Hypertrophie und Fibrose

Die linksventrikuläre Hypertrophie und der fibrotische Umbau des Herzventrikels nach Myokardinfarkt sind mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Deshalb wurde der Einfluß der NAD(P)H-Oxidase, und insbesondere ihrer p47^phox-Untereinheit auf die linksventrikuläre Hypertrophie sowie die linksventrikuläre Fibrose, vier Wochen nach Myokardinfarkt, mit Hilfe der Bestimmung des Herzgewichtes, der Kardiomyozytenquerschnittsfläche, der Erfassung von Hypertrophiemarkern und der Färbung von Kollagenfasern ermittelt.

Die Gewichte der linken Ventrikel zeigten basal, d.h. bei den kontrolloperierten Wildtyp- und p47^phox-/--Tieren, ähnliche Werte (3,6 ± 0,2 vs. 3,9 ± 0,5 mg/g KG). Der Myokardinfarkt bewirkte eine Zunahme der Gewichte der linken Ventrikel (Wildtyp-Tiere: 6,2 ± 0,5 vs.

p47^phox-/--Tiere: 4,3 ± 0,1 mg/g KG), aber ohne eine Signifikanz bei den p47^phox-/--Mäusen zu erlangen, in bezug auf ihre Kontrolltiere. Die Gewichtssteigerung der linken Ventrikel bei den Tieren mit Myokardinfarkt fiel bei den p47^phox-/--Mäusen signifikant geringer aus als bei den Wildtyp-Tieren.

Die Gewichte der rechten Ventrikel der Wildtyp-Mäuse nach Myokardinfarkt stiegen im Vergleich zu den kontrolloperierten Tieren an (1,3 ± 0,2 vs. 0,9 ± 0,1 mg/g KG), jedoch trat bei den p47^phox-/--Tieren nach Myokardinfarkt, bezogen auf die Ausgangswerte der Kontrollen, keine Erhöhung der Gewichte auf (0,8 ± 0,03 vs.1,0 ± 0,06 mg/g KG).

Die kontrolloperierten Wildtyp- und p47^phox-/--Mäuse wiesen gleichartige Werte für die Gesamtgewichte der Herzen auf (4,5 ± 0,3 vs. 4,9 ± 0,2 mg/g KG). Im Gegensatz zu den Wildtyp-Tieren löste der Myokardinfarkt bei den p47^phox-/--Tieren keine eindeutig meßbare Zunahme der Gesamtgewichte der Herzen aus (7,5 ± 0,6 vs. 5,1 ± 0,2 mg/g KG).

Die Kardiomyozytenquerschnittsfläche unterschied sich bei den kontrolloperierten Mäusen, aber ohne eine signifikante Bedeutung zu erlangen (Wildtyp-Tiere: 258,1 ± 9,5 vs.

p47^phox-/--Tiere: 346,4 ± 22,4 µm²). Diese Abweichung könnte die leicht differenten Gewichte der linken Ventrikel der kontrolloperierten WT-Mäuse, im Vergleich zu den kontrolloperierten p47^phox-/--Tieren, erklären. Bei den Wildtyp-Mäusen mit Myokardinfarkt erhöhte sich die Kardiomyozytenquerschnittsfläche signifikant, jedoch nicht bei den p47^phox-/- -Mäusen (550 ± 34,4 vs. 406,6 ± 15,5 µm²), im Vergleich zu den Kontrolltieren.

Ergebnisse 81

Abbildung 10: A: Obwohl die Kardiomyozytenquerschnittsfläche der p47^phox-/--Kontrolltiere gegenüber der Fläche der WT-Kontrolltiere erhöht ist, fällt deren Vergrößerung nach MI bei den p47^phox-/--Tieren deutlich geringer aus als bei den WT-Mäusen (n=5-8). B: Auch das LV-Gewicht der p47^phox-/--Tiere ohne MI ist gegenüber dem der WT-Kontrollmäuse gering erhöht (n=10). Nach MI steigt nur das LV-Gewicht der WT-Tiere deutlich an.

Als Hypertrophiemarker wurden SkM-α-Aktin und ANP mittels Northern-Blot bestimmt und im Anschluß mittels der WT-Kontrollen die Ergebnisse der Marker in Prozent umgerechnet.

In beiden kontrolloperierten Tiergruppen war die Expression von SkM-α-Aktin ähnlich (Wildtyp-Tiere: 100 ± 30 vs. p47^phox-/--Tiere: 140 ± 20 %). Bei den Wildtyp-Tieren mit Myokardinfarkt stieg sie auf 430 ± 40 %, bei den p47^phox-/--Mäusen auf 280 ± 20 % an, dieser Unterschied ist signifikant.

Ergebnisse 82

A

0 100 200 300 400 500

SkM-α-Aktin (% WT-Kontrolle)

Sham MI Sham MI

WT p47

phox-/-P < 0,05 P < 0,05

B

SkM-αααα-Aktin

18 S

Sham MI Sham MI

WT p47

phox-/-P < 0,05

Abbildung 11: A: Die Menge von SkM-α-Aktin der p47^phox-/--Kontrolltiere ist gegenüber der Menge der WT-Kontrolltiere nur minimal erhöht, dennoch fällt deren Vergrößerung nach MI bei den p47^phox-/--Tieren deutlich geringer aus, als bei den WT-Mäusen (n=3-5). B: Repräsentative Northern-Blot-Analyse des SkM-α-Aktins (Die 18S-RNA-Banden dienten der Kalibrierung.)

Der Vergleich der kontrolloperierten Mäuse, hinsichtlich des ANPs, führte zu gleichartigen Ergebnissen (Wildtyp-Tiere: 100 ± 40 vs. p47^phox-/--Tiere: 130 ± 40 %). Nach Myokardinfarkt schien die ANP-Expression bei den Wildtyp-Tieren und bei den p47^phox-/--Tieren ähnlich anzusteigen (270 ± 80 vs. 280 ± 50 %), dennoch ergab der Vergleich zu den jeweiligen Kontrolltieren keine signifikante Abweichung.

Der Kollagenfasergehalt im nichtinfarzierten Myokard, bestimmt mit der Siriusrot-Färbung, stellte sich nicht signifikant verschieden bei den kontrolloperierten Wildtyp- und p47^phox-/- -Tieren dar (100 ± 35 vs. 49 ± 30 %). Die Tiere mit Myokardinfarkt wiesen eine Erhöhung der Kollagenfasern auf (Wildtyp-Mäuse: 436 ± 42 vs. p47^phox-/--Mäuse: 163 ± 56 %), wobei die p47^phox-/--Tiere einen signifikant niedrigeren Kollagenfasergehalt zeigten.

Ergebnisse 83

0 100 200 300 400 500 600

Sham MI Sham MI

WT p47

phox-/-P < 0,01 P < 0,01

Interstitielle Kollagenfraktion (% WT-Kontrolle)

P < 0,01

Abbildung 12: Interstitieller Kollagenfasergehalt der untersuchten Mausgruppen (n=6-8). Die Zunahme der Kollagenfasern nach MI fällt bei den p47^phox-/--Tieren signifikant kleiner aus.

4.8 Apoptose

Das vermehrte Absterben von Kardiomyozyten durch Apoptose ist ein prominentes Merkmal der Herzinsuffizienz und des Myokardinfarktes. Die Wirkung der NAD(P)H-Oxidase, insbesondere die ihrer Untereinheit p47^phox, auf die Apoptose der Zellen im linken Ventrikel wurde mit dem TUNEL-Assay und einem Western-Blot zur Caspase-3-Expressionsbestimmung, 4 Wochen nach Myokardinfarkt, untersucht.

In der Grenzzone zwischen nichtinfarziertem Myokard und Infarktgebiet waren bei den kontrolloperierten Tieren der Wildtyp- und der p47^phox-/--Gruppe ähnlich viele apoptotische Zellen vorhanden (0,3 ± 0,1 vs. 0,7 ± 0,4 %). Bei den Tieren mit Myokardinfarkt erhöhte sich die apoptotische Zellzahl, wobei die p47^phox-/--Mäuse signifikant weniger apoptotische Zellen, im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen, aufwiesen (6,9 ± 1,1 vs. 11,7 ± 0,9 %).

Ergebnisse 84

B A

P < 0,01 P < 0,05

Sham MI Sham MI

WT p47

phox-/-TUNEL-positive Kerne / Gesamtzellkernzahl (%)

0 2 4 6 8 10 12 14

P < 0,01

Abbildung 13: A: Positiv im Grenzgebiet mit der TUNEL-Methode detektierte Zellkerne pro Gesamtzellkernzahl (n=4-7). B: Beispielbilder von apoptotischen Kernen (mit Pfeilen makiert). Links:

Überlagerung von TUNEL- und Kernfärbung (grün bzw. blau). Rechts: ausschließlich Kernfärbung (blau).

Im nichtinfarzierten Myokard stieg die Zahl der apoptotischen Zellen bei den Wildtyp-Tieren mit Infarkt, in bezug auf den Kontrollwert, gering an (2,4 ± 0,5 vs. 0,3 ± 0,1 %), die p47^phox-/- -Mäuse mit Infarkt zeigten, hinsichtlich ihrer Kontrolltiere, keine signifikante Zunahme (2,0 ± 0,2 vs. 0,7 ± 0,4 %). Die Zahl der apoptotischen Zellen unterschied sich fast nicht bei den myokardinfarktoperierten Tieren.

Die Caspase-3-Expression in der Grenzzone zwischen nichtinfarziertem Myokard und Infarktgebiet war nahezu gleich in den beiden kontrolloperierten Tiergruppen (Wildtyp-Tiere:

100,0 ± 0,0 vs. p47^phox-/--Tiere: 112,24 ± 43,46 %). Der Myokardinfarkt bewirkte eine Steigerung der Caspase-3-Expression (Wildtyp-Tiere: 5218,6 ± 1304,0 vs. p47^phox-/--Tiere:

1465,0 ± 243,8 %), die aber innerhalb der p47^phox-/--Gruppen deutlich geringer ausfiel als bei den Wildtyp-Gruppen. Im direkten Vergleich der Myokardinfarktgruppen besaßen die p47^phox-/--Mäuse eine signifikant niedrigere Caspase-3-Expression.

Ergebnisse 85

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Caspase-3-Expression (% WT-Kontrolle) A

P < 0,05 P < 0,01

Sham MI Sham MI

WT p47

phox-/-B

Caspase-3

Sham MI WT

Sham MI p47 phox-/-19 kDa

P < 0,05

Abbildung 14: A: 3-Expression im Grenzgebiet der untersuchten Mausgruppen (n=4-5). Die Caspase-3-Expression ist deutlich höher bei den WT-Tieren als bei den p47^phox-/--Mäusen nach Myokardinfarkt. B:

Repräsentative Western-Blot-Analyse des 19 kDa großen Fragmentes der aktivierten Caspase-3.