Die Rolle der NAD(P)H-Oxidase und ihrer Untereinheit p47phox für das linksventrikuläre Remodeling, die linksventrikuläre Dysfunktion und das Überleben nach Myokardinfarkt

Aus dem Institut für Pharmakologie,Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

der Abteilung Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover

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Die Rolle der NAD(P)H-Oxidase und ihrer Untereinheit p47^phox

für das linksventrikuläre Remodeling, die linksventrikuläre Dysfunktion und das Überleben

nach Myokardinfarkt

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Carola Dörries

aus Jena

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann PD Dr. med. Ulf Landmesser

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2006

Meiner Mutter gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ... 1

2. LITERATURÜBERSICHT ... 3

2.1 Myokardinfarkt... 3

2.1.1 Definition und Ursachen ... 3

2.1.2 Remodeling ... 3

2.1.3 Auswirkungen auf die Herzfunktion ... 5

2.2 Herzinsuffizienz ... 5

2.2.1 Definition und Ursachen ... 5

2.2.2 Pathogenese und bedeutende Kompensationsmechanismen... 6

2.3 Reaktive Sauerstoffspezies... 9

2.3.1 Definition und Aufgaben... 9

2.3.2 Superoxidanionradikal, Hydroxylradikal, Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit... 10

2.3.3 Herkunft von reaktiven Sauerstoffspezies... 11

2.3.4 RSS in Beziehung zu kardialem Remodeling und Herzinsuffizienz... 13

2.4 NAD(P)H-Oxidase ... 15

2.4.1 Aufbau, Aufgabe ... 15

2.4.2 NAD(P)H-Oxidase und kardiale Hypertrophie... 18

2.4.3 NAD(P)H-Oxidase und kardiale Fibrose ... 19

2.4.4 NAD(P)H-Oxidase im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt... 19

2.5 Matrixmetalloproteinasen... 20

2.6 Apoptose... 22

2.7 Tiermodell ... 24

2.8 Fragestellung ... 26

3. METHODEN ... 27

3.1 Verbrauchsmaterialien ... 27

3.2 Tiere ... 28

3.2.1 Versuchstiere... 28

3.2.2 Haltung und Fütterung ... 29

3.3 Genotypisierung ... 30

3.4 Infarktmodell ... 33

3.5 Echokardiographie ... 36

3.6 Probenentnahme ... 37

3.7 Paraffineinbettung und Herstellung von Gewebeschnitten ... 39

3.8 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 40

3.9 Siriusrot-Färbung ... 41

3.10 Bestimmung der Infarktgröße ... 42

3.11 Bestimmung der Kardiomyozytenquerschnittsfläche ... 42

3.12 RNA-Extraktion ... 43

3.13 Northern-Blot ... 44

3.14 Bestimmung des Kollagengehaltes (Siriusrot) ... 50

3.15 Proteinbestimmung für die ESR-Methode ... 51

3.16 Bestimmung der NAD(P)H- und Xanthinoxidaseaktivität mit der Elektronenspinresonanzspektroskopie ... 52

3.17 Chemilumineszenzmessung von Superoxid... 56

3.18 Messung der zellulären Superoxidproduktion mit der Dihydroethidium-Färbung .. 58

3.19 Proteinbestimmung für die Zymographie und für den Western-Blot ... 59

3.20 Zymographie ... 61

3.21 TUNEL-Assay... 64

3.22 Western-Blot ... 67

3.23 Statistik... 72

4. ERGEBNISSE ... 73

4.1 Genotypisierung ... 73

4.2 Infarktgröße ... 73

4.3 NAD(P)H-Oxidaseaktivität ... 73

4.4 Xanthinoxidaseaktivität... 75

4.5 Myokardiale Superoxidproduktion ... 76

4.6 Echokardiographie ... 78

4.7 Hypertrophie und Fibrose... 80

4.8 Apoptose... 83

4.9 MMP-Expression ... 85

4.10 Überleben ... 88

5. DISKUSSION ... 90

5.1 Superoxidproduktion ... 90

5.2 NAD(P)H-Oxidaseaktivität ... 91

5.3 Xanthinoxidaseaktivität... 93

5.4 Hypertrophie, Fibrose und Herzfunktion ... 94

5.5 Apoptose... 98

5.6 Matrixmetalloproteinasen... 100

5.7 Ausblick ... 102

6. ZUSAMMENFASSUNG ... 104

7. SUMMARY... 106

8. LITERATUR ... 108

9. VORAB VERÖFFENTLICHTE TEILERGEBNISSE DIESER ARBEIT... 131

10. DANKSAGUNG ... 132

Abkürzungsverzeichnis

β-MHC beta-Myosin Heavy Chain

ANP Atriales Natriuretisches Peptid

Aqua bidest. Aqua bidestillata

(zweifach destilliertes Wasser)

AT1-Rezeptoren Angiotensin-1-Rezeptoren

AT2-Rezeptoren Angiotensin-2-Rezeptoren

ATP Adenosintriphosphat

atriale MLC atriale Myosin Light Chain

bzw. beziehungsweise

ca. circa

Cu/Zn-SOD Kupfer/Zink-Superoxiddismutase

DDC Dopadecarboxylasehemmer

d.h. das heißt

DHE Dihydroethidium

DMTU Dimethylthiourea

DNA Desoxyribonukleinsäure

(desoxyribonucleic acid)

e^- Elektron

eNOS endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase

ESR Elektronenspinresonanzspektroskopie

et al. et alii oder et aliae (und andere)

FAD Flavinadenindinukleotid

Fe²⁺ zweiwertiges Eisenion

Fe³⁺ dreiwertiges Eisenion

GDP Guanosindiphosphat

GTP Guanosintriphosphat

H⁺ Wasserstoffion

H₂O Wasser

H₂O₂ Wasserstoffperoxid

i.d.R. in der Regel

Kb Kilobasen

kDa Kilodalton

KG Körpergewicht

LV linksventrikulär

M Molar

MHz Megahertz

MI Myokardinfarkt

MMP Matrixmetalloproteinase

mRNA Botenribonukleinsäure

(messenger ribonucleic acid)

N Normal

NADH Nicotinamidadenindinukleotid

NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

NAD(P)H-Oxidase Nicotinamidadenindinukleotidphosphat-

Oxidase

NO Stickstoffmonoxid

NO-Synthase Stickstoffmonoxid-Synthase

NOX NAD(P)H-Oxidase

NOX2 Synonym für die Untereinheit gp91^phox der

NAD(P)H-Oxidase

n.s. nicht signifikant

O₂ molekularer Sauerstoff

O₂^.- Superoxidanionradikal

OH^- Hydroxylanion

OH^. Hydroxylradikal

ONOO^- Peroxynitrit

p47^phox-/- p47^phox-defiziente

PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

(phosphate buffered saline)

pre-pro-ANF pre-pro-Atrialer-Natriuretischer-Faktor

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

rpm Rotation pro Minute

RSS reaktive Sauerstoffspezies

sham kontrolloperiert

SOD Superoxiddismutase

TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha

TUNEL-Assay Terminal Deoxynucleotide Transferase dUTP

Nick End Labeling-Assay

u.a. unter anderem

v.a. vor allem

vs. versus

WT Wildtyp

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

Einleitung 1

1. Einleitung

Die Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt stellt heute ein bedeutendes medizinisches Problem dar und geht mit einer ungünstigen Prognose einher. Männer und Frauen über 40 Jahre besitzen ein gleich hohes Risiko im Laufe ihres weiteren Lebens eine Herzinsuffizienz zu bekommen, welche bei ungefähr 20 % liegt (LLOYD-JONES et al., 2002). Dabei stehen Hypertonie und Myokardinfarkt als Ursachen im Vordergrund, sie machen drei Viertel des populationsbezogenen Herzinsuffizienzrisikos aus (YUSUF u. PITT, 2002). Unter den 20 häufigsten Diagnosen, die in Deutschland 2004 in Krankenhäusern ermittelt wurden, nahm bei Männern die Herzinsuffizienz Platz 9, und bei Frauen sogar Platz 4 ein (STATISTISCHES-BUNDESAMT-DEUTSCHLAND, 2004). Trotz moderner Behandlungsmethoden ist die Herzinsuffizienz durch eine hohe Mortalitätsrate gekennzeichnet, die 5-Jahresüberlebensrate beträgt ca. 50 % (GUSTAFSSON et al., 2003).

Bei Haustieren spielt die Herzinsuffizienz ebenso als Erkrankung eine wichtige Rolle, wenn auch der Myokardinfarkt als Ursache, im Gegensatz zum Menschen, sehr selten in Erscheinung tritt (DIRKSEN et al., 2002, FREUDIGER et al., 1997).

Um das Ausmaß der Herzinsuffizienz, die sich im Anschluß an einen Myokardinfarkt entwickelt, zu begrenzen, ist die gegenwärtige Forschung ständig bemüht, neue Ansatzpunkte für verbesserte Therapiestrategien zu untersuchen. Dabei sind die Erhöhung der Lebensqualität und die Senkung der Sterberate als Hauptziele anzusehen.

Nach dem Myokardinfarkt setzt das sogenannte Remodeling des Herzens ein, d.h., es kommt zum Umbau des Ventrikels hinsichtlich Struktur, Form und Größe (SWYNGHEDAUW, 1999). Weiterhin weist das Herz Funktionseinschränkungen auf. Besonders das Remodeling des linken Ventrikels gilt als ein wichtiger Prozeß für die Progression der Herzinsuffizienz (MANN, 1999, PFEFFER u. BRAUNWALD, 1990). Bei der experimentellen Herzinsuffizienz ist eine erheblich gesteigerte myokardiale Produktion reaktiver Sauerstoffspezies zu beobachten, welche das ventrikuläre Remodeling ungünstig beeinflußt (KINUGAWA et al., 2000). Das Enzymsystem NAD(P)H-Oxidase bildet Superoxidanionradikale, die zu den reaktiven Sauerstoffspezies gehören. Die Expression der NAD(P)H-Oxidase im Myokard sowie ihre Aktivitätserhöhung bei Patienten mit

Einleitung 2

Herzinsuffizienz sind beschrieben (HEYMES et al., 2003, MAACK et al., 2003). Mit dieser Studie soll die pathophysiologische Bedeutung der NAD(P)H-Oxidase, und insbesondere die ihrer Untereinheit p47^phox, für die Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt anhand eines Tiermodelles charakterisiert werden. Um das Untersuchungsziel zu verwirklichen, erfolgt die Gegenüberstellung von Wildtyp- und p47^phox-defizienten Mäusen nach Myokardinfarktoperation. Das linksventrikuläre Remodeling und die linksventrikuläre Funktion nach Myokardinfarkt der Mäuse sollen mit Hilfe von Sauerstoffradikal-erfassenden, histomorphologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht, sowie die Überlebensrate ermittelt werden.

Literaturübersicht 3

2. Literaturübersicht

2.1 Myokardinfarkt

2.1.1 Definition und Ursachen

Bei einem Myokardinfarkt handelt es sich um eine Nekrose eines umschriebenen Herzmuskelbezirkes, welche durch eine längerfristige Ischämie entsteht (ERDMANN, 2006, S. 36). Ursache des Herzinfarktes kann eine anhaltende kritische Mangeldurchblutung bei Koronarinsuffizienz, bei Koronargefäßspasmen sowie im Bereich einer vorbestehenden exzentrischen Koronarstenose sein. Ein Herzinfarkt bildet sich, insbesondere bei einer akuten Unterbrechung der Blutversorgung des Koronargefäßes, durch thrombotischen Verschluß (WIESNER u. RIBBECK, 2000). Die Zeitdauer des Koronarverschlusses, das Ausmaß der koronaren Herzkrankheit, der Sauerstoffverbrauch zum Zeitpunkt des Verschlusses und der Kollateralisierungsgrad bestimmen die Infarktgröße. Der Beginn des Infarktes ist subendokardial im Zentrum des Versorgungsgebietes der Koronararterie, danach findet eine Ausbreitung in den Innenschichten und anschließend zum Epikard statt. Seine endgültige Größe wird erst nach einigen Stunden erreicht (ERDMANN, 2006, S. 36, 101). Am linken Ventrikel wird die Infarktgröße folgendermaßen klassifiziert: klein (weniger als 10 % der Oberfläche des linken Ventrikels), mittel (10 bis 30 % der Oberfläche des linken Ventrikels) und groß (über 30 % der Oberfläche des linken Ventrikels). Nach dem pathologischen Erscheinungsbild werden akute (6 Stunden bis zu 7 Tagen), sich in Heilung befindende (7 bis zu 28 Tagen) und geheilte (29 Tage und älter) Infarkte unterschieden (ANON., 2000).

2.1.2 Remodeling

Sofort nach dem Auftreten des Myokardinfarktes beginnen sich Größe, Form und Struktur des infarzierten, sowie später des nichtinfarzierten Bereiches des Ventrikels zu ändern. Es wird vom myokardialen Remodeling gesprochen, welches nach Infarkt asymmetrisch verläuft (SWYNGHEDAUW, 1999).

Der segmentale Verlust an kontraktiler Masse, meistens durch eine Koagulationsnekrose, führt i.d.R. bei großen transmuralen Infarkten innerhalb der 1. Woche zu Dehnung und

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Ausdünnung des Infarktgebietes, was auch als Expansion bezeichnet wird (PFEFFER u.

BRAUNWALD, 1990, HUTCHINS u. BULKLEY, 1978). Patienten, die eine Infarktexpansion aufweisen, besitzen eine höhere Prädisposition für das Auftreten von Aneurysmen, Myokardrupturen und für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz (SCHUSTER u. BULKLEY, 1979, JUGDUTT u. MICHOROWSKI, 1987, ERLEBACHER et al., 1982).

An eine Infarktexpansion schließt sich eine fortschreitende Erweiterung des nichtinfarzierten Ventrikelabschnittes an, die abhängig von der Größe des Infarktes, von der Infarktheilung und von der ventrikulären Wandbelastung ist (PFEFFER u. BRAUNWALD, 1990). Im infarzierten Ventrikel liegt die größte Wandbeanspruchung an der Grenze zwischen infarziertem und nichtinfarziertem Myokard (BOGEN et al., 1980). Die Dilatation des Ventrikels kann als Kompensationsmechanismus im Hinblick auf die Dysfunktion des Ventrikels verstanden werden, um das Schlagvolumen trotz abnehmender Ejektionsfraktion aufrechtzuerhalten (PFEFFER u. BRAUNWALD, 1990). Außerdem setzen eine Hypertrophie und Fibrose des verbleibenden nichtinfarzierten Restmyokards ein. Dadurch wird zunächst die Kontraktionskraft gesteigert und, entsprechend dem La-Place-Gesetz, die Wandspannung gemindert. Trotzdem kann die Hypertrophie später zur Maladaptation werden und das Fortschreiten der Herzinsuffizienz begünstigen, indem durch eine relative Abnahme der Kapillardichte in Relation zur Kardiomyozytenmasse eine Ischämie und eine Verminderung der Koronarreserve eintreten (BREISCH et al., 1984, CANNON et al., 1987). Das anfänglich bestehende Gleichgewicht zwischen der kompensatorischen Dilatation und der Hypertrophie des Ventrikels gerät schnell ins Wanken, was Auswirkungen auf das Füllungsvolumen des Herzens hat und die ventrikuläre Erweiterung und Dysfunktion vorantreibt (PFEFFER u.

BRAUNWALD, 1990). Neben der kardiomyozytären Hypertrophie kommt es im nichtinfarzierten Myokard zu Nekrosen und Apoptosen, die eine weitere Progression der Herzinsuffizienz fördern (TAN et al., 1991, OLIVETTI et al., 1997).

Die nekrotischen Herzmuskelzellen des Infarktgebietes bewirken schon während der ersten 24 Stunden eine Komplementaktivierung, eine Zytokinfreisetzung, die Entstehung von freien Radikalen, die Anlockung von Neutrophilen und Makrophagen sowie die Bildung von Wachstumsfaktoren. Am 1. Tag nach dem Infarkt beginnen die Neutrophilen einzuwandern, am 4. Tag post Myokardinfarkt fängt das Granulationsgewebe an, in das Infarktgebiet einzusprossen. Histiozyten, Fibroblasten und Kapillaren sind daran beteiligt, die Nekrose zu

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beseitigen. Matrixmetalloproteinasen bauen u.a. die interzelluläre Matrix ab. Der Zeitraum für die Eliminierung der Nekrose beträgt ca. 4 - 6 Wochen. Narbengewebe, das vorwiegend aus parallel angeordneten Kollagenfasern besteht, ersetzt die Nekrose. Die Infarktnarbe ist gegenüber dem nichtinfarzierten Myokard sehr dünn (ERDMANN, 2006, S. 37).

2.1.3 Auswirkungen auf die Herzfunktion

Anhand eines Myokardinfarktes, der die linke Herzkammer betrifft, sollen im folgenden Abschnitt die auftretenden Funktionsstörungen kurz erläutert werden.

Ein linksventrikulärer Infarkt beeinträchtigt die linksventrikuläre Funktion, so daß das linksventrikuläre Schlagvolumen abfällt und der linksventrikuläre Füllungsdruck ansteigt.

Wiederum führt eine starke Verminderung des linksventrikulären Schlagvolumens zum Absinken des Aortendruckes und des koronaren Perfusionsdruckes. Dieser Prozeß kann weitere myokardiale Ischämiezustände hervorrufen. Außerdem bedingt ein verminderter Herzauswurf die Erhöhung der Nachlast, was sich negativ auf das Schlagvolumen auswirkt und den myokardialen Sauerstoffverbrauch anhebt. Die Unfähigkeit des linken Ventrikels sich normal zu entleeren, erhöht die Vorlast des Herzens. Es besteht die Möglichkeit der Entwicklung von Lungenödemen. Gleichzeitig wird durch die erhöhte Vorlast das verbleibende nichtinfarzierte Myokard gedehnt, und das Schlagvolumen normalisiert sich für einen gewissen Zeitraum auf Kosten einer reduzierten Ejektionsfraktion, jedoch nur, wenn die Infarktnekrose nicht zu groß ist (BRAUNWALD et al., 2001).

2.2 Herzinsuffizienz

2.2.1 Definition und Ursachen

Bei einer Herzinsuffizienz ist das Herz nicht mehr in der Lage, den Körper entsprechend seiner Bedürfnisse, ausreichend mit Blut und Sauerstoff zu versorgen. Es liegt eine ungenügende Pumpleistung des Herzens vor (HOPPE et al., 2005).

Je nach maßgebender Beteiligung des rechten oder des linken Ventrikels am Pumpversagen des Herzens wird zwischen einer Rechtsherz-, Linksherz- und einer Globalinsuffizienz unterschieden. Nach dem Zeitverlauf existieren die akute, meist schnell, binnen weniger

Literaturübersicht 6

Minuten bis Stunden entstehend, sowie die chronische Herzinsuffizienz, die sich innerhalb von Wochen bis Monaten entwickelt und in kompensierter, aber auch in dekompensierter Form anzutreffen ist. Entsprechend dem Schweregrad erfolgt die Einteilung in eine Ruhe- und Belastungsinsuffizienz, nach der New York Heart Association werden 4 Gruppen von Patienten mit Herzerkrankungen klassifiziert: ohne, leichte, mittlere oder schwere Einschränkungen der körperlichen Aktivität (PSCHYREMBEL, 2002).

Nach der Framingham-Studie gelten als Hauptursachen für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz Bluthochdruck und die koronare Herzkrankheit, welche einen Myokardinfarkt hervorrufen kann (HO et al., 1993).

2.2.2 Pathogenese und bedeutende Kompensationsmechanismen

Infolge von kardiovaskulären Erkrankungen kommt es zu Druck- und Volumenbelastungen sowie zu Gewebeverlusten am Herz, welche initial eine myokardiale Schädigung und Funktionsbeeinträchtigung hervorrufen.

Um die Herzfunktion aufrechtzuerhalten, werden verschiedene pathophysiologische Mechanismen aktiviert, die zunächst eine ausreichende Versorgung aller Organe und Gewebe sicherstellen sollen, später aber zu negativen Effekten bzw. zur Progression der Herzinsuffizienz führen.

Eine wichtige Anpassung an die vermehrte Druck- oder Volumenbelastung des Herzens, sowie an den Verlust von kontraktiler Masse nach Myokardinfarkt, stellen die ventrikuläre Dilatation und die Hypertrophie dar. Dieser adaptive Prozeß verändert die Dimensionen und die Form des Herzens (BAIG et al., 1998). Ein dilatierter Ventrikel ist in der Lage, mit geringerer Faserverkürzung ein unverändertes Schlagvolumen, im Vergleich zu einem normal großen Herz, zu befördern, da bei einem kugelförmigen Objekt kein linearer Zusammenhang zwischen Volumen und Oberfläche besteht (FUCHS u. DREXLER, 2000). Allerdings gelingt es einem erweiterten Ventrikel nur bis zu einem gewissen Radius, ein ausreichendes Schlagvolumen zu erzeugen. Die Myokardhypertrophie bewirkt eine Vermehrung kontraktiler Elemente mit der Folge einer Zunahme der Myokardmasse (COHN et al., 2000). Nach Myokardinfarkt kommt es zum seriellen und parallelen Sarkomerzuwachs (LINZBACH,

Literaturübersicht 7

1956). Dadurch wird anfangs ein Anstieg der myokardialen Wandspannung verhindert, die Kontraktionskraft des Myokards und die systolische Herzfunktion werden aufrechterhalten.

Bei anhaltender Myokardhypertrophie tritt aber eine kontraktile Dysfunktion des hypertrophierten Myokards ein (KATZ, 1990). Die Hypertrophie kann z.B. durch Noradrenalin (SCHLAICH et al., 2003, BRIEST et al., 2003), Angiotensin II (SADOSHIMA u. IZUMO, 1993) und Radikale (NAKAGAMI et al., 2003) ausgelöst werden. Diese Stimuli verursachen Veränderungen in der Genexpression und in der Proteinsynthese. Es erfolgt eine überproportionale Zunahme bestimmter Gene bzw. Proteine, sogenannter Hypertrophiemarker. Dazu zählen u.a. ANP, β-Tropomyosin, atriales MLC, β-MHC und skelettales Muskel-α-Aktin (BLACK et al., 1991).

Neben der kardiomyozytären Hypertrophie findet auch eine Zunahme des Kollagenvolumens statt, insbesondere bei chronischer Druckbelastung (SWYNGHEDAUW, 1999). Es ist bekannt, daß u.a. Aldosteron, Angiotensin II und Superoxidanionradikale das Fibroblastenwachstum mit einer vermehrten Bildung von Kollagen anregen (BRILLA et al., 1993, BRILLA u. MAISCH, 1994, YAMAMOTO et al., 2005, SIWIK u. COLUCCI, 2004).

Zu Beginn der Herzhypertrophie verhindert die Einlagerung des zugfesten und wenig dehnbaren Kollagens eine weitere Ventrikeldilatation, aber das Fortschreiten der Kollageneinlagerung bedingt nachfolgend eine Relaxationsstörung und Füllungsstörung der Herzventrikel (KATZ, 1990).

Die Umkehr der anfangs positiven Wirkungen der Hypertrophie wird vor allem durch eine relative Abnahme der Kapillardichte in bezug auf die entstandene kontraktile Masse verursacht. Energieangebot und Energiebedarf stehen dann im Widerspruch zueinander, Myozytennekrosen setzen ein, und die interstitielle Fibrose schreitet voran. Außerdem entwickeln die intramyokardialen Koronararterien eine Mediazunahme sowie eine perivaskuläre Fibrose, die durch die hypertrophiebedingte Druckbelastung erzeugt werden.

Weitere Myokardischämien, und damit verbundene Myozytenverluste, können die Folge sein (ERDMANN, 2006, S. 229).

Ein anderer wichtiger Kompensationsmechanismus zur Aufrechterhaltung der Herzfunktion stellt die Stimulation des sympathischen Nervensystems durch Barorezeptoren dar, welches für erhöhte Konzentrationen an Katecholaminen, wie z.B. Noradrenalin, sorgt (FUCHS u.

Literaturübersicht 8

DREXLER, 2000). Das Myokard wird durch kardiale sympathische Nervenfasern aktiviert und wirkt selbst als endokrines Organ, indem es zu erhöhten Noradrenalinkonzentrationen im

Plasma beiträgt (KAYE et al., 1995). Noradrenalin steigert, vor allem über vaskuläre α-Rezeptoren, den diastolischen und systolischen Blutdruck, die peripheren Gefäßwiderstände

(LÖSCHER et al., 1999), sowie vorwiegend über β1-Rezeptoren, die Kontraktionskraft und die Frequenz des Herzens (BÖHM, 2002). Dadurch wird für eine gewisse Zeitspanne die Durchblutung der lebenswichtigen Organe, wie z.B. von Herz und Gehirn, aufrechterhalten.

Jedoch führt eine ständige Stimulation mit Katecholaminen zur Desensibilisierung bis hin zum Abbau der β-Adrenozeptoren am Herz, es kommt zu einer Abnahme der β-Rezeptoren (BÖHM, 2002). Der positiv inotrope und positiv chronotrope Effekt von β-Agonisten wird vermindert. Die arterielle Vasokonstriktion erhöht die Nachlast, so daß sich das Schlagvolumen reduziert, und der Energiebedarf des Myokards ansteigt. Die venöse Vasokonstriktion hat eine Vorlasterhöhung mit konsekutiver Ödembildung zur Folge (SCHRIER u. ABRAHAM, 1999). Weitere Auswirkungen der Noradrenalinfreisetzung, die das Fortschreiten der Herzinsuffizienz fördern, sind Kardiomyozytenhypertrophie und Apoptose (CLARK et al., 1993, COMMUNAL et al., 1998).

Eine Abnahme der Herzauswurfleistung aktiviert das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (ERDMANN, 2006, S. 238). Allgemein bewirkt es eine Vasokonstriktion, die anfänglich wiederum die Perfusion der lebenswichtigen Organe sicherstellt und eine Wasserretention, welche die Vorlast erhöht, und damit die Kontraktionskraft des Myokards durch Dehnung der Herzmuskelfasern steigert. Die renale Reninfreisetzung aus den juxtaglomerulären Zellen in der Niere geschieht bei einem Abfall des intrarenalen Perfusionsdruckes, bei einer Reduktion der Natriumkonzentration in den proximalen Anteilen des distalen Tubulus, und durch Stimulation der β1-Rezeptoren der juxtaglomerulären Zellen. Renin wandelt das in der Leber gebildete Angiotensinogen in Angiotensin I um, das mit Hilfe des Angiotensin-Converting- Enzyms in Angiotensin II umgesetzt wird. Die Entstehung von Angiotensin II kann aber auch durch Chymasen erfolgen. Angiotensin II wirkt über AT1- und AT2-Rezeptoren, wobei die meisten Organe AT1-Rezeptoren besitzen, welche Effekte, wie Vasokonstriktion, Katecholaminausschüttung und Wachstum vermitteln. AT2-Rezeptoren verhelfen zu vasodilatatorischen und antiproliferativen Wirkungen (BÖHM, 2002). Angiotensin II aktiviert

Literaturübersicht 9

die Aldosteronfreisetzung in der Nebenniere, es bewirkt eine renale und systemische Vasokonstriktion, eine Freisetzung von Noradrenalin aus dem sympathischen Nervensystem (MILLANE et al., 2000) sowie eine Myozytenhypertrophie (SADOSHIMA u. IZUMO, 1993, LIU et al., 1998) und eine Myozytenapoptose (KAJSTURA et al., 1997). Aufgrund der von Angiotensin II vermittelten vasokontriktorischen Wirkung auf die glatte Gefäßmuskulatur und der direkten Katecholaminfreisetzung, die eine Nachlast- und Vorlasterhöhung, als auch eine kardiale Desensibilisierung von β-Rezeptoren verursacht, wird die Herzauswurfleistung letztendlich negativ beeinflußt. Eine Pumpdysfunktion des Herzens entsteht, außerdem schnellt der Energiebedarf des Myokards in die Höhe. Die Vorlasterhöhung, die v.a. aufgrund der Wasser- und Natriumrückresorption durch Aldosteron verursacht wird, trägt im Laufe der Zeit zu Stauungen im Lungenkreislauf bei.

Das insuffiziente Herz kann eine verminderte Dehnbarkeit, ein vergrößertes enddiastolisches Ventrikelvolumen, einen vergrößerten enddiastolischen Ventrikeldruck, eine verringerte Auswurffraktion und eine reduzierte Kontraktilität aufweisen. Es wird die systolische Herzinsuffizienz von der diastolischen Herzinsuffizienz unterschieden, oft existieren beide Formen nebeneinander. Bei der systolischen Herzinsuffizienz liegt eine Ventrikelkontraktionsstörung vor, damit ist kein effektiver Blutausstoß während der Systole vorhanden. Bei der diastolischen Herzinsuffizienz sind die Relaxation des Ventrikels und dadurch die Füllung in der Diastole sowie die Dehnbarkeit des Herzens gestört (BÖHM, 2002).

2.3 Reaktive Sauerstoffspezies 2.3.1 Definition und Aufgaben

Zu den reaktiven Sauerstoffspezies gehören freie Radikale, wie z.B. das Superoxidanionradikal und das Hydroxylradikal, stabile molekulare Oxidanzien, wie Wasserstoffperoxid, als auch angeregte Sauerstoffmoleküle. In physiologischen Konzentrationen besitzen sie Aufgaben als sekundäre Botenstoffe bei unterschiedlichen zellulären Funktionen. Konformationsänderungen an Proteinen werden durch Reaktionen der Sauerstoffspezies mit Zysteinresten innerhalb von Sulfhydrylgruppen hervorgerufen. Die

Literaturübersicht 10

reaktiven Sauerstoffverbindungen regulieren in dieser Art und Weise Enzymaktivitäten, u.a.

erfolgt die Aktivierung von Phosphatasen sowie Kinasen. RSS sind in Signaltransduktionswege integriert. Außerdem scheinen sie eine wichtige Rolle für die Proliferation und das Wachstum von Zellen zu spielen, indem entsprechende Gene und die DNA-Synthese stimuliert werden (BYRNE et al., 2003 b). Gerät die RSS-Produktion jedoch aus dem Gleichgewicht, und die Kompensation durch antioxidative Enzymsysteme ist nicht mehr ausreichend, dann kommt es zu starken Schädigungen von zellulären Proteinen, Membranen und Nukleinsäuren. Lipidperoxidation führt zu Membranzerstörungen von Zellen und Zellorganellen. Die Genexpression wird durch DNA-Brüche, Basen-Oxidation sowie durch Chromatinumstrukturierungen negativ beeinflußt. Proteindenaturation und Inaktivierung können eintreten (GIORDANO, 2005).

2.3.2 Superoxidanionradikal, Hydroxylradikal, Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit Aus molekularem Sauerstoff entsteht durch univalente Reduktion das Superoxidanionradikal, welches unter normalen Bedingungen, mit Hilfe der Superoxiddismutase, zu Wasserstoffperoxid, einer sehr gut wasserlöslichen und membranpermeablen Substanz, umgewandelt wird. Anschließend katalysieren die Katalase oder die Glutathionperoxidase die Bildung von Wasser und Sauerstoff aus Wasserstoffperoxid (BYRNE et al., 2003 b).

O2 + e^- O2.-

2O2

.- + 2H^{+ SOD} H2O2 + O2

2H2O2 ^Katalase O2 + 2H2O

Superoxidanionradikale besitzen eine effektive Halbwertszeit im Bereich von Millisekunden, sie können schlecht Membranen permeieren. Mit Hilfe der Fenton- und Haber-Weiss- Reaktion tragen die Superoxidanionradikale zur Entstehung von Hydroxylradikalen bei, welche aufgrund eines hohen positiven Reduktionspotentiales extrem reaktionsfreudig sind.

Fenton-Reaktion: H2O2 + Fe²⁺ → Fe³⁺ + OH^. + OH^-

Das zur Fenton-Reaktion benötigte zweiwertige Eisen wird durch Superoxidanionradikale aus dreiwertigem Eisen erzeugt (WEIDAUER, 2001).

Superoxid-assistierte Fenton-Reaktion: Fe³⁺ + O₂^.- ↔ Fe²⁺ + O₂ Haber-Weiss-Reaktion: O₂^.- + H₂O₂ → OH^. + OH^- + O₂

Literaturübersicht 11

Weiterhin haben die Superoxidanionradikale die Fähigkeit, mit Stickstoffmonoxid zu Peroxynitrit zu reagieren, welches mit Stickstoffmonoxid zu den reaktiven Stickstoffspezies zählt (BYRNE et al., 2003 b).

O2.-

+ NO^. → ONOO^-

Steigt die Konzentration von Stickstoffmonoxid an, konkurrieren die Superoxiddismustase und Stickstoffmonoxid um die vorhandenen Superoxidanionradikale, die mit Stickstoffmonoxid dreimal schneller reagieren als mit der Superoxiddismutase (WOLIN, 2000). Peroxynitrit weist neben physiologischen auch eine Reihe von pathophysiologischen Aktivitäten auf, z.B. fördert es die Inaktivierung der Mitochrondrienatmung in Herzmuskelzellen, welche einer Hypoxie, Reoxygenierung bzw. einer Ischämie und Reperfusion unterliegen. Außerdem kann Peroxynitrit das Gleichgewicht zwischen zellulärer Kinasen- und Phosphatasenwirksamkeit zerstören sowie antioxidative Enzymsysteme hemmen (WOLIN et al., 2002).

2.3.3 Herkunft von reaktiven Sauerstoffspezies

Im kardiovaskulären Gewebe gibt es zahlreiche Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies produzieren. Dazu gehören die nichtphagozytäre NAD(P)H-Oxidase, die Xanthinoxidase, die mitochondriale Elektronentransportkette, die Zytochrom-P450-Enzyme, die in ihrer normalen Funktion gestörten NO-Synthasen, die Lipoxygenasen und die Hämoxygenasen (BYRNE et al., 2003 b).

Die bedeutendsten Enzymsysteme für kardiovaskuläre Erkrankungen werden nachfolgend kurz abgehandelt, ausgenommen die NAD(P)H-Oxidase, welche eine gesonderte Betrachtung erfährt.

In Mitochondrien läuft der Transport von Elektronen, welche von Donoren, wie NADH und FADH, stammen, entlang von Enzymkomplexen zur ATP-Produktion ab. Dabei fallen kleine Mengen von Superoxidanionradikalen an, die aber von Mangan-Superoxiddismutasen eliminiert werden. Jedoch kann eine Entgleisung der mitochondrialen Atmungskette durch pathologische Bedingungen zu einer Steigerung der Superoxidanionradikalanhäufung führen, wobei dann das mitochondriale antioxidative Enzymsystem zum Abbau nicht mehr ausreicht (BYRNE et al., 2003 b).

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Die Xanthinoxidase entsteht aus der Xanthindehydrogenase durch Oxidation oder durch proteolytische Entfernung eines bestimmten Teiles der Xanthindehydrogenase während hypoxischer, ischämischer oder entzündlicher Zustände. Beide Formen des Enzyms, d.h. die Xanthinoxidase und die Xanthindehydrogenase, finden sich u.a. an der Endotheloberfläche des Herzens, und katalysieren die Umwandlung von Hypoxanthin über Xanthin zu Urat (LI u.

SHAH, 2004 a). Diese Reaktion bedingt die Reduktion von molekularem Sauerstoff mit der konsequenten Bildung von Superoxidanionradikalen. Die Xanthindehydrogenase reagiert, im Vergleich zur Xanthinoxidase, langsamer mit molekularem Sauerstoff (SAITO et al., 1989).

Bei experimenteller und klinischer Herzinsuffizienz sind die Expression und die Aktivität der Xanthinoxidase gesteigert, was zur vermehrten Anhäufung von Superoxidanionradikalen führt (LANDMESSER et al., 2002, DE JONG et al., 2000, EKELUND et al., 1999).

Studienergebnisse demonstrierten, daß die Xanthinoxidaseaktivität durch Radikale anderer Herkunft beeinflußt werden kann. Peroxynitrit, ein Reaktionsprodukt aus Superoxidanionradikalen und Stickstoffmonoxid, fördert die Umwandlung der Xanthindehydrogenase in die Xanthinoxidase (SAKUMA et al., 1997). Reaktive Sauerstoffspezies der NAD(P)H-Oxidase sind in Gefäßen, die turbulenten Schubspannungen unterliegen, für die vorhandenen endothelialen Spiegel der Xanthinoxidase verantwortlich (MCNALLY et al., 2003).

NO-Synthasen, die komplexe Oxidoreduktasen sind, erzeugen NO mittels Oxidation von L-Arginin durch Reduktion von molekularem Sauerstoff. Die Beeinträchtigung der Funktionsweise dieser Enzyme kann auf Substratmangel, der Nichtverfügbarkeit bzw. der Inaktivierung des essentiellen Kofaktors Tetrahydrobiopterin beruhen, die mit einer erhöhten Superoxidanionradikalproduktion endet (LI u. SHAH, 2004 a). Tetrahydrobiopterin ist leicht anfällig für eine Oxidation (LANDMESSER et al., 2003). Superoxidanionradikale anderer enzymatischer Herkunft, sowie das aus Superoxidanionradikalen und NO gebildete Peroxynitrit, begünstigen die Zerstörung des Tetrahydrobiopterins, und damit die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch NO-Synthasen (LI u. SHAH, 2004 a).

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2.3.4 RSS in Beziehung zu kardialem Remodeling und Herzinsuffizienz

Bei der experimentellen sowie auch bei der klinischen Herzinsuffizienz kommt es zu einer erheblich gesteigerten myokardialen und vaskulären Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (SAWYER et al., 2002, IDE et al., 2000). Dabei korreliert das Ausmaß der Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies mit dem Schweregrad der Herzinsuffizienz (MALLAT et al., 1998). Zum Beispiel konnte in klinischen Studien gezeigt werden, daß die Höhe der Malondialdehydplasmaspiegel, hier als Marker für oxidativen Streß verwendet, bei Patienten mit dem Grad der körperlichen Einschränkung, nach der New York Heart Association Klassifizierung bzw. mit dem Fortschreiten der Herzinsuffizienz, assoziiert waren (SERDAR et al., 2001, DIAZ-VELEZ et al., 1996, KEITH et al., 1998). Weiterhin wurde in einer Tierstudie mit chronischer linksventrikulärer Drucküberlastung dargestellt, daß reaktive Sauerstoffspezies an der Entwicklung einer Herzinsuffizienz beteiligt sind (DHALLA et al., 1996).

Morbidität und Mortalität werden entscheidend durch das linksventrikuläre Remodeling beeinflußt. Die linksventrikuläre Hypertrophie, die zunehmende ventrikuläre Dilatation und der fibrotische Umbau sind mit einer ungünstigen Prognose verbunden (MANN, 1999;

PFEFFER u. BRAUNWALD, 1990, COHN et al., 2000, HUNTER u. CHIEN, 1999).

Es existieren Untersuchungen in vitro und in vivo, die belegen, daß RSS für die Kardiomyozytenhypertrophie eine wichtige Rolle spielen. Eine Behandlung von neonatalen Rattenkardiomyozyten mit Vitamin E und Katalase verhinderte eine durch Angiotensin II und TNF-α induzierte Hypertrophie (NAKAMURA et al., 1998). Freie Radikalfänger inhibierten einen Anstieg von reaktiven Sauerstoffspezies sowie das Entstehen einer Hypertrophie aufgrund von mechanischer Dehnung in isolierten und kultivierten Kardiomyozyten (AIKAWA et al., 2001). In einem Mausmodell mit linksventrikulärer Drucküberlastung reduzierte der Radikalfänger N-2-Mercaptopropionyl-Glycin die Herzhypertrophie (DATE et al., 2002). Eine Abschwächung der linksventrikulären Hypertrophie konnte auch bei Meerschweinchen, in einer ähnlichen Studie nach Behandlung mit Vitamin E, beobachtet werden (DHALLA et al., 1996).

Aus Studien ist bekannt, daß RSS auf die Fibroblastenproliferation, die Kollagensynthese und die Aktivierung von Matrixmetalloproteinasen Einfluß nehmen (IRANI et al., 1997, SIWIK et al., 2001). Viele pathophysiologische Auslöser der interstitiellen Fibrose, wie z.B.

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Angiotensin II oder Zytokine, stimulieren die RSS-Produktion (SANO et al., 2001, KUNSCH u. MEDFORD, 1999).

Die Expression der Matrixmetalloproteinasen, die eine wesentliche Wirkung auf die Struktur der extrazellulären Matrix haben, ist redoxsensitiv reguliert. In kultivierten Fibroblasten erhöhten Wasserstoffperoxid und das Enzym Xanthinoxidase die MMP-Aktivierung. Dieser Effekt wurde durch die Behandlung mit Superoxiddismutase aufgehoben, so daß eine Beteiligung von RSS an der MMP-Stimulation nahe liegt (SIWIK et al., 2001).

RSS beeinflussen auch nach Myokardinfarkt die ventrikuläre Funktion. Nach kurzzeitigen Verschlüssen der linken Koronararterie in Kaninchen verbesserte eine adenovirale Vektorbehandlung, mit dem Ziel der Überexpression von extrazellulärer Superoxiddismutase, die Herzfunktion (LI et al., 1998). Die Rückkehr der ursprünglichen kontraktilen Herzfunktion in Cu/Zn-SOD-defizienten Mäusen nach ischämischen Zuständen war stark herabgesetzt, im Vergleich zu Kontrolltieren (YOSHIDA et al., 2000).

Strukturell unterschiedliche Antioxidanzien zeigen einen günstigen Effekt auf das linksventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt, was auf eine wichtige pathophysiologische Rolle der gesteigerten RSS-Produktion hinweist. Der Hydroxylradikalfänger DMTU bewirkte nach Abbinden der linken Koronararterie in Mäusen eine Reduktion der linksventrikulären Erweiterung sowie der kontraktilen Dysfunktion (KINUGAWA et al., 2000). In Ratten verringerte das Antioxidans Probucol nach Myokardinfarkt die linksventrikuläre Dilatation, und verbesserte die linksventrikuläre Hämodynamik (SIA et al., 2002).

Im Rahmen eines Myokardinfarktes und einer Herzinsuffizienz findet verstärkt der Prozeß der Apoptose, auf den weiter unten noch näher eingegangen wird, statt. Studienergebnisse belegen, daß der programmierte Zelltod in Verbindung mit RSS in Kardiomyozyten auftritt.

In neonatalen Kardiomyozyten von Ratten führte die Applikation von DDC, einem Inhibitor des antioxidativen Enzymsystems SOD, zum apoptotischen Zelltod. Dieser Effekt konnte durch den Superoxidradikalfänger Tiron verhindert werden (SIWIK et al., 1999). Eine ähnliche Studie demonstrierte, daß Wasserstoffperoxid und Superoxidanionradikale in kultivierten Kardiomyozyten verschiedene apoptotische Signalwege aktivierten und Apoptose verursachten, jedoch die Behandlung mit Antioxidanzien den programmierten Zelltod nahezu vollständig unterdrückte (VON HARSDORF et al., 1999). Hunde, mit einer durch

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Schrittmacher ausgelösten Herzinsuffizienz, wiesen eine zeitabhängige Steigerung der Zellapoptoserate auf, einhergehend mit einer Erhöhung der Expression von p66shc, einem redoxsensitiven Protein, welches an der Einleitung des programmierten Zelltodes beteiligt ist (CESSELLI et al., 2001).

2.4 NAD(P)H-Oxidase 2.4.1 Aufbau, Aufgabe

Das Enzymsystem Nicotinamidadenindinukleotidphosphat-Oxidase existiert in phagozytären als auch in nichtphagozytären Zellen (BABIOR, 1999, JONES et al., 2000, GRIENDLING et al., 2000, BAYRAKTUTAN et al., 1998). In neutrophilen Granulozyten besteht die NAD(P)H-Oxidase aus einem membranassoziierten Zytochrom b₅₅₈, welches sich aus den Untereinheiten p22^phox und gp91^phox zusammensetzt, sowie aus den zytosolischen Untereinheiten p47^phox, p40^phox, p67^phox und den GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder Rac2

(BABIOR, 1999). Die katalytische Untereinheit des Zytochroms gp91^phox besitzt 3 Koenzyme, dabei handelt es sich um zwei Hämmoleküle und eine FAD-Gruppe.

Normalerweise ist die neutrophile NAD(P)H-Oxidase, die zum unspezifischen Abwehrsystem gehört, nicht aktiv, erst nach adäquater Stimulation reagiert sie mit der Produktion von Superoxidanionradikalen im Millimolarbereich, dazu wird NADPH oder NADH als Substrat benötigt (LI et al., 2002 b, GRIENDLING et al., 2000). Zur Verwandlung in ein aktives Enzymsystem sind zwei wichtige Schritte notwendig: GDP muß zu GTP am Rac Molekül ausgetauscht und die Untereinheit p47^phox durch die Proteinkinase C phosphoryliert werden.

Es findet eine Konformationsänderung der phosphorylierten p47^phox-Untereinheit statt, welche daraufhin Kontakt mit dem membrangebundenen Zytochrom aufnimmt. Die Aktivierung des GTP-bindenden Proteins Rac bewirkt die Bindung von p67^phox an p47^phox und an das Zytochrom.

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p22

p47 p67 Rac

gp91

Rac p47 p67

Abbildung 1: Die NAD(P)H-Oxidase und ihre wichtigsten Untereinheiten. Ein aktives Enzymsystem entsteht, indem sich die zytosolischen Untereinheiten an das membrangebundene Zytochrom b₅₅₈ anlagern.

Abbildung 2: Elektronentransport vom NADPH Molekül über die gp91^phox-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase zu Sauerstoffmolekülen im extrazellulären Bereich (nach B. Lassègue, 2003)

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Nach der Mobilisierung der NAD(P)H-Oxidase bindet NADPH oder NADH auf der Zytosolseite an gp91^phox und setzt 2 Elektronen frei, welche über das FAD sowie über die 2 Hämmoleküle aus der Zelle transportiert werden und dann zwei Sauerstoffmoleküle zu Superoxidanionradikalen reduzieren. Der Ausgleich der negativen Elektronenladung erfolgt durch Protonen, die durch einen Kanal, der entweder einen Teil der NAD(P)H-Oxidase bildet oder eng mit der Funktion des Enzyms gekoppelt ist, in den Extrazellulärraum gelangen.

Treten Mutationen in den Untereinheiten p22^phox, gp91^phox, p47^phox und p67^phox der humanen phagozytären NAD(P)H-Oxidase auf, entsteht eine chronische granulomatöse Erkrankung (septische Granulomatose), bei der es sich um eine Störung des Immunsystems aufgrund verminderter Phagozytenfunktion handelt (LASSEGUE u. CLEMPUS, 2003, HORDIJK, 2006).

Phagozytenähnlich aufgebaute NAD(P)H-Oxidasen finden sich u.a. in kardiovaskulären Zellen, wie z.B. in adventitialen Fibroblasten, in glatten vaskulären Muskelzellen, in Endothelzellen und in Kardiomyozyten (PAGANO et al., 1997, GRIENDLING et al., 2000, JONES et al., 1996, HEYMES et al., 2003). Im Gegensatz zur neutrophilen NAD(P)H- Oxidase ist die phagozytenähnliche kardiovaskuläre NAD(P)H-Oxidase kontinuierlich aktiv, in unstimulierten Zellen werden geringe Mengen an Superoxidanionradikalen gebildet.

Wirken jedoch mechanische Kräfte und Substanzen wie Angiotensin II, Zytokine, Endothelin 1, α-adrenerge Agonisten auf die Zellen ein, kommt es zur Superoxidanionradikalproduktionssteigerung (LI u. SHAH, 2003, MURDOCH et al., 2006).

Ein weiterer Unterschied zwischen der phagozytenähnlichen kardiovaskulären und der neutrophilen NAD(P)H-Oxidase besteht in der intra- und extrazellulären Superoxidanionradikalerzeugung (GRIENDLING et al., 2000). Für die einzelnen Untereinheiten der phagozytenähnlichen NAD(P)H-Oxidase sind in den vergangenen Jahren verschiedene Isoformen entdeckt worden. Zum Teil unterscheiden sich auch die Aktivierungswege der phagozytenähnlichen von der neutrophilen NAD(P)H-Oxidase in Abhängigkeit der jeweils vorhandenen Untereinheiten. Fünf verschiedene Isoformen, die als NOX bezeichnet werden, existieren für die katalytische Untereinheit gp91^phox. NOX1 ist hauptsächlich in glatten vaskulären Muskelzellen anzutreffen, seine Aktivierung erfolgt durch

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Homologe von p47^phox und p67^phox, die entsprechend NOXO1 und NOXA2 genannt werden.

Die Isoform NOX2, welche sich in Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten findet, steht als Synonym für gp91^phox. Sie benötigt die Untereinheiten p47^phox, p67^phox sowie Rac zur Stimulation, die, wie oben bei der neutrophilen NAD(P)H-Oxidase beschrieben, abläuft.

NOX3 kommt im vestibulären und cochleären Epithel des Innenohres vor, nicht aber in kardiovaskulären Zellen. Zuerst wurde NOX4 in der Niere entdeckt, später aber auch in Endothelzellen, Kardiomyozyten und Fibroblasten. Der genaue Aktivierungsweg bleibt soweit noch ungelöst, nach bisherigen Befunden scheint NOX4 nur p22^phox für seine Aktivität zu brauchen. In Kardiomyozyten ist das Expressionsverhältnis von NOX2- zu NOX4-mRNA eins zu zwei (BYRNE et al., 2003 a). Über NOX5 gibt es noch nicht viele Informationen, seine Präsens ist bisher nur in lymphoiden Zellen, im Hoden und in Krebszellen der Prostata bekannt (HORDIJK, 2006, MURDOCH et al., 2006).

2.4.2 NAD(P)H-Oxidase und kardiale Hypertrophie

Eine Anzahl von Tiermodellen beschreibt die Einflußnahme der NAD(P)H-Oxidase mit ihrer Superoxidanionradikalproduktion auf die kardiale Hypertrophie. In Meerschweinchen wurde durch Einengung der Aorta eine drucküberlastete linksventrikuläre Hypertrophie induziert.

Dabei konnte sowohl eine Steigerung der Expression der Untereinheiten der NAD(P)H- Oxidase in Kardiomyozyten und Endothelzellen als auch eine Aktivitätserhöhung des Enzymsystems nachgewiesen werden (LI et al., 2002 a).

In Wildtyp-Mäusen und NOX2-defizienten Mäusen wurde mit Hilfe einer Angiotensin-II- Infusion eine kardiale Hypertrophie über einen Zeitraum von 7 bis zu 14 Tagen erzeugt. Der Vergleich zu Wildtyp-Mäusen zeigte eine nahezu vollständige Unterdrückung der Herzhypertrophie in NOX2-defizienten Mäusen (BENDALL et al., 2002). Aufgrund dessen läßt sich vermuten, daß die NOX2-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase nach Angiotensin-II- Stimulation eine Rolle für die Entwicklung der linksventrikulären Hypertrophie spielt.

Aber es existieren auch Befunde, die gegen eine Beteiligung der NOX2-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase an der kardialen Hypertrophie sprechen. Nach Aorteneinengung in Wildtyp-Mäusen und NOX2-defizienten Mäusen fanden sich keine Unterschiede zwischen den zwei Mausgruppen hinsichtlich der linksventrikulären Hypertrophie und der erhöhten

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NAD(P)H-Oxidaseaktivität (BYRNE et al., 2003 a, MAYTIN et al., 2004). Eine durch chronische Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems ausgelöste linksventrikuläre Hypertrophie erwies sich ebenfalls als nicht NOX2 abhängig (TOUYZ et al., 2005).

2.4.3 NAD(P)H-Oxidase und kardiale Fibrose

Experimentell konnte gezeigt werden, daß reaktive Sauerstoffspezies, die durch die NAD(P)H-Oxidase und den sich anschließenden Reaktionen entstehen, die interstitielle kardiale Fibrose zu beeinflussen scheinen. Der Begriff interstitielle Fibrose umfaßt eine gesteigerte Proliferation von Fibroblasten und deren Transformation zu Myofibroblasten, die Matrixproduktion, die Expression von pro-fibrotisch wirkenden Genen sowie die Gleichgewichtsstörung von Matrixmetalloproteinasen und ihren Inhibitoren.

In NOX2-defizienten Mäusen waren nach Angiotensin-II-Infusion und Aldosteron induzierter Fibrose, in bezug auf die Kontrolltiere, fast keine fibrotischen Veränderungen sichtbar (BENDALL et al., 2002, JOHAR et al., 2006). Eine erhöhte Sauerstoffradikalakkumulation und eine gesteigerte Expression von NOX2 konnten, in einer durch Aldosteron verursachten kardialen Fibrose, in Ratten beobachtet werden (SUN et al., 2002). Im gleichen Tiermodell wurde über eine chronische Behandlung mit Apocynin, einem NAD(P)H-Oxidasehemmer, eine kardiale Fibrose unterdrückt (PARK et al., 2004). NOX2-defiziente Mäuse wiesen nach Aorteneinengung, im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, eine reduzierte interstitielle Fibrose auf (GRIEVE et al., 2006). Aus diesen Forschungsdaten ist erkennbar, daß die NAD(P)H- Oxidase, und insbesondere ihre Untereinheit NOX2, in bestimmten Tiermodellen an der Ausbildung der kardialen Fibrose beteiligt ist.

2.4.4 NAD(P)H-Oxidase im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt

Die Rolle der NAD(P)H-Oxidase in bezug auf das ventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt ist noch unklar. Nach einem experimentell induzierten Myokardinfarkt in Ratten wurde eine erhöhte Expression der Untereinheiten NOX2 und p22^phox der NAD(P)H- Oxidase auf mRNA-Ebene im infarzierten Bereich des linken Ventrikels festgestellt (FUKUI

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et al., 2001). Es konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob hauptsächlich Phagozyten oder kardiale Zellen an dem Anstieg der Untereinheiten beteiligt waren. Erwähnenswert ist auch, daß es im Myokard von Patienten, welche an einem akuten Myokardinfarkt verstarben, zu einer erhöhten Expression von p22^phox und NOX2 kam. Hier handelte es sich um Untereinheiten der NAD(P)H-Oxidase aus Kardiomyozyten (KRIJNEN et al., 2003).

Patienten mit hochgradiger Herzinsuffizienz wiesen im Myokard eine stark gesteigerte NAD(P)H-Oxidaseaktivität, im Vergleich zu gesunden Probanden, auf (MAACK et al., 2003, HEYMES et al., 2003).

2.5 Matrixmetalloproteinasen

Matrixmetalloproteinasen gehören zur Familie der Zink-beinhaltenden Endopeptidasen. Für ihre Stabilität benötigen sie Calcium. Diese Enzyme bewirken den Abbau der extrazellulären Matrix. Über 25 verschiedene Mitglieder, die bis heute identifiziert sind, werden nach Substratspezifität in bestimmte Klassen eingeteilt. Es existieren Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und Elastasen. Die meisten Matrixmetalloproteinasen stellen zunächst Proenzyme dar, die per Sekretion in den Extrazellulärraum gelangen und anschließend durch enzymatische Spaltung aktiviert werden. Im Gegensatz dazu stehen die membrangebundenen Matrixmetalloproteinasen, welche schon im aktiven Zustand vorliegen. Die Synthese der MMPs im Herz erfolgt dort in allen vorhandenen Zellen, wie in Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothelzellen und Entzündungszellen (SPINALE, 2002, LINDSEY, 2004).

Die Zusammensetzung der kardialen extrazellulären Matrix besteht aus Matrixproteinen wie Kollagen, Laminin, Fibronektin, Chondroitinsulfat als auch aus Basalmembranproteinen, Proteoglykanen, Glykosaminoglykanen und bioaktiven Signalmolekülen (AUMAILLEY u.

GAYRAUD, 1998, WEBER, 1997). Sie unterstützt die Anordnung und Ausrichtung der Kardiomyozyten, so daß eine Kaftübertragung zwischen benachbarten Kardiomyozyten erfolgen kann und damit eine optimale Herzarbeit möglich ist (WEBER et al., 1994). Eine Kontaktaufnahme der Matrix mit kardialen Zellen findet über Integrinrezeptoren statt (BOUDREAU u. BISSELL, 1998). Kardiale Fibroblasten regulieren den Zustand der extrazellulären Matrix durch Synthese und Platzierung von Matrixmolekülen, durch den Abbau der Matrix per Sekretion von Matrixmetalloproteinasen sowie durch die Erhaltung der

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mechanischen Spannung des Kollagennetzwerkes (KANEKAR et al., 1998). Die Synthese und der Abbau der extrazellulären Matrix befinden sich normalerweise im Gleichgewicht, jedoch wird diese Balance, z.B. nach Myokardinfarkt bzw. im Rahmen einer Herzinsuffizienz, zerstört. Mit zu den Hauptverursachern für die Änderung der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix zählen die Matrixmetalloproteinasen.

Verschiedene experimentelle und klinische Studien untersuchten die Matrixmetalloproteinasen im Zusammenhang mit diversen kardialen Erkrankungen.

Nachfolgend finden v.a. der Myokardinfarkt und die Herzinsuffizienz Erwähnung.

Zuerst wurde in Ratten nach Myokardinfarkt eine Zunahme von MMPs beschrieben (CLEUTJENS et al., 1995). Eine weitere umfangreiche Studie mit Ratten protokollierte zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Myokardinfarkt diverse MMP-Spiegel. Dabei lagen MMP-2, MMP-9 und MMP-13 zu jedem Zeitpunkt über den Kontrollwerten (PETERSON et al., 2000). Patienten mit akutem Myokardinfarkt zeigten erhöhte Plasmaspiegel von MMP-9 (INOKUBO et al., 2001). Auch Plasmaspiegel von herzinsuffizienten Personen wiesen, im Vergleich zu Gesunden, Erhöhungen von MMP-8 und MMP-9 auf (WILSON et al., 2002).

MMP-9-defiziente Mäuse demonstrierten eine Abnahme der linksventrikulären Erweiterung nach Myokardinfarkt, im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (DUCHARME et al., 2000).

Zusätzlich konnte in MMP-9-defizienten Mäusen ein nahezu vollständiger Schutz gegen eine Infarktruptur gezeigt werden (HEYMANS et al., 1999). MMP-2-defiziente Mäuse sowie Wildtyp-Tiere, die eine selektiv hemmende MMP-2-Therapie erhielten, überlebten nach akutem Myokardinfarkt deutlich besser als unbehandelte Wildtyp-Mäuse aufgrund einer Verhinderung der Myokardruptur und des verzögerten linksventrikulären Remodelings (MATSUMURA et al., 2005). Die pharmakologische Ausschaltung von MMPs in Mäusen und Kaninchen erzielte auch eine reduzierte ventrikuläre Dilatation nach Myokardinfarkt (DUCHARME et al., 2000, LINDSEY et al., 2002). Hervorzuheben ist, daß die zahlreich durchgeführte tierexperimentelle MMP-Inhibitorbehandlung nach Myokardinfarkt kardiales Remodeling abschwächte, Kardiomyozytenhypertrophie sowie Wanddickenabnahme erniedrigte, die linksventrikuläre Erweiterung begrenzte und damit die linksventrikuläre Funktion verbesserte (ROHDE et al., 1999, LINDSEY et al., 2002). Da feststeht, daß bei Patienten nach Myokardinfarkt eine starke linksventrikuläre Erweiterung mit dem Risiko einer kardialen Ruptur, eines Aneurysmas und der Entwicklung einer Herzinsuffizienz

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einhergeht, ist eine MMP-Inhibitortherapie in der Humanmedizin als Zukunftsziel anzustreben (CREEMERS et al., 2001).

Zu berücksichtigen ist allerdings, daß nicht alle, sondern nur spezifische Matrixmetalloproteinasen bei der Herzinsuffizienz erhöhte Aktivität zeigen (THOMAS et al., 1998, SPINALE et al., 2000). Welche Matrixmetalloproteinasen verstärkt im Rahmen einer Herzinsuffizienz ansteigen, scheint von den gerade präsenten extrazellulären Stimuli abhängig zu sein (SPINALE, 2002).

2.6 Apoptose

Bei der Apoptose handelt es sich um einen programmierten Zelltod, der von den betroffenen Zellen selbst durchgeführt wird.

Veränderungen, wie Kondensation von nukleärem Chromatin sowie von Zytoplasma und Zellschrumpfung bis hin zur Fragmentierung der Zellbestandteile, kennzeichnen das Bild der Apoptose. Die Zellfragmente, auch apoptotische Körper genannt, verbleiben bis zur Phagozytose durch Makrophagen oder Nachbarzellen von der intakten Zellmembran umschlossen. Spezifische Größen von DNA-Bruchstücken entstehen bei der Fragmentierung der nukleären DNA.

Im Gegensatz dazu, kommt es bei der Nekrose, einer anderen Form des Zelltodes, zur Ruptur der Zellmembran und zur Freisetzung der Zellbestandteile, was einen Entzündungsprozeß hervorruft (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006).

Der Ablauf der Apoptose kann in 3 größere Prozeßschritte untergliedert werden. Die Apoptoseeinleitung erfolgt über den extrinsischen oder den intrinsischen Weg. Bei der

extrinsischen Induktion bindet ein Ligand, z.B. TNF-α, an einen Rezeptor der TNF-Rezeptorfamilie. Eine Schädigung der DNA bedingt die Beschreitung des intrinsischen

Weges, der z.B. mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 verbunden ist. Im zweiten Prozeßschritt finden durch die Signale der Induktion entsprechende Genexpressionen im Zellkern mit nachfolgender Produktbildung statt. Die extrinsische Aktivierung der Apoptose führt zur Veränderung der Struktur des Rezeptors, wodurch bestimmte Adaptermoleküle binden können. Der innere Induktionsweg bewirkt die Expression pro-apoptotischer Mitglieder der Bcl-2-Familie (z.B. Bax), welche die Ausschüttung von Zytochrom c und

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anderen pro-apoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien verursachen. Morphologische Veränderungen der Zellbestandteile werden im 3. Prozeßschritt, der Ausführung, u.a. mit Hilfe von spezifischen Cystein-Aspartyl-Proteasen, den Caspasen, und Deoxyribonukleasen erzeugt. Der extrinsische Induktionsweg löst die Aktivierung der Caspase-8 aus, der intrinsische Weg stimuliert die Caspase-9. Beide Caspasen setzen die sogenannte Caspasekaskade in Gang. Vornehmlich führen die Caspasen 3, 6 und 7 zum apoptotischen Tod der Zelle (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006, LAWEN, 2003, GEWIES, 2003).

Apoptose ist physiologisch als auch pathophysiologisch von Bedeutung. Sie spielt eine zentrale Rolle in der Entwicklung, in der Morphogenese, bei der Kontrolle der Zellanzahl, bei der Deletion von nicht mehr funktionsfähigen Zellen, bei der hormonabhängigen Organatrophie und im Immunsystem. Viele Studien belegen, daß Apoptose einen großen Stellenwert bei fast allen Herzerkrankungen einnimmt (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006).

Angiotensin II, oxidativer Streß, Hyperglykämie, mitochondriale Dysfunktion, Zytokine und ventrikuläre Drucküberlastung gelten als wichtige Stimuli für die Aktivierung der Apoptose bei kardialen Erkrankungen. Oxidativer Streß steht als Auslöser des Kardiomyozytenuntergangs, der über Apoptose oder Nekrose verläuft, im Vordergrund (KUMAR u. JUGDUTT, 2003). Besonders erwähnenswert ist, daß Apoptose in der akuten, subakuten und chronischen Phase des Myokardinfarktes auftritt und damit wahrscheinlich die Verantwortung für den Tod einer großen Anzahl von Kardiomyozyten trägt. Die Apoptose von Kardiomyozyten im Rahmen eines Myokardinfarktes fördert die kontraktile Dysfunktion und das kardiale linksventrikuläre Remodeling (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006, SAM et al., 2000, PALOJOKI et al., 2001, BALDI et al., 2002). Viele apoptotische Kardiomyozyten sind v.a. in der Grenzzone zwischen nichtinfarziertem und infarziertem Gewebe lokalisiert (SARASTE et al., 1999, LATIF et al., 2000). Anhaltender und progressiver Schwund von Kardiomyozyten ist in diesem Gebiet, bis zu 60 Tage nach Myokardinfarkt, zu beobachten (BALDI et al., 2002). Außerdem belegen Studien, daß die Verringerung der Kardiomyozyten durch Apoptose das Fortschreiten der Herzinsuffizienz begünstigt (NARULA et al., 1996, OLIVETTI et al., 1997). Eine Apoptosehemmung durch Applikation eines Caspaseinhibitors konnte in Ratten nach akutem Myokardinfarkt die Anzahl der apoptotischen Zellen und die Infarktgröße reduzieren (YAOITA et al., 1998). In einem Mausmyokardinfarktmodell verbesserte eine Caspase-3-Inhibitorgabe das Überleben, und verhinderte die ventrikuläre

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Dilatation sowie die ventrikuläre Dysfunktion (BALSAM et al., 2005). Mäuse mit Caspase-3- Überexpression zeigten nach Ischämie/Reperfusion größere Infarkte und eine erhöhte Sterblichkeit (CONDORELLI et al., 2001).

Zur Detektion der Apoptose werden hauptsächlich indirekte Methoden benutzt. Der oft verwendete „TUNEL-Assay“ erkennt einfache und doppelte DNA-Brüche mit freien 3´-OH-Enden. Die Darstellung bestimmter Längen von DNA-Fragmenten erfolgt über die Gelelektrophorese („DNA laddering“). Elektronenmikroskopische Untersuchungen finden kaum statt (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006). Da die Aktivität von Caspasen ein starker Indikator für die Apoptose ist, wird häufig deren Aktivität oder Expression ermittelt (SAMALI et al., 1999). Als ein Hauptenzym der Apoptose gilt die Caspase-3. Aktivierte Caspase-3 wurde in Verbindung mit dilatativer Kardiomyopathie und ischämischen Herzerkrankungen detektiert (NARULA et al., 1998,BALDI et al., 2002, ABBATE et al., 2002).

2.7 Tiermodell

Bei der Herzinsuffizienz handelt es sich um ein sehr komplexes Krankheitsgeschehen, daher kann momentan noch nicht auf den Tierversuch verzichtet werden. Der Wahl des passenden Versuchstieres und des Modells kommt dabei eine entscheidende Bedeutung zu.

Eine geeignete Methode stellt die dauerhafte Okklusion des absteigenden Astes der linken Koronararterie in Ratten und Mäusen dar, um pathophysiologische Mechanismen im Zusammenhang mit der Herzinsuffizienz zu erforschen. Die Maus diente in dieser Studie aus zahlreichen Gründen als Tiermodell. Die kostengünstige Haltung, die schnelle Reproduktion der Tiere, die relativ einfache Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen und das schnelle Wachstum, in bezug auf chronische Experimente, sind bei Mäusen als vorteilhaft anzusehen. Außerdem sind das menschliche und das murine Genom zu ca. 85 % identisch (DIETRICH et al., 1996).

Für die vorliegende Arbeit erfolgte die Durchführung der Myokardinfarktoperation nach der modifizierten Methode von Maclean, die ursprünglich an Ratten stattfand (MACLEAN et al., 1976). Vor 28 Jahren wurde erstmalig die Ligatur des absteigenden Astes der linken Koronararterie in Mäusen beschrieben (ZOLOTAREVA u. KOGAN, 1978). Diese Operation

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an der Maus repräsentiert eine in zahlreichen Studien verwendete Methode (PATTEN et al., 1998, SALTO-TELLEZ et al., 2004). Sie erscheint geeignet, um das ventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt bzw. im Rahmen einer Herzinsuffizienz zu studieren (PATTEN et al., 1998). Es existiert auch die Möglichkeit, einen Myokardinfarkt mit Hilfe der Kryotechnik zu erzeugen, doch da hier kleinere Infarktgrößen und nur ein moderates Remodeling erzielt werden, stand diese Anwendung für das Projekt nicht zur Diskussion (VAN DEN BOS et al., 2005).

Aufgrund der heute vorhandenen chirurgischen Technik mit hochqualitativen Operationsmikroskopen verhindert die Größe des Mausherzens nicht die Induktion eines Myokardinfarktes bei dieser Spezies. Selbst die Aufarbeitung sehr kleiner Probenmengen ist durch moderne molekularbiologische Techniken realisierbar.

Weiterhin kam nur die Maus als Tiermodell in Betracht, da der Einfluß der p47^phox- Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase auf das linksventrikuläre Remodeling, auf die linksventrikuläre Funktion und auf das Überleben nach Myokardinfarkt in p47^phox-defizienten Tieren, im Vergleich zu Wildtyp-Tieren (C57Bl/6J), untersucht werden sollte. Die Ausschaltung des p47^phox-Gens der NAD(P)H-Oxidase erfolgte bisher nur in Mäusen.

Zur Zeit gibt es mehrere Mäuse, bei denen bestimmte Gene der NAD(P)H-Oxidase nicht intakt sind. Zuerst entwickelte eine Gruppe die gp91^phox- (NOX2-) defiziente Maus, welche schon häufig als Modell zur Erforschung von kardiovaskulären Krankheiten zum Einsatz gelangte (POLLOCK et al., 1995, TOUYZ et al., 2005, BYRNE et al., 2003 a, CASTIER et al., 2005). Ursprünglich waren diese Mäuse zur Ergründung der humanen septischen Granulomatose gedacht. Dabei handelt es sich um einen angeborenen Defekt des oxidativen Stoffwechsels der Granulozyten und Monozyten. Diese zum Abwehrsystem gehörenden Zellen sind nicht in der Lage, ausreichend intrazelluläre mikrobizide Sauerstoffradikale zu bilden, was auf genetischen Defekten der NAD(P)H-Oxidase beruht. Es kommt zu schweren rezidivierenden Infektionen (MA et al., 2000).

Zwei Arbeitsgruppen (JACKSON et al., 1995, HARBORD et al., 2002) erstellten p47^phox- defiziente Mäuse, wobei in dieser Arbeit die von Holland kreierte Maus (JACKSON et al., 1995) verwendet wurde. Auch diese Tiere dienten zunächst zur Erkundung der Granulomatose, später aber auch für das Studium anderer Fragestellungen. Phänotypisch

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zeigen die Mäuse ein normales Körpergewicht bis zum Beginn von chronischen Infektionen.

Sie weisen kein von der Norm abweichendes Blutbild auf. Ihre phagozytäre Antwort auf Staphylokokkeninfektionen sowie auf Entzündung ist vermindert. Bei chronischen Infektionen können Granulome, eine vergrößerte Milz und Lymphadenome entstehen (JACKSON-LABORATORY, 2005). Die Erstellung der Tiere ist kurz im Methodenteil erläutert.

Neben den gp91^phox- und p47^phox-defizienten Mäusen existieren heute auch NOX1-defiziente Mäuse (MATSUNO et al., 2005).

2.8 Fragestellung

Linksventrikuläres Remodeling nach Myokardinfarkt ist mit ungünstigen Prognosen assoziiert und trägt zur Entwicklung der Herzinsuffizienz bei (PFEFFER u. BRAUNWALD, 1990).

Reaktive Sauerstoffspezies sind am ventrikulären Remodeling nach Myokardinfarkt beteiligt, jedoch ist die pathophysiologische Herkunft der reaktiven Sauerstoffspezies noch nicht vollständig aufgeklärt (ENGBERDING et al., 2004). Die NAD(P)H-Oxidase gilt als eine wichtige Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies im kardiovaskulären Gewebe, ihre pathophysiologische Bedeutung für die Entstehung einer Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt ist noch unklar (LI et al., 2002 a, GRIENDLING et al., 2000).

Folgende Fragestellung ergab sich für diese Studie:

Welche Rolle spielt die NAD(P)H-Oxidase und insbesondere ihre Untereinheit p47^phox

• für das linksventrikuläre Remodeling,

• für die linksventrikuläre Funktion,

• und für das Überleben nach Myokardinfarkt?

Methoden 27

3. Methoden

3.1 Verbrauchsmaterialien

allgemeine Verbrauchsmaterialien Bezugsquelle

Aluminium-Kryoröhrchen (2 ml, 10 ml) Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Aluminium-Laborfolie Alujet-Universal GmbH, Mammendorf Einmal-Injektionskanülen (0,4 * 12 mm;

1,10 * 30 mm)

Braun Melsungen AG, Melsungen

Faltenfilter (Durchmesser 185 mm) Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Halb-Microküvetten Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht

Handschuhe Kimberly-Clark Europe Limited, Surrey,

England

Kleenextuch Kimberly-Clark Europe Limited, Surrey,

England

Konische Röhrchen, 15 ml Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA

Kryoröhrchen Nalge Nunc International, Rochester, NY,

USA

Multi-Flex ® 0,5 – 200 µl Ecoflex ® Tips Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe

Parafilm „M“ Pechiney Plastic Packaging, Chicago, IL,

USA

Petrischalen, 100 mm Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht Pipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml) Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht Pipettenspitzen Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht Reagiergefäß (0,5 ml, 1,5 ml) Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht

Röhrchen, PP, 50 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Spritzen (1 ml, 10 ml, 20 ml) Braun Melsungen AG, Melsungen Sterifix ® Filter 0,2 µm Braun Melsungen AG, Melsungen

Wägepapier MN 226 Machery-Nagel, Düren