3. METHODEN
3.13 Northern-Blot
Substanzen, Materialien, Geräte Bezugsquelle
(α32P)dCTP-Lösung (3000 Ci/mmol) Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg
(γ32P)-ATP-Lösung (6000 Ci/mmol) Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg
Agarose ultrapure Life Technologies, Paisley, Schottland Aqua bidest.: Gerät: Nanopure Wilhelm Werner GmbH, Leverkusen DEPC:
Herstellung von DEPC-Wasser:
1:1000 mit Aqua bidest. verdünnen, über Nacht rühren, dann 20 min autoklavieren
Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
DNA-Sonde (pre-pro-ANF) Leihgabe von AG Wollert, MHH, Hannover
Methoden 45
Substanzen, Materialien, Geräte Bezugsquelle Ethidiumbromid:
Herstellung einer 0,1 % Lösung mit Auqa bidest.
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Filterpapier: Chromatographiepapier MN 218
Machery - Nagel, Düren
High Prime DNA Labeling Kit Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA
Hybridisierungslösung: Express HybTM Hybridization Solution
Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA
Membran: Hybond-NX Amersham Biosciences Europe GmbH,
Freiburg 10x Mops-Puffer:
• Mops free acid - Morpholin-Propan- Sulfonsäure (C7H15NO4S): 41,86 g/l
• Natriumacetat (C2H3O2Na): 4,102 g/l
• EDTA - Ethylendiamin tetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat: 3,722 g/l ad 1 l mit DEPC-Wasser, mit Natronlauge auf pH = 7,0 einstellen, autoklavieren für 1 Stunde, lichtgeschützt aufbewahren;
Herstellung von 1x Mops-Puffer:
Verdünnung mit Auqa bidest.
Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Oligo-dT-Primer
(SkM-α-actin - 50 pmol/µl)
MWG-Biotech AG, Ebersberg
Methoden 46
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Merck KGa A., Darmstadt
Merck KGa A., Darmstadt
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Säulen:
Micro SpinTM S-200 HR columns, Micro SpinTM G-50 columns
Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg
20x SCC-Puffer:
• Natriumchlorid (NaCl): 876,5 g/5 l
• tri-Natriumcitrat-Dihydrat (C6H5Na3O7*2H2O): 441 g/5 l pH = 7,0
Herstellung von
5x-, 2x-, 0,4x-, 0,1x- SCC-Puffer:
• Verdünnung mit Aqua bidest.
Merck KGa A., Darmstadt
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
SDS Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
T4-Polynukleotid-Kinase (10000 U/ml) New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA
10x T4-Polynukleotid-Kinase-Reaktionspuffer
New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA
TE-Puffer (Tris-EDTA-Puffer):
• 1 M Tris-aminomethan-Lösung: 10 ml
• 0,5 M EDTA-Lösung: 2 ml ad 1 l Auqa bidest., autoklavieren
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
Methoden 47
Substanzen, Materialien, Geräte Bezugsquelle Auswertungsprogramm: PCBAS, Version
2.09f
Fuij Photo Film Co., Ltd., Japan
Bio-Rad-Analysesystem: Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München Geigerzähler: Gamma-Scout® PCE Group oHG, Meschede
Gelkammersystem, Bio-Rad Power Pac 300 Bio-Rad Laboratories GmbH, München Glashybridisierungsröhre Schott AG, Mainz
Hybridisierungsofen 640 Bachofer Laboratoriumsgeräte GmbH Mikrowelle M 1719 N Samsung Electronics GmbH, Schwalbach Phosphoimager: BAS-1000 Raytest GmbH, Straubenhardt
Temperierbad IKA® TER 2 IKA®Werke GmbH + Co. KG, Staufen Universalschrank, basic Memmert GmbH + Co. KG, Büchenbach Zentrifuge: eppendorf Centrifuge 5415 R Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH,
Wesseling - Berzdorf
Der Northern-Blot dient dazu, um in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte RNA auf eine Nitrocellulosemembran oder einen Nylonfilter, mit Hilfe von Kapillarkräften oder einem elektrischen Feld, für die anschließende Hybridisierung (Basenpaarung zwischen Einzelsträngen der DNA und der komplementären RNA) mit radioaktiv markierten DNA-Sonden zu übertragen, um spezifische Sequenzen zu ermitteln.
Zur Auftrennung der RNA wurde ein 1,2%iges Agarosegel verwendet. Eine Menge von 0,72 g Agarose kam in 54 ml DEPC-Wasser zum Aufkochen in der Mikrowelle, anschließend erfolgte die Zugabe von 6 ml 10x Mops-Puffer. Nach kurzem Schwenken und Abkühlen auf ca. 60 °C fand das Eingießen der Mischung in eine zuvor mit 70%igem Ethanol gereinigte, an den Seiten verklebte, sowie mit einem Gelkamm versehene Gelkammer statt. Nach dem Aushärten des Gels wurden 5 µg RNA pro Probe in die Geltaschen eingebracht. Das Gesamtladevolumen pro Probe betrug 30 µl, d.h. 5 µg RNA wurden mit 5x RNA-Ladepuffer im Verhältnis 1:5, 1 µl Ethidiumbromid und DEPC-Wasser auf dieses Volumen aufgefüllt, dann bei 70 °C für 10 min erhitzt, auf Eis gestellt und kurz bei 4 °C zentrifugiert. Die Auftrennung der RNA spielte sich in 1x Mops-Puffer bei 80 V ab, nachdem die RNA 2/3 bis 3/4 der Trennstrecke, sichtbar an dem Farbstoff Bromphenolblau, durchlaufen hatte. Das Gel
Methoden 48
konnte mit Hilfe eines Gel-Doc-Systems (UV-Transilluminator) fotografiert werden. Der anschließende Transfer der aufgetrennten RNA geschah mit Kapillarkräften in 5x SCC-Puffer. Dazu wurde der Puffer in ein Behältnis eingefüllt, eine Plexiglasscheibe über das Behältnis gelegt, 3 Lagen Filterpapier von der Glasscheibe in den Puffer eingehängt, auf das
in den Puffer ragende Filterpapier zuerst das Gel, als zweites die Membran, als drittes 3 weitere Filterpapierschichten aufgetragen und mit Parafilm gut umschlossen. Nach dem
Transfer über Nacht fand die Fixierung der RNA auf der Membran statt. Zu diesem Zweck wurde die Membran in dem erwähnten Gel-Doc-System, mit der RNA-Seite nach unten zeigend, ausgerichtet, für 2 min mit UV-Licht bestrahlt, und für 1 Stunde bei 80 °C im Wärmeschrank inkubiert. Für die folgende Hybridisierung gelangte die kurz vorher in Waschpuffer (2x SSC, 0,1%iges SDS) eingeweichte und auf eine Glaspipette aufgewickelte Membran, mit der RNA-Seite nach innen weisend, in eine Glashybridisierungsröhre.
Zunächst wurde, je nach Größe der Membran, mit 10 oder 20 ml aufgetauter (bei Raumtemperatur) Hybridisierungslösung eine Vorhybridisierung für 1 Stunde bei 63 °C in einem Hybridisierungsofen, unter rotierenden Bewegungen der Hybridisierungsröhre, vorgenommen. Daraufhin geschah die Zugabe von radioaktiv markierten, komplementären Oligonukleotid-dT-Primern bzw. einer radioaktiv markierten DNA-Sonde, die mit der spezifisch gesuchten Ziel-RNA bei 63 °C über Nacht unter Rotationsbewegungen hybridisierten.
Die verwendeten Oligonukleotid-dT-Primer wurden von einer Firma angefertigt, die DNA-Sonde von einer Arbeitsgruppe zur Verfügung gestellt.
SkM-α-Aktin: Oligo-dT-Primer (vorwärts):
5´-TGG AGC AAA ACA GAA TGG CTG GCT TTA ATG CTT CAA-3´
ANP-DNA-Sonde: pre-pro-ANF (WOLLERT et al., 1996).
Zur radioaktiven Markierung der DNA-Sonde fand das „random priming“ Verwendung.
Hierbei wird die zu markierende doppelsträngige DNA in die beiden Einzelstränge denaturiert und mit Zufallshexameren bzw. -nonameren hybridisiert, die dann als Primer für eine DNA-Polymerase dienen. Die Markierung erfolgt durch den Einbau von radioaktiven Nukleotiden.
Dazu wurden 3 µl (25 ng) DNA mit 10 µl Aqua bidest. vermengt, 10 min gekocht, um die DNA in die Einzelstränge zu denaturieren und für 2 min auf Eis gestellt. Dann erfolgte auf Eis die Zugabe von 4 µl 5x konzentrierter „High Prime“ Lösung (enthält „random Primer“,
Methoden 49
Klenow Polymerase, Reaktionspuffer, Nukleotide außer dCTP) und 3 µl 5 µCi (α32 P)dCTP-Lösung, dieser Ansatz wurde 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Eine Erhitzung, bei 65 °C für 10 min, beendete die Reaktion.
Oligonukleotide werden an ihrem 5´-Ende markiert. Dabei wird mit Hilfe der T4-Polynukleotid-Kinase der radioaktive Phosphatrest von (γ32P)-ATP auf das
dephosphorylierte 5´-Ende des Oligonukleotides übertragen. Eine Menge von 1 µl Oligonukleotid-dT-Primer wurde mit 12 µl Aqua bidest., 2 µl T4-Polynukleotid-Kinase-Puffer, 1 µl T4-Polynukleotid-Kinase und 4 µl (γ32P)-ATP-Lösung, für 2,5 Stunden bei 37 °C, inkubiert. Auch hier brachte eine Erwärmung, bei 65 °C für 10 min, die Reaktion zum Stillstand.
Zur Aufreinigung der radioaktiv markierten DNA-Sonde kamen Micro-Spin-S-200-HR-Säulen zum Einsatz. Die Micro-Spin-S-200-HR-Säulen enthalten ein Sephacrylgelbett, welches von TE-Puffer umgeben wird. Große Moleküle (DNA) können schnell durch das Sephacrylgelbett wandern, kleine Moleküle (ungebundene Nukleotide) werden zurückgehalten. Ein Schütteln der Säule bewirkte die homogene Verteilung des Sephacrylgelbettes. Die obere Verschlußkappe der Säule wurde etwas geöffnet und der Bodenverschluß entfernt. Die Platzierung der Säule erfolgte in einem verschraubbaren 1,5 ml Reaktionsgefäß und eine Zentrifugation mit 3000 rpm für 1 min fand statt, um den Puffer aus der Säule zu entfernen. Danach kam die Säule in ein neues, verschraubbares 1,5 ml fassendes Reaktionsgefäß, die Verschlußkappe wurde vollständig entfernt und die markierte DNA, aufgefüllt auf ein Endvolumen von 50 µl mit 1x TE-Puffer, in die Mitte des Sephacrylgelbettes aufgetragen. Eine erneute Zentrifugation mit 3000 rpm für 2 min bewirkte, daß sich die markierte und jetzt gereinigte DNA am Boden des Reaktionsgefäßes sammelte. Diese DNA wurde für 5 min bei 95 °C gekocht, auf Eis gestellt und zur vorhybridisierten Membran dazupipettiert.
Micro-Spin-G-50-Säulen fanden zur Aufreinigung der radioaktiv markierten Oligonukleotide Verwendung. Sie enthalten ein Sephadexgelbett. Die Reinigungsprozedur lief ab, wie oben bei den Micro-Spin-S-200-R-Säulen beschrieben, außer, daß die markierten Oligonukleotide nicht auf ein Endvolumen mit TE-Puffer aufgefüllt, und am Ende der Reinigung nicht gekocht wurden.
Methoden 50
Nach der Hybridisierung schloß sich die Waschphase in der Hybridisierungsröhre bei Raumtemperatur unter Rotationsbewegungen an. Die Hybridisierungslösung wurde abgegossen, 2x SSC-Puffer mit 0,1%igem SDS diente zur gründlichen Spülung der Membran, nach dem Verwerfen des Puffers gelangte frischer 2x SSC-Puffer mit 0,1%igem SDS für 10 min zu der Membran. Wieder wurde dieser entfernt, und die Membran dann mit 0,4x SSC-Puffer mit 0,1%igem SDS für 30 min, mit 0,1x SSC-SSC-Puffer ohne SDS für 5 min, und anschließend kurz mit Aqua bidest. gewaschen. Ein Geigerzähler ermittelte die Radioaktivität der Membran. Die Trocknung der Membran mit Filterpapier, das Einpacken in Folie, folgten.
Am nächsten Tag wurde mit einem Phosphoimager ein Bild von der Membran erstellt, und die sichtbaren Banden auf diesem Bild, mit dem Programm PCBAS, quantitativ ausgewertet.
Die densitometrisch dedektierten Werte der Banden der Ziel-RNA wurden gegen die für die 18S-RNA ermittelten Werte normalisiert, welche nach der RNA-Auftrennung im Agarosegel gemessen worden waren.
3.14 Bestimmung des Kollagengehaltes (Siriusrot)