Hypertrophie, Fibrose und Herzfunktion

Kardiales Remodeling tritt nach Myokardinfarkt auf, und umfaßt insbesondere Dilatation, Hypertrophie und Fibrose, welches zu ventrikulärer Dysfunktion führt.

Es wurde in zahlreichen Studien gezeigt, daß die Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies kardiale Remodelingprozesse verstärkt (SIWIK et al., 1999, PIMENTEL et al., 2001, FLESCH et al., 1999, ZEITZ et al., 2002, DATE et al., 2002, DHALLA et al., 1996, ARNOLD et al., 2001, IRANI et al., 1997, CHENG et al., 2003, SIWIK et al., 2001). Viele

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Stimuli, welche relevant für die Pathophysiologie der Herzinsuffizienz sind, aktivieren die NAD(P)H-Oxidase, was zu erhöhter Superoxidanionradikalproduktion führt. Auch in dieser Studie wurde demonstriert, daß die NAD(P)H-Oxidaseaktivität und die Superoxidanionradikalproduktion, 4 Wochen nach Infarkt, im nichtinfarzierten Myokard bei Wildtyp-Tieren anstiegen, jedoch nicht bei p47^phox-defizienten Tieren. Aufgrund der vorangegangenen Schilderung ließ sich bei den letzteren Mäusen ein geringeres kardiales Remodeling vermuten. Die Wildtyp-Tiere wiesen nach Myokardinfarkt eine deutliche LV-Hypertrophie, LV-Fibrose, LV-Dilatation und LV-Dysfunktion auf. Im Gegensatz zu den Wildtyp-Tieren zeigten die p47^phox-defizienten Tiere, hinsichtlich der Hypertrophie nach Myokardinfarkt, geringere Gewichte der linken Ventrikel, kleinere Kardiomyozytenquerschnittsflächen und niedrigere RNA-Spiegel des Hypertrophiemarkers SkM-α-Aktin. Der Hypertrophiemarker ANP unterschied sich nicht zwischen Wildtyp- und p47^phox-defizienten Mäusen nach Myokardinfarkt. Da die Mehrheit der untersuchten Parameter für die Hypertrophie bei den p47^phox-defizienten Tieren, im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, nach MI vermindert war, liegt die Schlußfolgerung nahe, daß die kardiale NAD(P)H-Oxidase, insbesondere ihre Untereinheit p47^phox, in, für das Herz negativer Weise, auf hypertrophische Prozesse nach Myokardinfarkt wirkt. Einige Studien untersuchten die Einflußnahme der NOX2-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase im Zusammenhang mit der kardialen Hypertrophie. Mit nicht blutdruckerhöhenden Dosen von Angiotensin II fand eine Entwicklung einer Hypertrophie in Wildtyp-, nicht aber in NOX2-defizienten Tieren statt (BENDALL et al., 2002). In isolierten Kardiomyozyten war eine durch Angiotensin II vermittelte Hypertrophie von der Untereinheit NOX2 abhängig (WENZEL et al., 2001, NAKAGAMI et al., 2003). Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die p47^phox-defiziente NAD(P)H-Oxidase eine günstige Rolle für die linksventrikuläre Hypertrophie nach Myokardinfarkt spielt. Auf der anderen Seite gibt es zwei Studien, die einen Einfluß der NOX2-defizienten NAD(P)H-Oxidase auf die myokardiale Hypertrophie in einem speziellen Tiermodell negieren. Eine nach Aorteneinengung induzierte Hypertrophie ergab keine Unterschiede zwischen den Wildtyp- und NOX2-defizienten Mäusen (BYRNE et al., 2003 a, MAYTIN et al., 2004). Dafür schien eine homologe Form von NOX2 verantwortlich zu sein, die Expression von NOX4 war nämlich in den NOX2-defizienten Mäusen erhöht (BYRNE et al., 2003 a). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und der Hypertrophiestudie nach

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Angiotensin-II-Infusion von Bendall (BENDALL et al., 2002) lassen hingegen vermuten, daß keine homologe Untereinheit die Stelle der p47^phox-Untereinheit nach Myokardinfarkt bei den p47^phox-defizienten Tieren, und dementsprechend die Position der NOX2-Untereinheit nach Angiotensin-II-Infusion bei den NOX2-defizienten Mäusen, einnimmt.

Mit Hilfe der Siriusrot-Färbung konnte ein signifikant geringerer Kollagengehalt im nichtinfarzierten Myokard, 4 Wochen nach Infarkt, bei den p47^phox-defizienten Mäusen festgestellt werden. Auch andere Forschungsgruppen sahen in differenten Tiermodellen einen günstigen Einfluß der NOX2-defizienten NAD(P)H-Oxidase auf die kardiale Fibrose. Nach einer Angiotensin-II-Infusion trat eine stark abgeschwächte, interstitielle kardiale Fibrose in NOX2-defizienten Mäusen, im Vergleich zu Wildtypen, auf (BENDALL et al., 2002, JOHAR et al., 2006). Die Gruppe von Johar führte diesen Effekt auf eine Hemmung des Anstieges der mRNA-Expression von Prokollagen I und III sowie des „Connective tissue growth factors“

(ein Wachstumfaktor des Bindegewebes), der Aktivierung von NF-κB und der Aktivierung von MMP-2 in NOX2-defizienten Mäusen zurück (JOHAR et al., 2006). In dieser Studie konnte ebenfalls eine verminderte MMP-2-Aktivierung in p47^phox-defizienten Tieren festgestellt werden, allerdings zu einem früheren Zeitpunkt als die Bestimmung des interstitiellen Kollagengehaltes erfolgte. Weiterhin wurde in einem Tiermodell nach Aortenkonstriktion, wie in den schon erwähnten Studien nach Angiotensin-II-Infusion (BENDALL et al., 2002, JOHAR et al., 2006), eine geringere Ausprägung der interstitiellen Fibrose in NOX2-defizienten Tieren, in bezug auf die Wildtyp-Mäuse, beobachtet (BYRNE et al., 2003 a). Eine durch Aldosteron verursachte interstitielle kardiale Fibrose konnte aufgrund einer chronischen Behandlung mit dem NAD(P)H-Oxidasehemmer Apocynin inhibiert werden (PARK et al., 2004). Daraus ist ersichtlich, daß die NAD(P)H-Oxidase die interstitielle kardiale Fibrose in bestimmten Tiermodellen beeinflußt. Aus der vorliegenden Arbeit geht hervor, daß die p47^phox-defiziente NAD(P)H-Oxidase die Entwicklung einer ausgeprägten interstitiellen kardialen Fibrose nach Myokardinfarkt hemmt.

Neben einer Reduktion der Fibrose und Hypertrophie wiesen die p47^phox-defizienten Tiere nach Myokardinfarkt auch eine verbesserte linksventrikuläre Funktion, im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren, auf, charakterisiert durch die Verkürzungs- und durch die Ejektionsfraktion.

Reaktive Sauerstoffspezies tragen zur Entstehung der linksventrikulären Dysfunktion bei (MACCARTHY et al., 2001, ENGBERDING et al., 2004). Die p47^phox-enthaltende und

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superoxidanionradikalproduzierende NAD(P)H-Oxidase übt nach Myokardinfarkt, wie in dieser Studie dargestellt, eine negative Wirkung auf die linksventrikuläre Funktion aus. Die letztere Beobachtung findet durch eine Studie Unterstützung, in der die Einflußnahme der Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase auf die Herzfunktion beschrieben wird. NOX2-defiziente Mäuse besaßen nach der Erzeugung einer drucküberlasteten linksventrikulären Hypertrophie durch Aorteneinengung eine besser erhaltene systolische und diastolische Funktion, im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen (GRIEVE et al., 2006).

Es ist bekannt, daß die Herzfunktion stark mit der Infarktgröße korreliert (DEGABRIELE et al., 2004). Dieses legt den Schluß nahe, daß die p47^phox-defizienten Tiere aufgrund der besseren Herzfunktion, in bezug auf die Wildtyp-Tiere, kleinere Infarktgrößen aufweisen. Die p47^phox-defizienten Mäuse zeigten aber ähnliche Infarktgrößen wie die Wildtyp-Tiere, 4 Wochen nach Myokardinfarkt. Die bessere Herzfunktion der p47^phox-defizienten Tiere nach Myokardinfarkt kann also nicht durch die kleinere Infarktgröße erklärt werden, jedoch durch die Gesamtheit der kardioprotektiven Effekte der p47^phox-defizienten NAD(P)H-Oxidase auf den linken Ventrikel.

Im Kontrast zu dieser Studie, welche demonstriert, daß die kardiale p47^phox-enthaltende NAD(P)H-Oxidase, trotz ähnlicher Infarktgrößen, zwischen den p47^phox-defizienten Tieren und Wildtyp-Tieren Einfluß auf das linksventrikuläre Remodeling, die Herzfunktion und das Überleben nimmt, präsentiert eine andere Studie in einem akuten Ischämie/Reperfusionsmodell, im Hinblick auf die Herzfunktion, das Gegenteil. Dort haben p47^phox-defiziente Mäuse und Kontrolltiere, wie in der aktuellen Arbeit, gleiche Infarktgrößen, aber weisen 24 Stunden nach Infarkt eine ähnliche linksventrikuläre Dysfunktion auf (HOFFMEYER et al., 2000). Die Herzfunktion, 24 Stunden und vier Wochen nach Myokardinfarkt, ist jedoch kaum vergleichbar, da das linksventrikuläre Remodeling, welches die Dysfunktion wesentlich beeinflußt, sich auch Wochen nach dem Infarkt, noch fortsetzt.

Eine erst kürzlich veröffentlichte Studie diskutierte, wie in diesem Projekt, die Frage, ob die NAD(P)H-Oxidase auf das ventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt Einfluß nimmt, allerdings lag dabei der Schwerpunkt auf der NOX2-Untereinheit der NAD(P)H-Oxidase, in der vorliegenden Arbeit aber auf der Untereinheit p47^phox. NOX2-defiziente Mäuse wurden

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mit Wildtyp-Tieren nach Myokardinfarktoperation verglichen, jedoch fehlten kontrolloperierte Tiere, durch welche der Nachweis hätte erbracht werden können, daß die Operation nicht zur Beeinträchtigung der Ergebnisse geführt hätte. Das Resultat ergab keinen Unterschied, hinsichtlich des ventrikulären Remodelings, zwischen den myokardinfarktoperierten Wildtyp- und NOX2-defizienten Tieren (FRANTZ et al., 2006), ganz im Gegensatz zu dieser Studie. Ein Hauptgrund dafür könnte die kompensatorische Heraufregulation der zu NOX2 homologen Untereinheit NOX4 der NAD(P)H-Oxidase sein, die bei der durch Aorteneinengung induzierten drucküberlasteten linksventrikulären Hypertrophie beschrieben wurde (BYRNE et al., 2003 a). In Kardiomyozyten ist das Expressionsverhältnis von NOX2- zu NOX4-mRNA eins zu zwei (BYRNE et al., 2003 a).

Die Gruppe von Frantz sah hingegen eine Heraufregulation der Untereinheit NOX1 der NAD(P)H-Oxidase in den NOX2-defizienten Mäusen, aber nicht von der Untereinheit NOX4 (FRANTZ et al., 2006). Bisher wurde aber noch kein signifikant bedeutender Spiegel von NOX1 in Kardiomyozyten und Endothelzellen gefunden, welche die Mehrheit der Zellen im Herz bilden (CAVE et al., 2005).

5.5 Apoptose

Viele Studien belegen, daß nach Myokardinfarkt kardiale Apoptose auftritt (YAOITA et al., 2000, TAKEMURA et al., 1998, AKIYAMA et al., 1997) und auf ventrikuläre Remodelingprozesse Einfluß nimmt (SAM et al., 2000, PALOJOKI et al., 2001, BALDI et al., 2002). Es wurde gezeigt, daß oxidativer Streß einen bedeutenden Stimulus für die Apoptose der Kardiomyozyten bei Myokardinfarkt, Ischämie/Reperfusion und Herzinsuffizienz darstellt (MACLELLAN u. SCHNEIDER, 1997, HAUNSTETTER u.

IZUMO, 1998).

Da die kardiale NAD(P)H-Oxidase nach Myokardinfarkt, welche über ihre Produktion von Sauerstoffradikalen zur Entstehung von oxidativem Streß beiträgt, in dieser Studie bei Wildtyp-Mäusen aktiviert war, nicht aber bei p47^phox-defizienten Tieren, wurden die Effekte der NAD(P)H-Oxidase, und ihrer Untereinheit p47^phox, auf die Apoptose nach Myokardinfarkt untersucht. Außerdem wiesen die p47^phox-defizienten Tiere nach Myokardinfarkt ein geringeres kardiales Remodeling in bezug auf die Wildtyp-Tiere auf, und wie weiter oben

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erwähnt, scheint die Apoptose das ventrikuläre Remodeling zu beeinflussen. Zunächst diente der TUNEL-Assay zur Ermittlung der apoptotischen Kerne im nichtinfarzierten Myokard und im Grenzgebiet, zwischen nichtinfarziertem und infarziertem Herzgewebe. Nach Myokardinfarkt erhöhte sich die Zahl der apoptotischen Kerne erheblich im Grenzgebiet, wobei die kardiale Apoptoserate bei den Wildtyp-Mäusen, verglichen mit den p47^phox -defizienten Tieren, signifikant größer ausfiel. Im nichtinfarzierten Myokard, wo die kardiale Apoptose nur gering ausgeprägt war, zeigte sich nach Infarkt eine leichte Tendenz für das Vorhandensein von weniger apoptotischen Kernen in p47^phox-defizienten Mäusen als bei den Wildtyp-Tieren. Die Beobachtung der vorliegenden Arbeit, daß mehr apoptotische Zellen nach Infarkt im Grenzgebiet, als im nichtinfarzierten Myokard zu finden sind, stimmt mit den folgenden Aussagen anderer Studien überein.

Im Grenzgebiet liegen beim Menschen mehr apoptotische Zellen vor als im Vergleich zu den anderen Bereichen (SARASTE et al., 1997). Das Auftreten von apoptotischen Kardiomyozyten in Grenzgebieten zu subakuten und alten Infarkten ist hoch, aber die Zahlen variieren zwischen den Studien sehr stark (0,05 % - 35 %) (SARASTE et al., 1999, LATIF et al., 2000, SHAROV et al., 1996). Daneben besteht im Grenzgebiet, zwischen nichtinfarziertem und infarziertem Myokardgewebe, eine sehr große Wandbelastung (ANVERSA et al., 1993). Die NAD(P)H-Oxidase und ihre Untereinheit p47^phox scheinen v.a.

in diesem Bereich die Apoptose nach Myokardinfarkt in ungünstiger Weise zu fördern.

Der alleinige Nachweis der Apoptose durch den TUNEL-Assay ist als kritisch zu beurteilen.

Mit der TUNEL-Methode können auch nekrotische und sich DNA-Reparatur unterziehende Zellen als apoptotisch angesehen werden (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006). Die Aktivierung von Caspasen gilt als Indikator für die Apoptose, da auch heute noch, wie bereits im Jahre 1999 dokumentiert, kein Beweis für ein Caspase-unabhängiges Apoptosegeschehen existiert (SAMALI et al., 1999). Besonders der Nachweis von aktivierter Caspase-3, eines der ausführenden Enzyme der Apoptose, wird als sinnvoll für die Detektion der Apoptose anerkannt (TAKEMURA u. FUJIWARA, 2006). Daher fand bei den Untersuchungen die Durchführung eines Western-Blots für die Darstellung von aktivierter Caspase-3 im Grenzgebiet, zwischen nichtinfarziertem und infarziertem Myokardgewebe, statt. Die Auswahl des Grenzgebietes geschah deshalb, weil hier mit dem TUNEL-Assay eine stärkere Apoptose als im nichtinfarzierten Myokard beobachtet wurde. Mit dem Western-Blot erfolgte

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die Bestätigung der Ergebnisse der TUNEL-Methode. Auch andere Arbeiten detektierten, wie in diesem Projekt, die Caspase-3 im Zusammenhang mit der Herzinsuffizienz. Eine erhöhte Caspase-3-Expression trat in Verbindung mit Herzinsuffizienz und Apoptose bei Hunden auf (SABBAH et al., 2000). Die aktivierte Caspase-3 wurde im Myokard von Humanpatienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium, sowie bis zu 4 Wochen nach Myokardinfarkt im nichtinfarzierten Myokard von Mäusen, nachgewiesen (NARULA et al., 1999, SCHWARZ et al., 2006). Besonders der zuletzt aufgeführte Studienbefund unterstützt das Resultat dieser Arbeit, daß die aktivierte Caspase-3, auch noch 4 Wochen nach Myokardinfarkt, im Herzgewebe von Mäusen anzutreffen ist.

Es kann allerdings nur von einer Apoptose im allgemeinen gesprochen werden, da, die in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse, keine Rückschlüsse auf den Zelltyp zulassen. Im besagten Grenzgebiet sind nämlich nicht nur Kardiomyozyten, sondern auch sogenannte Entzündungszellen anzutreffen (Myofibroblasten, Makrophagen u.a.). Aber selbst die Apoptose von nichtmyozytären Zellen trägt nachweislich zum kardialen Remodeling nach Myokardinfarkt und zur Progression der Herzinsuffizienz bei (TAKEMURA et al., 1998, HAYAKAWA et al., 2003). Deshalb ist die geringere Apoptose im Grenzgebiet in p47^phox -defizienten Mäusen nach Myokardinfarkt, verglichen mit den Wildtyp-Tieren, im Hinblick auf das linksventrikuläre Remodeling, unabhängig vom Zelltyp, als sehr positiv zu beurteilen.

5.6 Matrixmetalloproteinasen

Bei tierexperimenteller und bei humaner Herzinsuffizienz wurde eine selektive Aktivierung von Matrixmetalloproteinasen gezeigt (THOMAS et al., 1998, ARMSTRONG et al., 1994, SPINALE et al., 1998). Die Aktivierung von MMPs kann durch eine Reihe von Stimuli verursacht werden, u.a. auch durch reaktive Sauerstoffspezies (SIWIK et al., 2001, NAKAMURA et al., 2002). Weiterhin ist bekannt, daß MMPs zum ventrikulären Remodeling nach Myokardinfarkt beitragen (SPINALE et al., 1999, PETERSON et al., 2001, ROHDE et al., 1999). Da die NAD(P)H-Oxidase ein Produzent von reaktiven Sauerstoffspezies ist und in dieser Studie ihr Einfluß, und insbesondere der ihrer Untereinheit p47^phox, auf das ventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt untersucht werden sollte, stellte sich die Frage, ob die

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MMPs in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen. Daher fand die Ermittlung der Aktivität der Matrixmetalloproteinasen 2 und 9, fünf Tage nach Infarkt, mit Hilfe der Zymographie statt. Die Auswahl der zu untersuchenden MMPs fiel auf MMP-2 und MMP-9, da sie in diversen tierexperimentellen Studien nach Myokardinfarkt induziert sind, und das ventrikuläre Remodeling, v.a. die linksventrikuläre Dilatation, zu fördern scheinen (HAYASHIDANI et al., 2003, PETERSON et al., 2000, ROMANIC et al., 2001, DUCHARME et al., 2000, TAO et al., 2004). Diese Arbeit ergab, bis auf zwei Ausnahmen, bei den p47^phox-defizienten Tieren eine Induktion von pro-MMP-9, pro-MMP-2 und aktivem MMP-2 nach Myokardinfarkt, im nichtinfarzierten und im infarzierten Myokard, sowie zwischen diesen beiden Bereichen (Grenzgebiet). Die aktive Form von MMP-2 nach Myokardinfarkt war bei den p47^phox-defizienten Tieren im Infarktgebiet, als auch im nichtinfarzierten Myokard, im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren, erniedrigt, jedoch nicht signifikant im Grenzgebiet. Die pro-MMP-9- sowie die pro-MMP-2-Spiegel unterschieden sich hingegen nicht bei den Wildtyp- und p47^phox-defizienten Mäusen nach Myokardinfarkt.

Im Vergleich zur pro-Form ist die aktive Form von MMP-2 die Bedeutendere für eine funktionelle Analyse in vivo (NAKAMURA et al., 1999, YAMANAKA et al., 2000). Ihr Höhepunkt liegt, wie häufig beschrieben, ca. um den 7. Tag nach Myokardinfarkt (MATSUMURA et al., 2005, TAO et al., 2004, CLEUTJENS et al., 1995). Da die aktive MMP-2-Form in 2 untersuchten Hauptgebieten nach MI bei den p47^phox-defizienten Mäusen, in bezug auf die Wildtyp-Tiere, vermindert war, kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die Untereinheit p47^phox der NAD(P)H-Oxidase die Aktivierung von MMP-2 und damit auch das MMP-2 bedingte Remodeling nach Myokardinfarkt fördert. Wie MMP-2-defiziente Mäuse wiesen auch die p47^phox-defizienten Tiere eine verminderte linksventrikuläre Dilatation und ein besseres Überleben, im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren nach Myokardinfarkt, auf (MATSUMURA et al., 2005, HAYASHIDANI et al., 2003). Das bessere Überleben der p47^phox-defizienten Tiere könnte durch eine geringere Rupturrate des Infarktgebietes des linken Ventrikels in den ersten Tagen nach Myokardinfarkt, wie es bei den erwähnten MMP-2-defizienten Mäusen der Fall war, erklärt werden. Die p47^phox-defizienten Tiere wiesen weniger Todesfälle in den ersten Tagen als die Wildtyp-Tiere auf, aber eine genaue Untersuchung der Todesursache erfolgte nicht. Eine Ursache der verminderten

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Dilatation des linken Ventrikels ist wahrscheinlich eine geringere MMP-2-Aktivität im nichtinfarzierten Myokard bei den p47^phox-defizienten Tieren.

Drei andere Studien beobachteten, wie in der vorliegenden Arbeit, keine Unterschiede in den MMP-9-Werten zwischen verschiedenen Gruppen von Tieren mit Myokardinfarkt. Der

Vergleich von Wildtyp- und MMP-2-defizienten Mäusen nach Myokardinfarkt ergab ähnliche MMP-9-Aktivitäten im nichtinfarzierten Myokard, sowie bei den Wildtyp-Tieren erhöhte

MMP-2-Werte (HAYASHIDANI et al., 2003). In mit Fluvastatin behandelten Mäusen nach Myokardinfarkt zeigten sich vergleichbare MMP-9-Spiegel in bezug auf unbehandelte Tiere, jedoch war MMP-2 in Mäusen ohne Fluvastatin deutlich erhöht, nicht aber in den behandelten Mäusen (HAYASHIDANI et al., 2002). Zwischen WT-, MMP-2-defizienten- und mit einem selektiven MMP-2-Inhibitor behandelten Mäusen bestand nach MI kein Unterschied hinsichtlich von pro-MMP-9; die aktive MMP-9-Form blieb undetektiert (MATSUMURA et al., 2005). Besonders die hier zuletzt beschriebene Studie spiegelt, trotz unterschiedlicher Rahmenbedingungen, das Resultat der vorliegenden Untersuchung für MMP-9 wider.

Die Messung der MMP-Aktivität in dieser Studie zu nur einem einzelnen Zeitpunkt kann nicht alle Veränderungen der MMP-Aktivitäten wiedergeben, die im Prozeß des ventrikulären Remodelings auftreten (TSURUDA et al., 2004), da die Aktivierung von MMPs nach Myokardinfarkt räumlich und zeitlich differenziert auftritt (PETERSON et al., 2000). Der frühe Zeitpunkt der Messung in dieser Studie wurde gewählt, da v.a. in den ersten Tagen nach Myokardinfarkt eine verstärkte MMP-Aktivierung stattfindet, und die Entwicklung der Infarktexpansion schon sehr zeitig nach dem Myokardinfarkt einsetzt (JANICKI et al., 2004, PFEFFER et al., 1991).