Kaninchen, Hund und Ratte wurde schon 1976 das Vorkommen von 7 Metaboliten im Urin beschrieben, von denen nur 5 quantifiziert wurden. Das unmetabolisierte Clenbuterol war das Hauptausscheidungsprodukt (ZIMMER 1976). Beim Pferd hingegen wird Clenbuterol kaum metabolisiert. Über 95% des Clenbuterols werden unkonjugiert ausgeschieden, wobei unter den gefundenen Metaboliten kein Phase I und wenige Phase II Metaboliten waren

(DUMASIA u. HOUGHTON 1991). Dieses findet Bestätigung in späteren Untersuchungen (HAGEDORN et. al. 1995).

Die Elimination von Clenbuterol erfolgt bei allen Tierarten überwiegend renal. Die Ausscheidung über den Kot ist bei den meisten Spezies nur sehr gering. Beim Hund beträgt sie weniger als 5% (ZIMMER 1976). Bei der Ratte hingegen wird Clenbuterol etwas stärker biliär eliminiert (KOPITAR u. ZIMMER 1976).

2.2 Nandrolon

Steroide werden aus dem Cholesterin in mehreren Schritten über Pregnenolon und Progesteron synthetisiert. Ihre Grundstruktur beruht auf einem Steranskelett, durch das durch Methylierungen, Hydroxylierung, Dehydrierungen usw. die einzelnen Steroide abgeleitet werden können (OETTEL 1996). Abb. 2 zeigt diese Grundstruktur mit der üblicherweise gebräuchlichen Nummerierung der Kohlenstoffatome und der Ringe.

1 2

3 4

5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

Abb. 2 (nach OETTEL 1996): Steranskelett

Das Nandrolon ist in seiner Struktur durch Entfernen der Methylgruppe am 10.

Kohlenstoffatom der 19 C-Atome von Testosteron abgeleitet und wird darum auch als 19- Nor-Steroid, Synonym 19-Nortestosteron bezeichnet. Es hat die chemische Bezeichnung 17-

beta-19-Nortestosteron. Zusammen mit seinem Epimer, dem 17-alpha-19-Nortestosteron = epi-Nandrolon kommt es natürlicherweise bei verschiedenen Spezies vor.

O

CH

CH

OH

1 2

3 4

5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

Abb.3 (DUMASIA u. HOUGHTON 1981): Testosteron

O

CH

H

OH

1 2

3 4

5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

Abb. 4 (nach DUMASIA u. HOUGHTON 1984):

17-beta-hydroxyestra-4en-3on=

17-beta-19-Nortestosteron=

Nortestosteron=

Nandrolon

O

CH₃

H

OH

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

Abb. 5 (nach DUMASIA u. HOUGHTON 1984):

17-alpha-hydroxyestra-4en-3on 17-alpha-19-Nortestosteron=

epi-Nortestosteron=

epi-Nandrolon

Nandrolon und Nandrolonmetaboliten kommen natürlicherweise bei verschiedenen Spezies endogen vor. Das Vorkommen von endogenem Nandrolon ist abhängig vom Alter des Pferdes, seinem Geschlecht und auch seinem physiologischen Zustand. Hengste produzieren altersabhängig (DUMASIA et. al. 1989) Nortestosteron, das in den Hoden der Tiere nachgewiesen werden kann (DINTINGER et. al. 1989). Verschiedene Metaboliten sind auch im Urin von geschlechtsreifen Hengsten vorhanden (HOUGHTON et. al. 1984). Endogenes epi-Nortestosteron kann im Urin trächtiger Stuten und Ziegen (STERK et. al. 1998) und auch im Urin tragender Schafe gefunden werden (CLOUET et. al. 1997). Nandrolon liegt ebenfalls bei hochtragenden Kühen und neugeborenen Kälbern im Urin in messbaren Konzentrationen vor (MEYER et. al. 1992). Die Ausscheidung von epi-Nortestosteron über die Gallenflüssigkeit bei Rindern konnte ab dem 120ten Trächtigkeitstag nachgewiesen werden (MCEVOY et. al. 1998). Im Urin und Fleisch von unkastrierten Ebern sind nicht unbeträchtliche Mengen Nandrolon vorhanden (DEBRUYCKERE et. al. 1990). Auch bei Männern wurden im Urin geringe Mengen von endogenem Nandrolon gefunden (LE et. al.

2002).

2.2.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften

Die systematische Bezeichnung von Nandrolon ist 17-beta-hydroxyestra-4-en-3-on, mit der chemischen Formel C18H26O2. Synonym wird die Bezeichnung Nortestosteron verwandt. Es hat ein Molekulargewicht von 274,4 Dalton und der Schmelzpunkt liegt im Bereich von 112 bis 124° C. In Alkohol, Äther und Chloroform (WINDHOLZ et. al. 1983) sowie pflanzlichen Ölen ist Nandrolon gut löslich, dagegen nahezu unlöslich in Wasser. Gelöst ist Nandrolon ein injizierbares anaboles Steroid, ungelöst liegt es als weißes bis cremeweißes kristallines Pulver vor. Es ist geschmack- und geruchlos.

2.2.2 Wirkungen und therapeutische Anwendungen

Nandrolon ist ein 19-Norsteroid mit überwiegend anaboler Wirkung und reduzierter androgener Wirkung.

Wirkungen auf den Bewegungsapparat

Die im Rahmen des Einsatzes als Anabolikum genutzte Hauptwirkung von Nandrolon liegt in seinem Einfluss auf die Stickstoffbilianz, die zugunsten einer N-Retention verschoben wird (SNOW 1993). Dies geschieht durch eine Steigerung der Proteinsynthese und Verringerung des Plasmaharnstoffgehaltes (SNOW et. al. 1982a). Eine Stickstoffretention konnte nur bei untrainierten Pferden (SNOW et. al. 1982a), nicht jedoch in mehreren Versuchen an Pferden im Training bestätigt werden (NIMMO et. al. 1982; SNOW et. al. 1982b). Unter Nandrolonmedikation kommt es nach Belastung zu einem Anstieg der Muskelglykogensättigung, die auf erhöhte Ausschüttung von Glucose aus der Leber, erhöhte Plasma - Insulinkonzentrationen und einem erhöhten insulinabhängigen Glukosetransport, nicht aber auf einen besseren Zugriff auf die Fettreserven während der Erholung zurückgeführt werden kann (HYYPPA 2001). In einer früheren Untersuchung hatten Nandrolonphenylpropionat-Injektionen beim Pferd keinen Einfluss auf Massenzunahme, Stickstoff-Retention, Muskelglycogengehalt, Enzymaktivitäten und den Muskelfaserquerschnitt (HYYPPA et. al. 1997; NIMMO et. al. 1982).

Ein Einfluss auf den Muskelfaserquerschnitt konnte jedoch in 2 Versuchen mit Nandrolon- Laurat bzw. Nandrolonphenylpropionat beobachtet werden. Dabei stieg der Querschnitt der langsamen, roten Muskelfasern vom Typ I an (HYYPPA et. al. 1997; NIMMO et. al. 1982), der Anteil der weißen Muskelfasern vom Typ II nahm gleichzeitig ab (HYYPPA et. al. 1997).

Der beschriebene Effekt des vorzeitigen Epiphysenfugenschlusses (KROKER 1994) konnte in einer späteren Untersuchung an zu Versuchsbeginn 5 bis 16 Monate alten Hengsten nicht bestätigt werden. Nach einer lang andauernden Nandrolonapplikation von mindestens 5 Monaten konnte eher eine Verzögerung des Epiphysenfugenschlusses beobachtet werden.

Diese Verzögerung führt zu einer Prädisposition für spätere Knorpelschäden unter Belastung (KOSKINEN u. KATILA 1997).

Ein Effekt von Nandrolon auf die sportliche Leistung im Training konnte in einer Untersuchung von 1982 nicht beobachtet werden (SNOW et. al. 1982b). Auch messbare Parameter der Leistungssteigerung, wie Herzfrequenz, Lactat und Sauerstoffaufnahme blieben nach Steroidapplikation (Boldenon) unbeeinflusst (THORNTON et. al. 1991).

Wirkungen auf den Geschlechtsapparat

Nandrolon besitzt trotz einer für synthetische anabole Steroide typischen reduzierten Affinität für zentrale und in den Geschlechtsorganen sitzende Rezeptoren immer noch androgene Wirkung (SNOW 1993). Dadurch kommt es unter Medikation auch zum Einfluss auf den Geschlechtsapparat.

Nandrolon-Decanoat Injektionen führten beim Hengst zu einer drastischen Reduktion von LH, Testosteron und immunoreaktivem Inhibin im Plasma, außerdem im Interstitum der Hoden zu einer starken Reduktion von immunoreaktivem Inhibin und der Alpha-Untereinheit des Inhibin sowie einer Reduktion der interstitiellen Leydigschen Zwischenzellen. Ein Stopp der bereits fortgeschrittenen Spermatogenenese in den Tubuli seminiferi konnte im histologischen Schnitt beobachtet werden (NAGATA et. al. 1999). Im Versuch an Junghengsten (5 bis 16 Monate) führten Nandrolon-Laurat Injektionen zu einer Reduktion von Testosteron noch 4,5 Monate nach Beenden der Applikation, dieser Effekt war bei einer Untersuchung 2 Jahre später nicht mehr zu bestätigen. Im Rahmen desselben Versuches wurde direkt nach Versuchsende bis zu 4 Monate später eine Reduktion der Spermienbildung

mit einem hohen Anteil funktionsunfähiger Spermien bis zur Azoospermie beobachtet (KOSKINEN et. al. 1997b). Die jüngsten Tiere zeigten im Alter von 24 Monaten noch eine reduzierte Motilität sowie eine höhere Anzahl an morphologisch veränderten Spermien. Die Steroidinjektionen hatten ebenfalls negativen Einfluss auf das Wachstum der Hoden. Obwohl reversibel zeigten zum Teil bis 12 Monate nach Versuchsende noch Tiere eine verringerte Hodengröße (KOSKINEN et. al. 1997a). Diese Einflüsse wurden schon früher bei Hengsten beobachtet. Ein Versuch mit Nandrolon-Decanoat resultierte ebenfalls in einer Reduktion der Spermaqualität (Motilität und Konzentration lebender Spermien), verringerter Hodengröße, bis zu 59 % reduziertem Hodengewicht und niedrigeren LH-Plasmaspiegeln. Die Libido, gemessen an Erektionszeit, Zeit bis zum Aufsprung, Ejektionszeit und Anzahl der Ejektionen war hingegen unbeeinflusst (SQUIRES et. al. 1982).

Mit Nandrolon-Decanoat behandelte Stuten zeigten in der auf den Versuch folgenden Zuchtsaison weniger Brunstsymptome und eine kürzere Rosse als unbehandelte Stuten. Sie zeigten bis 6 Monate nach Beenden der Medikation ein stark auffälliges Sexualverhalten, das auch schon während des Nandrolonapplikation zu beobachten war. Obwohl alle Tiere ovulierten und die Zeit bis zur ersten Ovulation gleich war, waren bei mit Nandrolon behandelten Tieren bis zu 6 Monate nach Absetzen negative Einflüsse auf Ovargröße, Follikelentwicklung und den Eileiter zu beobachten (SQUIRES et. al. 1985).

Sonstige Wirkungen von Nandrolon

Nandrolon hat eine starke Wirkung auf die Erythropoese bei Patienten mit bestimmten Anämien, vor allem sekundäre Anämien infolge einer chronischen Niereninsuffizienz (ALEXANDER 1976; DOANE et. al. 1975) und aplastischen Anämien (SEEWALD et. al.

1989). Auch die Behandlung einer iatrogen hervorgerufenen aplastischen Anämie eines Hundes konnte mit Nandrolon positiv beeinflusst werden (VAN KRUININGEN u.

FRIEDLAND 1987).

In der Schweiz ist Nandrolon zur Behandlung nachgewiesener Osteoporose bei postmenopausalen Frauen und zur unterstützenden Behandlung von Augenerkrankungen zugelassen (MORANT u. RUPPANNER 2000).

Bei Anwendung nach Operationen wird der Metabolismus vor allem durch eine erhöhte Nahrungsaufnahme durch gesteigerten Appetit positiv beeinflusst. Die Glukoneogeneserate und der Aminosäuregehalt im Plasma steigen an. Ebenfalls Anwendung findet Nandrolon als begleitendes Medikament bei lang andauernder Kortikosteroidtherapie, um deren katabolen Nebenwirkungen zu reduzieren (SNOW 1993).

Weitere eher unerwünschte Wirkungen von anabolen Steroiden sind Erhöhung des Blutdruckes, Hypertrophie des Herzmuskels ohne ausreichende Ausweitung der Blutversorgung des Herzens und Erhöhung der Ausbildung von Leberdysfunktionen (PETERS et. al. 2001).

Dosierung und Art der Anwendung

Nandrolon wird kommerziell in veresterter Form z. B. als Laurat und Decanoat in Form von Injektionslösungen angeboten, da bei diesen Estern eine längere Wirkdauer erzielt wird (DYKE 1993). Eine Zulassung für das Pferd besteht in Deutschland zurzeit nicht. In Deutschland ist Nandrolon als Nandrolon-Laurat im Präparat Laurabolin^® (Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) beim Hund zugelassen, um Tiere in der Rekonvaleszenz nach schweren Operationen und bei schweren Erkrankungen wie Muskeldystrophie, Leber und Nierenkrankheiten, die mit einer stark katabolen Stoffwechsellage einhergehen, zu unterstützen (KROKER 1994). International findet Laurabolin Anwendung bei Hund, Katze, Pferd, Schwein und Rind.

Die Dosierung wird für Hund, Katze und Pferd mit 1 mg/kg KM i. m. alle ein bis vier Wochen, je nach Indikation und Schwere der Erkrankung angegeben (SNOW et. al. 1982a).

2.2.3 Pharmakokinetik

Nandrolon zur intramuskulären Injektion ist zur Verlängerung der Resorptionszeit an der 17- Hydroxyl-Gruppe verestert. Je länger die Esterkette ist, desto länger dauert die Resorption aus der Muskulatur. Ist der Wirkstoff in den Blutkreislauf absorbiert, wird er schnell hydrolysiert und so in die eigentlich aktive Form überführt (SNOW 1993).

Im Plasma des Pferdes liegt Nortestosteron nahezu vollständig unkonjugiert, d. h. weder sulfatiert noch glucuronidiert vor. Andere im Pferdeblut vorhandene androgene Steroide sind das 5a-androstan-3,17-dion, Androsteron, Etiocholanolon; nicht nachweisbar dagegen sind Dehydrotestosteron, Estrandiol, Estrendiol, Norandrosteron und Epi-Testosteron. Die Konzentration von Nandrolon im Hengstblut beträgt durchschnittlich 0,31 ng/ml (HORNING et. al. 1995).

In einer Studie von 1984 wurden die Phase I und Phase II Biotransformation von 19- Nortestosteron beim Wallach untersucht. In dieser Studie schieden die Tiere über 60% des verabreichten Nandrolons innerhalb von 24 mit dem Urin aus. Mehr als 90% lag im Urin als wasserlösliche Metaboliten vor (DUMASIA u. HOUGHTON 1984).

Die Hauptwege der Biotransformation von Nandrolon nach DUMASIA und HOUGHTON (1984) sowie ANIELSKI (pers. Mitteilung) sind in Abbildung 6 dargestellt.

Zusammengefasst wird in der Phase 1-Reaktion die 3-oxo Gruppe im 1. Ring reduziert, die Hydroxylgruppe am C-17 kann stereochemischen Änderungen unterliegen und kann oxidiert werden. Beim Pferd kommt es außerdem zu einer Oxidation am C-16.

Der Hauptweg für den Phase II Metabolismus ist die Glucuronidierung (zwischen 53% und 59%). Bei etwa 30% der Metaboliten findet eine Sulfatierung statt. Bei den am C-17 hydroxylierten Verbindungen werden die 17a-Isomere überwiegend glucuronidiert, wohingegen die 17ß-Isomere überwiegend sulfatiert werden. Hauptmetabolit beim Wallach ist das 5a-estran,3ß,17a-diol (im Folgenden 5-Estran-diol) (DUMASIA u. HOUGHTON 1984; HOUGHTON 1977; HOUGHTON u. DUMASIA 1980). Dieser Metabolit, Nandrolon selbst und ein weiterer Metabolit, das 5(10)-Estren-3a,17ß-diol (im Folgenden 5-Estren-diol), können auch im Urin von unbehandelten geschlechtsreifen Hengsten nachgewiesen werden (HOUGHTON et. al. 1984). Das 5-Estren-diol konnte jedoch in keiner Untersuchung beim mit Nandrolon behandelten Wallach nachgewiesen werden, so dass man davon ausgehen kann, dass es nicht zu den Metaboliten der Biotransformation nach einer Nandrolonapplikation gehört.

Inzwischen sind für den Einsatz im Humanbereich eine ganze Reihe Nahrungsergänzungsmittel mit Nandrolon-Precursorn im Handel. Eine Untersuchung mit diesen oral zu verabreichenden Zusatzstoffen an Pferden ergab einen massiven Anstieg der auch nach Nandroloninjektionen zu verzeichnenden Urinmetaboliten (DEHENNIN et. al.

2002).

CH3

H

OH

O H

H

CH₃

H

O

O H

O

CH₃

H

OH

O

CH₃

H

OH

CH₃

H

OH

O H

H

OH

CH₃

H

OH OH O

CH₃

H

O 2 ¹

3 4

5 6

7 8 9 10

11 12

13

14 15

1716

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

Nandrolon

epi-Norandrosteron

5a-Estran-3ß,17a-diol

epi-Nandrolon

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

5a-Estran-3ß,17ß-diol Reduktion der 3-oxo-Gruppe und

Oxidation am C-17 mit Bildung einer 17-oxo-Verbindung

Epimerisierung der Hydroxylgruppe am C-17

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

5-Estran-3,16,17-triol Oxidation am C-16

Ausscheidung überwiegend renal Sulfatierung

Glucuronidierung Sulfatierung

oder unkonjugiert (wenig)

Glucuronidierung oder

unkonjugiert (wenig)

Glucuronidierung Glucuronidierung

1 2

3

4 5

6 7 8 9 10

11 12

13

14 15

16 17

4-Estren-3,17-dion Oxidation am C-17 mit Bildung einer 17-oxo-Verbindung

unkonjugiert

Reduktion der 3-oxo-Gruppe und Änderung der Stereo- chemie des Wasserstoffatomes am C-3

Abb. 6: Stoffwechselwege der Phase I und Phase II Biotransformation von Nandrolon (nach DUMASIA u. HOUGHTON 1984 und ANIELSKI, pers. Mitteilung)

2.3 Nachweis von Clenbuterol und Nandrolon beim Pferd

Bei der Dopinganalytik unterscheidet man zwischen Screening-Verfahren, die bei ausreichender Sensitivität schnell mit großen Probenzahlen und möglichst hoher Anzahl an identifizierbaren Analyten pro Untersuchung, bei geringem Probenvorbereitungsbedarf und hoher Automatisierungsmöglichkeit durchgeführt werden, und Verfahren zur Bestätigung des Vorhandenseins von Einzelsubstanzen. Wird bei einer Screening-Untersuchung eine verdächtige Substanz erkannt, so wird das Vorhandensein dieser in einer substanzspezifischeren zweiten Untersuchung bestätigt (SCHÄNZER 2000). Zum Nachweis der Applikation von Wirkstoffen werden diverse Untersuchungsverfahren in unterschiedlichen Kombinationen eingesetzt. Man unterscheidet zwischen der Vorbereitung der Proben, in denen die jeweiligen Wirkstoffe und Metaboliten aus dem Untersuchungsmedium isoliert und für die anschließende Messung vorbereitet werden und der eigentlichen analytischen Bestimmung Zur Probenvorbereitung werden verschieden Reinigungsprozeduren (mit neutralen oder alkalischen Lösungen), Extraktionen (Fest- und Flüssigextraktionen sowie Kombinationen daraus) und wenn nötig auch Auftrennungen über diverse Chromatographien durchgeführt. Die Messung erfolgt anschließend über Massenspectrometrie oder in Immunoassays (SCHÄNZER 2000). Schematisch ist ein Analysengang in Abb. 7 aufgeführt.

Der Nachweis einer Anwendung von Clenbuterol und Nandrolon im Rahmen von Dopinguntersuchungen wird beim Pferd bislang hauptsächlich durch Untersuchung von Urin oder Blutproben durchgeführt, dabei macht der Anteil der Urinproben an den durch die Deutsche Reiterliche Vereinigung veranlassten Dopinguntersuchungen etwa 17% aus (DÜE 1998). Sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin werden schon seit Ende der siebziger Jahre vermehrt Untersuchungen zum Nachweis unerlaubter Substanzen im Haar durchgeführt (NAKAHARA 1999) und z. T. zum Nachweis der unerlaubten Anwendung und Einnahme von Substanzen sowohl in der Dopinganalytik wie auch in forensischen Fällen eingesetzt (DUPONT u. BAUMGARTNER 1995).

Abb. 7: Schematische Darstellung des Analysenganges einer Dopingprobe (nach SCHÄNZER 2000)

Probenmaterial

Reinigung:

z. B. mit alkalischen oder neutralen Lösungen

Aufspaltung:

z. B. über Hydrolysen, mechanische Zerkleinerung

Extraktion:

z. B. Fest- oder Flüssigphasenextraktionen

Auftrennung in Fraktionen:

z. B. Flüssigkeitschromatographie

Derivatisierung:

z. B. mit IODISIL oder MSTFA

Messung:

z. B. GC/MS, MS/MS, UV-Detection, ELISA

2.3.1 Nachweis von Clenbuterol

Da es sich bei Clenbuterol um einen synthetisch hergestellten Wirkstoff handelt, der nicht endogen produziert wird, kann bei einem Nachweis von Clenbuterol in jeglichem Köpergewebe von einer exogenen Zufuhr ausgegangen werden. Jedoch bedeutet ein Nachweis von Clenbuterol beim Pferd nicht zwingend einen illegalen Einsatz des Medikamentes, da Clenbuterol zur Behandlung von Lungenerkrankungen und zur Tokolyse in Deutschland beim Pferd zugelassen ist.

Nach intratrachealer Applikation kann Clenbuterol schon nach 10 Minuten (LEHNER et. al.

2001) und bis zu 36 h im Urin nachgewiesen werden (VAN EENOO et. al. 2002).

Die Zeit, in der Clenbuterol im Plasma bzw. im Urin nachgewiesen werden kann, hängt neben den tierartlichen Unterschieden und den unterschiedlichen Applikationsschemata auch von der Nachweisgrenze der Untersuchung ab. Die in der Literatur angegebenen Nachweiszeiten von Clenbuterol in Blut und Urin des Pferdes nach oraler oder intravenöser Gabe sind daher sehr unterschiedlich. Einen Überblick über die verschiedenen Zeiten ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Clenbuterol kann nicht nur in Blut oder Urin, sondern auch in vielen anderen Geweben nachgewiesen werden. In Rahmen von Versuchen an verschiedenen Tierarten, die der Lebensmittelgewinnung dienen, konnte Clenbuterol in Muskulatur, Fettgewebe, Lunge, Leber, Nieren, Milz und Thymus sowie Augen, Federn, Haare und weiteren Körperteilen nachgewiesen werden (BLANCHFLOWER et. al. 1993; BRAMBILLA et. al. 1994;

ELLIOTT et. al. 1995; MALUCELLI et. al. 1994; MEYER u. RINKE 1991).

Die starke Anreicherung im Bereich der Augen wurde auch in vitro untersucht. Dabei wurde eine besonders starke Akkumulation in der Retina beobachtet (DÜRSCH et. al. 1995). Dies wurde nochmals in vivo bestätigt, wobei festgestellt wurde, dass sich die maximalen Konzentrationen in der Chorioidea und den melaninhaltigen Anteilen der Retina befanden.

Daraus wurde auf eine spezifische Anreicherung in stark melaninhaltigen Geweben geschlossen (SAUER u. ANDERSON 1994).

Tabelle 1: Nachweiszeiten für Clenbuterol in Blut und Urin des Pferdes nach verschiedenen Applikationsweisen

Applika-

tionsart Dosierung

Untersu- chungs- medium

Nachweis- zeiten

Analysen-

methode Quelle

oral

10 Tage, 0,8µg/kg

KM

Urin

Nachweis nach 5 Tagen

negative, am 10. Tag jedoch

wieder positiv bis Tag 11

ELISA und GC- MS; LOD* für GC-MS 1ng/ml

(HARKINS et.

al. 2001)

oral

10 Tage, 0,8µg/kg

KM

Blut Blut

>72 aber <96h LC-MS/MS;

LOD*: 4pg/ml Serum

(LEHNER et.

al. 2001)

Oral

5,5 Tage 2x täglich 0,8 µg/kg KM

Blut Urin

96 h 16 -21 Tage

GC-HRMS;

LOD*: 0,03 ng/ml

(SEINSCH 1997)

Oral

5,5 Tage 2x täglich 0,8 µg/kg KM

Blut 96 h GC-MS (KALLINGS

et. al. 1991)

Oral 4 bzw. 8

Tage 800 µg Urin 72 bis 96 h GC-MS

(DUMASIA u.

HOUGHTON 1991) Oral einmalig

0,8µg/kg

Blut Urin

48 h

> 81 h

GC-HRMS;

LOD*: 0,03 ng/ml

(SEINSCH 1997)

Oral einmalig 0,8µg/kg

Blut Urin

48 h 75 h

HPLC – ELISA;

LOD*: 40 pg/ml

(HAGEDORN et. al. 1995)

i. v. einmalig 0,8µg/kg

Blut Urin

24 h 96 h

HPLC – ELISA;

LOD*: 40 pg/ml

(HAGEDORN et. al. 1995) intra-

tracheal

einmalig

90µg Blut über 24 h

LC-MS/MS;

LOD*: 4pg/ml Serum

(LEHNER et.

al. 2001) Blut

Urin

96 h 288 h

LC-MS; LOD*:

13pg/ml Plasma, 500pg/ml Urin

(GUAN et. al.

2002)

*LOD = Nachweisgrenze

Clenbuterol wurde erstmals im Haar von Ratten nachgewiesen (ADAM et. al. 1994). In den Folgenden Jahren wurden viele Projekte zum Nachweis von Clenbuterol in den Haaren von Menschen (ADAM et. al. 1994; ELLIOTT et. al. 1995; FENTE et. al. 1999; GAILLARD et.

al. 1997; HAASNOOT et. al. 1998; MACHNIK et. al. 1999; POLETTINI et. al. 1995), und anderen Tieren sowie den Federn von Hühnern (MALUCELLI et. al. 1994) durchgeführt.

Auch im Haar lagert sich Clenbuterol verstärkt in pigmentreichen Haaren an (GLEIXNER et. al. 1996; SAUER u. ANDERSON 1994). Erste Untersuchungen bestätigten die Vermutung, dass Clenbuterol auch im Langhaar von Pferden nachweisbar ist (POPOT et. al.

2000; SCHLUPP et. al. 2003). Vor allem zum Nachweis von lang andauernder und länger zurückliegender Clenbuterolapplikation wurde die Haaranalyse eingesetzt (GLEIXNER et. al.

1996; KINTZ et. al. 2000; MACHNIK et. al. 1999).

2.3.2 Nachweis von Nandrolon

Da Nandrolon und Nandrolonmetaboliten zu einem hohen Anteil in der Phase II-Reaktion der Biotransformation sulfatiert oder glucuronidiert werden, müssen in Urin- und Plasmaproben bei der Analyse sowohl die Glucuronid-Fraktion als auch die Sulfatfraktion berücksichtigt werden. Nach DUMASIA u. HOUGHTON (1984) und den Ergebnissen eigener Untersuchungen ergibt sich im Plasma von Wallachen, die mit Nandrolon-Laurat behandelt wurden, das in Tab. 2 dargestellte Haupt-Metabolitenmuster und die Verteilung auf die entsprechenden Fraktionen. Im Urin von diesen Wallachen werden überwiegend die in Tab. 3 genannten Metaboliten ausgeschieden. Dabei handelt es sich um die auch im Blut nachweisbaren Metaboliten Nandrolon, epi-Nandrolon, 5-Estran-diol und epi- Norandrosteron. Zusätzlich wird beim Wallach aber auch 4-Estren-3,17-dion (4-Estren-dion) ausgeschieden (ANIELSKI, pers. Mitteilung).

Tabelle 2: Haupt-Plasma-Metaboliten von mit Nandrolon-Laurat behandelten

Wallachen (nach DUMASIA u. HOUGHTON 1984 und ANIELSKI, pers. Mitteilung) Fraktion

Substanz

Masse

(TMS) frei glucuronid sulfat

Nandrolon 418 X

5a-Estran-3ß,17a-diol 422/332 X

epi-Norandrosteron 420 X

epi-Nandrolon 418 X

Masse (TMS): Masse des Metaboliten inclusive des TMS

Tabelle 3: Haupt-Urin-Metaboliten von Wallachen nach Verabreichung von Nandrolon- Laurat (nach DUMASIA u. HOUGHTON 1984 und ANIELSKI, pers. Mitteilung)

Fraktion

Substanz Masse

(TMS) frei glucuronid sulfat

Nandrolon 418 wenig X

epi-Nandrolon 418 X

5a-Estran-3ß,17a-diol 422/332 X

epi-Norandrosteron 420 X wenig

4-Estren-3,17-dion 416 X

Masse (TMS): Masse des Metaboliten inclusive des TMS

Der Beurteilung eines Nachweises von Nandrolon beim Pferd ist nicht unproblematisch, da durch frühere Untersuchungen gesichert ist, dass Nandrolon und Nandrolonmetaboliten beim unkastrierten Pferd endogen vorkommen (HOUGHTON et. al. 1984; STERK et. al. 1998).

Wie bereits beschrieben, gibt es jedoch beim Hengst einen endogenen Nandrolonmetaboliten, der durch die Applikation von Nandrolon unbeeinflusst bleibt, so dass dieser als Referenz der endogenen Produktion dienen kann (HOUGHTON et. al. 1986b).

Durch Ermittlung des Quotienten aus den Konzentrationen des Metaboliten 5-Estran-diol und des durch eine Nandrolon-Gabe unbeeinflussten Metaboliten 5-Estren-diol kann eine Medikation mit Nandrolon nachgewiesen werden. Messungen an 2 behandelten Pferden ergaben einen Anstieg des Quotienten ab 24 h nach Injektion von Nandrolonphenylpropionat.

Der vorher bei unter 0,1 liegende Quotient stieg innerhalb von 48 h auf Werte von über 12 bzw. sogar über 145 und blieb bis 30 Tage später noch erhöht (HOUGHTON et. al. 1986a).

Bei einem Quotienten größer als 1 kann von einer exogenen Zufuhr von Nandrolon ausgegangen werden (HOUGHTON 1992).

Tabelle 4: Nachweiszeiten für Nandrolon in Blut und Urin des Pferdes nach einmaliger intramuskulärer Injektion verschiedener Metaboliten

Metabolit Dosierung

Untersu- chungs- medium

Nachweis- zeiten

Analysen-

methode Quelle Nandrolon-

phenyl- propionat

400 mg Urin > 14 Tage RIA (JONDORF u.

MOSS 1978) Nandrolon-

cyclohexyl- propionat

100 mg Urin > 10 Tage RIA (JONDORF u.

MOSS 1978) Nandrolon-

laurat 200 mg Urin > 50 Tage RIA (JONDORF u.

MOSS 1978) Nandrolon-

laurat 300 mg Blut

53 Tage (LOD 0,02

ng/ml)

GC/HRMS (SEINSCH et.

al. 1999) Nandrolon-

laurat 300 mg Urin

79 Tage (LOD 0,02

ng/ml)

GC/HRMS (SEINSCH et.

al. 1999) Nandrolon-

decanoat 400 mg Blut 23 Tage HPLC/MS/

MS

(KIM et. al.

2000)

*LOD = Nachweisgrenze

In einer Messung bei 13 Hengsten lag die endogene Konzentration von unkonjugiertem Nandrolon im Blut bei 0,3 ng/ml (HORNING et. al. 1995). Mehrfache wöchentliche Injektionen von Nandrolonphenylpropionat führten zu einer Nachweisbarkeit im Blut von 23 und im Urin von 25 Tagen, damit wurde eine Empfehlung für die Absetzfrist von Nandrolonphenylpropionat-Injektionen an Pferde vor dem Rennen von mindestens 42 Tagen gegeben (CHAPMAN et. al. 1982).

Die in den letzten Jahren in hohem Maße weiterentwickelte Haaranalytik, die auch beim Pferd die Identifizierung verabreichter Substanzen, wie diverse Antibiotika, Morphin, Diazepam und auch Clenbuterol erlaubt (DUNNETT 2002; POPOT et. al. 2000; WHITTEM et. al. 1998), wurde bislang noch nicht auf den Nachweis von anabolen Steroiden beim Pferd angewandt. Untersuchungen bei anderen Spezies kamen zu unterschiedlichen Ergebnissen.

Eine viermalige Injektion von Nandrolon-Decanoat konnte durch eine Haaranalytik eindeutig festgestellt werden, jedoch weder eine einmalige Injektion von Nandrolon Decanoat beim