3. METHODEN
3.22 Western-Blot
Substanzen, Materialien, Geräte Bezugsquelle
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA
5 % BSA:
Albumin from bovine serum: 2,5 g / 50 ml TBS-T
Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Caspase-3 Control Cell Extracts Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA
Chromatographiepapier MN 218 Machery - Nagel, Düren
Cleaved Caspase-3 (Asp 175) Antibody Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA
Isopropanol: 2 - Propanol Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Kodak Scientific Imaging Film:
X - OmatTM Blue XB - 1
Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA
Laemmli Sample Puffer (950 µl) mit β-Mercaptoethanol (50 µl)
Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA
Methoden 68
Substanzen, Materialien, Geräte Bezugsquelle 5 % Milch:
Blotting Grade Blocker, Non - Fat Dry Milk:
2,5 g / 50 ml TBS-T
Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA
Nitrocellulosemembran: Hybond ECLTM Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg
Precision Plus ProteinTM Standards Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA
RIPA-Puffer siehe Methode Proteinbestimmung
Sammelgel:
• Aqua bidest.: 6,8 ml;
Gerät: Nanopure
• Tris-aminomethan: 1,25 ml einer 1 M Lösung, pH = 6,8
• 30 % Acrylamid: 1,7 ml
• SDS: 0,1 ml einer 10 % Lösung
• Ammoniumpersulfat: 0,2 ml einer 10 % Lösung
• Tetramethylethylendiamin: 0,02 ml
Wilhelm Werner GmbH, Leverkusen Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Bio-Rad Laboratories GmbH, München Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA,
• Natriumchlorid (NaCl): 80 g ad 1 l Aqua bidest., pH = 7,6 1x TBS-T:
• 10x TBS: 50 ml
• Tween 20: 0,5 ml
ad 0,5 l Aqua bidest.
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Merck KGa A., Darmstadt
Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA
Methoden 69
• 10x Transferpuffer: 100 ml
• Methanol: 200 ml ad 1 l Aqua bidest.
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Mallinckrodt Baker, Griesheim Trenngel (12 %):
• Aqua bidest.: 6,6 ml;
Gerät: Nanopure
• Tris-aminomethan: 5,0 ml einer 1,5 M Lösung, pH = 8,8
• 30 % Acrylamid: 8,0 ml
• SDS: 0,2 ml einer 10 % Lösung
• Ammoniumpersulfat: 0,2 ml einer 10 % Lösung
• Tetramethylethylendiamin: 0,008 ml
Wilhelm Werner GmbH, Leverkusen Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Bio-Rad Laboratories GmbH, München Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA,
Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA
Auswertungsprogramm: Quantity One 4.0.3 Bio-Rad Laboratories GmbH, München Autoradiographiekassette: HypercassetteTM Amersham Biosciences, Cambridge,
England
Bio-Rad-Analysesystem: Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Methoden 70
Substanzen, Materialien, Geräte Bezugsquelle Elektrophorese- und Blottingapparatur mit
Bio-Rad Pac 300 und Zubehör, Casting stand, Casting frame, Short Plates (Mini Protean 3), Outer Glass Plates (Spacer Plates) W / 1,5 mm,
Comb, 9 tooth, 1,5 mm THK
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Entwickler: Optimax X-Ray Film Processor, Modell: 1170-1-000
Protec Medizintechnik GmbH & Co. KG, Oberstenfeld
Schüttler: Heidolph Duomax 1030 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Der Western-Blot stellt eine Methode dar, um Proteine in vorgegebenen Proben quantitativ und qualitativ zu bestimmen. Hier kam er zur Anwendung, um aktivierte Formen des Enzyms Caspase-3 zu detektieren. In den Signalwegen der Apoptose stellt Caspase-3 ein Hauptenzym dar.
Eine Proteinmenge von 50 µg wurde von den homogenisierten Übergangsbereichen vom Infarktgebiet zum nichtinfarzierten Myokard des linken Ventrikels, zunächst mit RIPA-Puffer auf 15 µl und anschließend mit Laemmli-Puffer auf ein Endvolumen von 30 µl aufgefüllt, und für 10 min bei 95 °C denaturiert. Der Laemmli-Puffer enthält neben einem Färbemittel sowohl Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS), welches den Proteinen eine einheitliche negative Ladungsdichte verleiht, als auch β-Mercaptoethanol, das die Neubildung von Sekundärstrukturen der Proteine verhindert. Die Proben, eine Positiv- und Negativkontrolle sowie ein Proteinmarker, der zur Größenerkennung der Proteinfraktionen dient, wurden zur gleichmäßigen Ausrichtung in Vertiefungen des Sammelgels eingebracht, und mit Hilfe eines 12%igen Polyarcrylamidgels, bei 50 mA für 1 - 2 Stunden elektrophoretisch in Tris/Glycin/SDS-Puffer aufgetrennt.
In einem Gelgießstand wurde zwischen 2 Glasplatten, bis ungefähr 2 cm unterhalb des oberen Randes, zuerst das Trenngel eingefüllt, mit Isopropanol überschichtet, das nach dem Auspolymerisieren des Trenngels entfernt werden konnte. Auf das Trenngel erfolgte das
Methoden 71
Gießen des Sammelgels und das Einbringen eines Kammes in dieses Gel, um die Probenkammern zu erzeugen.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine fand nun der Transfer der Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran zur späteren Detektion mittels Antikörpern statt.
Das Sammelgel wurde dazu abgetrennt und verworfen. Das Trenngel gelangte luftblasenfrei, von außen gesehen, zwischen zwei für Flüssigkeit durchlässige Plastikscheiben, zwei mit Transferpuffer getränkte Schwämme und zwischen zwei mit Transferpuffer eingeweichte Chromatographiepapiere. Auf dem Trenngel kam die in Transferpuffer eingeweichte Nitrocellulosemembran zum Liegen. Dieser als „Sandwich“ bezeichnete Aufbau wurde in eine mit Transferpuffer gefüllte, und mit einem Kühlelement ausgestattete Blot-Kammer eingesetzt, und diese an eine Spannungsquelle bei 320 mA für 1,5 Stunden angeschlossen.
Die Nitrocellulosemembran wurde nach dem Transfer entnommen und mit der transferierten Seite nach oben, in einer Schale mit 5%iger Milch, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen abzudecken. Nach zwei 10minütigen Waschgängen mit TBS-T erfolgte die Zugabe des im Verhältnis 1:1000 in 5%igem Bovinen-Serum-Albumin (BSA) verdünnten 1. Antikörpers (Cleaved Caspase-3), der die großen Fragmente des aktivierten Caspase-3-Enzyms erkennt (17, 19 kDa). Dieser Antikörper wirkte über Nacht bei 4 °C und leichten Schüttelbewegungen ein. Am nächsten Tag wurde der ungebundene Antikörper durch zweimal 10minütiges Waschen mit TBS-T entfernt, und der 2. Antikörper, 1:3500 verdünnt in 5%iger Milch, auf die Nitrocellulosemembran, die sich auf einem Schüttler befand, für 1 Stunde unter Raumtemperaturbedingungen, appliziert. Der Zweitantikörper (Anti-rabbit IgG) ist gegen den Erstantikörper gerichtet und mit Meerrettichperoxidase konjugiert. Ein mehrmaliger Waschvorgang mit TBS-T (fünfmal 6 min) beseitigte auch hier den ungebundenen Antikörper. Der Nachweis der Antikörperkomplexe fand mit einem ECL-Western-Blot-Detektions-Kit statt. Die beiden Reagenzien wurden im Verhältnis 1:1 miteinander vermischt und für 1 min auf die Nitrocellulosemembran gebracht. Die Meerrettichperoxidase des 2. Antikörpers reagiert mit diesen Substanzen, sie katalysiert unter alkalischen Bedingungen mit Wasserstoffperoxid die Oxidation von Luminol zu einem Dioxetan, welches schnell zerfällt und dabei Lichtphotonen freisetzt, die mittels Autoradiographie nachgewiesen werden. Die Membran wurde mit
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Chromatographiepapier von anhaftender Flüssigkeit befreit, in eine Autoradiographiekassette eingefügt, und mit Klarsichtfolie bedeckt. Auf die Folie wurden Röntgenfilme für 40 s bis zu 5 min aufgelegt, und anschließend entwickelt.
Die densitometrische Auswertung der Röntgenfilme erfolgte mit einem Bio-Rad-Analysesystem und dem Programm Quantity One.
Auf den Filmen waren die Banden der 19 kDa Form der aktivierten Caspase-3 in folgender Reihenfolge sichtbar: zuerst die kontrolloperierten WT- und MI-WT-Tiere, danach die kontrolloperierten p47phox-/-- und MI-p47phox-/--Tiere. Die densitometrisch ermittelten Werte wurden auf die kontrolloperierten WT-Mäuse bezogen, und in Prozent ausgedrückt.