Aus der Klinik für Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Kritische Rolle des Glukokortikoidrezeptors in Makrophagen für die Heilung und das
Remodeling nach Myokardinfarkt
Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Julian Hövelmann
aus Münster
Hannover 2019
30.10.2020
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Johann Bauersachs
1. Referent/in: Prof. Dr. med. Florian Limbourg 2. Referent/in: Prof. Dr. med. vet. Reinhold Förster
Tag der mündlichen Prüfung: 30.10.2020
Prüfungsausschuss:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Thomas Werfel 1. Prüfer/in: Prof.‘in Dr. med. Heike Bantel 2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Torsten Witte
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... III Abkürzungsverzeichnis ... V Abbildungsverzeichnis ... VIII Tabellenverzeichnis ... IX
Einleitung ... 1
Myokardinfarkt und ventrikuläres Remodeling ... 1
Herzinfarktmodelle ... 2
Infarktheilung ... 3
Monozyten/Makrophagen ... 5
Makrophagenpopulationen im Herz ... 7
Myeloide Immunzellen und Heilung nach Myokardinfarkt ... 8
(Myo)Fibroblasten: Regulatoren/Effektoren der Infarktheilung ... 11
Glukokortikoide ... 14
Material ... 17
Methoden ... 23
Versuchstiere ... 23
Myokardinfarzierung ... 24
Hämodynamische Messungen ... 26
Bestimmung der Infarktgröße ... 27
Kollagengehalt der Infarktnarbe ... 28
Immunhistochemie/Charakterisierung der Neoangiogenese mittels CD31/α-SMA ... 30
Immunfluoreszenz ... 31
Immunzytofluoreszenz ... 35
Isolation kardialer Monozyten/Makrophagen sowie Fibroblasten/Myofibroblasten ... 36
Grundlagen der Durchflusszytometrie ... 38
Zellsortierung ... 41
Zymographie und reverse Zymographie ... 41
Statistische Auswertung ... 42
Ergebnisse ... 43
Kaplan-Meier-Überlebenskurven ... 44
Hämodynamische Messungen ... 45
Kollagenneubildung ... 49
Neoangiogenese ... 51
Differenzierung und Reifung von Monozyten/Makrophagen ... 52
(Myo)Fibroblasten ... 61
Diskussion ... 65
Rolle der Makrophagen für die Wundheilung nach Myokardinfarkt ... 65
GR-Deletion beeinträchtigt die Differenzierung/Reifung von aus Monozyten-hervorgegangenen Makrophagen ... 66
Beeinträchtigte Neoangiogenese in GRLysMCre-Tieren ... 66
GR in Makrophagen als kritischer Regulator für die (Myo-)Fibroblasten-Differenzierung ... 68
Glukokortikoide nach Myokardinfarkt ... 69
Effekte von Glukokortikoiden auf Monozyten/Makrophagen ... 70
Regulation der Glukokortikoid-Spiegel im Herz ... 71
Ausblick ... 72
Zusammenfassung ... 75
Literaturverzeichnis ... 76
Veröffentlichungen ... 92
Danksagung ... 93
Lebenslauf ... 94
Erklärung nach §2 Abs. 2 Nrn. 7 + 8 ... 96
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Ausgeschriebenes Wort
% Prozent
°C Grad Celsius
11β-HSD 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase
Abb. Abbildung
ACTA2 alpha smooth muscle actin gen
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AGM-Region aorta-gonad-mesonephros region
ALS Akuter Lungen Schaden
AM Alveolarmakrophagen
APC Allophycocyanin
BMDM bone marrow derived macrophages
bp Basenpaare
C57BL/6J Mauslinie
Cat. No. Katalog-Nummer
CBG corticosteroid-binding globulin,
CCR CC chemokine receptor
CD cluster of differentiation
cDNA complementary DNA
cm Zentimeter
Col1α1 collagen, type I, alpha 1
CRH corticotropin-releasing Hormone
CRH corticotropin-releasing-hormone
CXC CXC chemokine
CXCL C-X-C motif chemokine ligand
DAMP damage-associated molecular patterns
DC‘s Dendritic cells
DDR discoidin domain receptor
DNA desoxyribonucleic acid
EDTA Ethylendiamintetraacetat
et al. et alii/ et aliae, und andere
EZM extrazelluläre Matrix
FACS fluorescence-activated cell sorting
FBS fetal bovine serum
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FSC forward scatter
g Gravitationsfeldstärke
G Gauge
GR Glukokortikoidrezeptor
GRE glucocorticoid response element
GRflox Wildtyp-Mauslinie
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
High/hi High, hoch exprimiert
HPA-axis Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse
HSC hematopoietic stem cell
ICAM-1 intercellular adhesion molecule 1
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
k Kilo
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
KG Körpergewicht
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
KHCO3 Kaliumhydrogencarbonat
KO knock-out
L Liter
LAD left anterior descending coronary artery
LAVES Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
log Logarithmus
Low/lo Low, niedrig exprimiert
LV linksventrikulär
LVEDD Linksventriulärer enddiastolischer Durchmesser LVEDP Linksventrikulärer enddiastolischer Druck LVEDV Linksventrikuläres enddiastolisches Volumen
LVEF Linksventrikuläre Ejektionsfraktion
LVESV Linksventrikuläres endsystolisches Volumen LVSP Linksventrikulärer systolischer Druck
Ly-6C Lymphozyten-Antigen 6C
MDP monocyte/macrophages and DC precursors
MgSO4 Magnesiumsulfat
MHC major histocompatibility complex
MI Myokardinfarkt
ml Milliliter
mM Millimolar
Mm. lat. Musculi
MMP Matrix-Metalloproteasen
MPS Mononukleäres-phagozytäres System
mRNA messenger RNA
n Anzahl
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
nGRE negative glucocorticoid response element
Abkürzungsverzeichnis
NLRP3-Inflammasom Cryopyrin; kodiert durch NALP3
No. Nummer
Nr4a1 nuclear receptor subfamily 4 group A member 1
O2 Sauerstoff
p probaility value
PBS phosphate buffered saline
PCI percutaneous coronary intervention
PDGF platelet-derived growth factor
PDGFR platelet-derived growth factor receptors
PE Phycoerythrin
PEG poly-ethylene-glycol
PerCP Peridinin-Chlorophyll-Protein
PerCP Peridinin-Chlorophyll-Protein
pH lat. potentia hydrogenii
Postn periostin
PRR pattern recognition receptor
q-RT-PCR quantitative real time polymerase chain reaction
RBC red blood cells
RIVA Ramus interventricularis anterior
RNA ribonucleic acid
ROS reactive oxygen species
SDS sodium dodecyl sulfate
SEM standard error of mean
sham scheinoperiert
SMAD MAD (engl. mothers against decapentaplegic), S (engl. small body size)
SSC sideward scatter
SPF Specific pathogen free
TGF-β transforming growth factor-β
TierSchG Tierschutzgesetz
TierSchVersV Tierschutz-Versuchstierverordnung TIMP tissue inhibitor of metalloproteinases
TNF-α tumor necrosis factor α
ToF time of flight
UV Ultraviolettstrahlung
V Volt
VP Parallelvolumen
WGA Wheat germ agglutinin
α lat. alpha
α-SMA alpha smooth muscle actin
β lat. beta
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Phasen der Infarktheilung... 5
Abbildung 2: Residente Makrophagenpopulationen im Herz... 8
Abbildung 3: Phasen der Infarktheilung II... 11
Abbildung 4: Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse... 15
Abbildung 5: Strukturformel Kortisol und Kortison sowie deren Interkonversion... 15
Abbildung 6: Chirurgische Instrumente und Operationsvorbereitung... 25
Abbildung 7: Berechnung der relativen Infarktgröße... 27
Abbildung 8: Bestimmung des Kollagengehaltes der Infarktzone... 29
Abbildung 9: Immunfluoreszenzfärbung von Neutrophilen Granulozyten... 32
Abbildung 10: Immunfluoreszenzfärbung von Monozyten/Makrophagen... 33
Abbildung 11: Immunfluoreszenzfärbung von Granulozyten und Makrophagen... 35
Abbildung 12: Gating-Strategie zur Isolation kardialer Fibroblasten... 37
Abbildung 13: Herzperfusionssystem... 38
Abbildung 14: Zirkulierende Monozyten im Blut... 43
Abbildung 15: Subpopulationen zirkulierender Blutmonozyten... 44
Abbildung 16: Kaplan-Meier Überlebenskurven... 45
Abbildung 17: Druck-Volumen-Kurven des linken Ventrikels... 46
Abbildung 18: Repräsentative LV Querschnitte/Infarktgröße... 46
Abbildung 19: Hämodynamische Messungen des linken Ventrikels... 48
Abbildung 20: Pikro-Siriusrot-Färbungen der Infarktzone... 49
Abbildung 21: Polarisationsmikroskopie nach Pikro-Siriusrot-Färbung... 50
Abbildung 22: Kollagengehalt der Infarktnarbe... 50
Abbildung 23: Beeinträchtige Neoangiogenese sieben Tage nach MI... 51
Abbildung 24: Kapillardichte der Infarktnarbe... 52
Abbildung 25: FACS-Analyse von Makrophagen an Tag 0, 1 und 3 nach MI... 53
Abbildung 26: Veränderte Differenzierung von Makrophagen im infarzierten Myokard 55 Abbildung 27: FACS-basierte Quantifizierung von Makrophagen in der Infarktzone... 56
Abbildung 28: Immunzytofluoreszenzfärbung von Makrophagen drei Tage nach MI... 56
Abbildung 29: MA plot der differentiellen Genexpression... 57
Abbildung 30: Quantitative real-time PCR-Untersuchungen von Makrophagen... 59
Abbildung 31: Immunfluoreszenzfärbung für CD68 und TGF-β1... 60
Abbildung 32: Immunfluoreszenzfärbung für CD68 und MMP-13... 61
Abbildung 33: FACS-Analyse und Gating-Strategie zur Isolation (Myo)Fibroblasten... 62
Abbildung 34: Quantitative real-time PCR-Untersuchungen von (Myo)Fibroblasten... 63
Abbildung 35: Ergebnisse der Zymographie sowie der reversen Zymographie... 64
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Geräte und Utensilien ... 17
Tabelle 2: Chirurgische Instrumente/Material ... 18
Tabelle 3: Chemikalien ... 19
Tabelle 4: Puffer ... 19
Tabelle 5: Reagenzien und Kits Immunhistochemie/Immunfluoreszenz ... 20
Tabelle 6: Antikörper Immunhistochemie ... 20
Tabelle 7: Antikörper Immunfluoreszenz ... 21
Tabelle 8: Reagenzien und Kits der Durchflusszytometrie ... 22
Tabelle 9: Antikörper Durchflusszytometrie ... 22
Einleitung
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die weltweit häufigste Todesursache. Dabei repräsentieren sie einen Anteil von etwa 30% aller weltweiten Tode.1 In einer Erhebung des Statistischen Bundesamtes stellten die chronische ischämische Herzkrankheit, der akute Myokardinfarkt (MI) sowie die Herzinsuffizienz die drei häufigsten Todesursachen im Jahr 2015 in Deutschland dar.2 Auch in Entwicklungsländern zeigen ischämische Herzerkrankungen eine stark ansteigende Tendenz.3, 4
Ein ungünstiger Verlauf der Infarktheilung nach einem Myokardinfarkt sowie ein sich daran anschließendes ungünstiges kardiales Remodeling, führen zu einer eingeschränkten linksventrikulären (LV) Funktion des Herzens. Diese Prozesse bilden die strukturelle Basis für die Entwicklung einer ischämischen Herzinsuffizienz, welche eine erheblich gesteigerte Morbidität und Mortalität zur Folge hat.5-8 Weltweit leiden etwa 23 Millionen Menschen unter einer Herzinsuffizienz, deren häufigste Ursache der Myokardinfarkt ist.9, 10
Myokardinfarkt und ventrikuläres Remodeling
Der Begriff des ventrikulären Remodelings wurde von Pfeffer et. al11 erstmals im Jahre 1985 geprägt.12 Er umfasst komplexe kurz- und langfristige Veränderungen in Größe, Form, Funktion sowie zellulärer und molekularer Zusammensetzung des linken Ventrikels in Folge eines Myokardinfarktes.7, 13 Dabei kommt es unter anderem zu einer progressiven Dilatation des Ventrikels sowie zu einer Wandausdünnung im Infarktgebiet, was schließlich zu einer eingeschränkten Pumpfunktion der linken Herzkammer führt.12, 14 Nach einem Myokardinfarkt konvergieren eine Vielzahl von pathophysiologischen Faktoren, die das ventrikuläre Remodeling beeinflussen. Dabei betrifft das LV strukturelle Remodeling sowohl die Infarktzone als auch das verbleibende überlebende Myokard.5 Einer der Hauptdeterminanten bleibt jedoch das Ausmaß des initialen Infarktes sowie die Suffizienz der sich anschließenden reparativen Prozesse nach MI.7, 15
Die meisten Myokardinfarkte resultieren aus der akuten Ruptur einer vorbestehenden atherosklerotische Plaques, was zu einer Thrombusformation in der Koronararterie führt.16 Das Ausmaß des Myokardinfarktes, die Infarktextension, ist dabei abhängig vom Versorgungsgebiet der okkludierten Koronararterie mit daraus resultierender Menge des betroffenen Myokards, der Zeit bis zu einer effektiven Reperfusion sowie des myokardialen
Einleitung
Energieverbrauches während der Ischämie.15 In der klinischen Praxis wird die Infarktextension durch frühe Reperfusion, durch interventionelle Therapien sowie durch definierte Pharmakotherapie begrenzt.5, 7, 12 Im Gegensatz dazu erweist sich das therapeutische Management, welches das ventrikuläre Remodeling nach MI positiv beeinflussen könnte, als deutlich komplexer und anspruchsvoller.7
Herzinfarktmodelle
Die Anwendung von Tiermodellen hat wesentlich zum aktuellen Wissenstand sowie zur Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Ansätze in Bezug auf kardiovaskuläre Krankheitsbilder beigetragen.17 Sie ermöglichen es in vivo unser Verständnis über die Pathogenese, die Progression sowie die zugrundeliegenden Mechanismen von kardiovaskulären Erkrankungen zu erweitern und außerdem neue therapeutische Ansätze zur Wiederherstellung der Organfunktion nach Gewebeschädigung zu testen.18 Die Ligatur des Ramus interventricularis anterior (RIVA, LAD) – entweder permanent (Myokardinfarkt) oder vorübergehend (Ischämie/Reperfusion) – stellen die chirurgischen Standardtechniken zur Induktion einer myokardialen Ischämie bei Nagern in der präklinischen Forschung dar.19 Besonders die Anwendung dieser experimentellen Modelle bei genetisch veränderten Mäusen hat wesentlich zur Identifizierung von in Remodeling-Prozessen involvierten Zielgenen und zellulären Signalwegen beigetragen.20 Im Ischämie/Reperfusions-Modell wird die LAD zunächst okkludiert und anschließend wieder reperfundiert, wodurch eine Wiederherstellung des koronaren Blutflusses in das zuvor ischämische Infarktgebiet erreicht wird.21 Paradoxerweise kann jedoch der Prozess der Reperfusion selbst zu einem Absterben von Kardiomyozyten führen, was man als Ischämie/Reperfusionsschaden bezeichnet und für den es bisher noch keine effektive Therapiestrategie gibt.22
Bei der permanenten Ligatur der LAD können durch die variable Anatomie dieser Arterie in der Maus stark differierende Infarktgrößen mit einer daraus resultierenden unterschiedlichen kardialen Dysfunktion evoziert werden, welche von einer geringen Beeinträchtigung bis zu einer ausgeprägten Herzinsuffizienz reicht.19, 23 Die gezielte Ligatur der LAD unmittelbar unterhalb des linken Herzohres gewährleistet dabei reproduzierbare und ausgeprägte Infarkte (>40% des linksventrikulären Myokards). Das Modell des permanenten Myokardinfarktes ist daher besonders geeignet, um die zellulären/molekularen Mechanismen, die eine Rolle in der Formation der kollagenen Infarktnarbe spielen, zu untersuchen. Außerdem eignet es sich gut,
um die Pathophysiologie der chronischen Herzinsuffizienz sowie des fibrotischen Remodelings zu erforschen.
Im Gegensatz dazu ist das Ischämie/Reperfusions-Modell klinisch relevanter, da es die pathologischen Vorgänge in Patienten, bei denen eine perkutane Koronarintervention (PCI) durchgeführt wird, nachahmt. Damit ist es besonders geeignet, um den beobachteten Reperfusionsschaden sowie die frühe Inflammation nach Ischämie zu untersuchen.19, 23-25 Ein weiteres ischämisches Myokardinfarktmodell ist die Kryokoagulation, bei der die freie Wand des linken Ventrikels durch Kälteapplikation mit einer Kryosonde geschädigt wird.26 Ähnlich wie beim Ischämie/Reperfusions-Modell weisen die durch Kryokoagulation induzierte Myokardinfarkte eine geringere Infarktgröße auf und erzeugen keine ausgeprägte Herzinsuffizienz sowie fibrotisches Remodeling. Das Kryokoagulations-Modell ist besonders für Zelltransplantations-Studien geeignet.19, 23, 24, 27
Infarktheilung
Grundsätzlich beginnt Heilung im Moment der Gewebeschädigung. Dabei heilen akute Wunden, zu denen auch der akute Myokardinfarkt gehört, in einem sehr geordnet ablaufenden Prozess, welcher sich in vier charakteristische, teils überlappende Phasen einteilen lässt:
Hämostase, Inflammation, Proliferation und Remodeling.28
Die durch die Hämostase bedingte Gewebshypoxie hat einen massiven Verlust von Kardiomyozyten im ischämischen Myokard zur Folge.28, 29 Durch die Gewebeschädigung kommt es zu einem Austritt von Blut aus den Gefäßen ins Gewebe, wodurch Thrombozyten in Kontakt mit exponiertem Kollagen und anderen Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) kommen. Die dadurch aktivierten Thrombozyten schütten daraufhin Gerinnungsfaktoren sowie Wachstumsfaktoren wie platlet-derived groth factor (PDGF) oder transforming growth factor beta (TGF-β) aus.28
Daraufhin folgt eine äußerst komplexe und fein abgestimmte Phase der sterilen Inflammation und Infiltration von Immunzellen. Diese phagozytieren beschädigte Zellen sowie EZM und befreien die Infarktzone somit von nekrotischen und apoptotischen Zellbestandteilen.7, 8, 16, 29 Daran anschließend folgt eine proliferative Phase, welche sich durch eine Resolution der Inflammation und einer Proliferation von (Myo)Fibroblasten auszeichnet. Letztere produzieren neue EZM-Bestandteile.7, 28, 30, 31 Aufgrund der gesteigerten metabolischen Aktivität in der
Einleitung
Infarktzone und dem damit einhergehenden erhöhten Bedarf an Sauerstoff und Nährstoffen, kommt es außerdem zur Neovaskularisation.5, 28, 32, 33
In der Remodeling-Phase kommt es unter anderem zu einer Vernetzung und Organisation der Kollagenmatrix.28, 34 Schließlich führen diese Prozesse dabei zur Ausbildung einer kollagenreichen Narbe, da das Herz von ausgewachsenen Säugetieren nur eine sehr beschränkte Fähigkeit zur Regeneration aufweist.16, 35
Ziel einer optimalen Infarktheilung ist die vollständige Regeneration des Organsystems.
Diegelmann et al. definieren Regeneration dabei als den eleganten Prozess, der auftritt, wenn der Organismus in Folge eines Struktur- bzw. Funktionsverlustes die Fähigkeiten zur exakten Wiederherstellung der Strukturen wie vor der Verletzung aufweist.28
Wie bereits erwähnt sind die kardialen Heilungsprozesse nach Myokardinfarkt äußerst komplex und vielschichtig. Denn eine frühe Inflammation stellt die Basis für die spätere Transition in die reparative/proliferative Phase dar. Eine angemessene Aufrechterhaltung mit gleichzeitiger, rechtzeitiger Resolution der Inflammation sind Determinanten einer optimalen Heilung nach MI.7 Beeinträchtigungen innerhalb dieses Prozesses haben fatale Folgen wie eine Ventrikelruptur, Ausbildung eines Ventrikelaneurysmas, Myokardfibrose oder Ventrikeldilatation.35 Eine Dilatation des Ventrikels ist dabei außerdem mit einer erhöhten Inzidenz von ventrikulären Arrhythmien verbunden.13
Abbildung 1: Phasen der Infarktheilung. Entnommen aus/ modifiziert nach Fraccarollo D. et al. Cardiovasc Res.
2012;94(2):293-303
Monozyten/Makrophagen
Monozyten sind Teil des Mononukleär-phagozytären Systems (MPS) und gehen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) hervor. Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) sind in ihrer Entwicklung eng verbunden und stammen von einer identischen Vorläuferzelle ab - dem sog. ‚monocyte-macrophage DC progenitor’ (MDP).36-38 Generell können Maus-Monozyten als CD11b+CD115+-Zellen definiert werden und man findet sie überwiegend im Knochenmark, zirkulierend im Blut sowie in der Milz.36, 39, 40 Anhand von Unterschieden in der Expression von Oberflächenmarkern sowie von funktionellen Eigenschaften können die Maus-Monozyten in zwei wesentliche Subpopulationen unterteilt werden: Ly6Clow und Ly6Chigh.36, 38, 41, 42
Den Ly6Clow-Monozyten wird häufig eine „patrouillierende“ Funktion im Gefäßsystem zugeschrieben. Sie exprimieren charakteristischerweise den Oberflächenmarker Fractalkine- Rezeptor CX3CR1 in hohem Maße (CX3CR1high). Mutmaßlich spielen die Ly6Clow-Monozyten
Infarktexpansion/
Infarktwundheilung
Narbenbildung Reaktive Fibrose Hypertrophie der
Kardiomyozyten Linksventrikuläre
Dilatation Kardiale Dysfunktion
Arrhythmogenität Herzinsuffizienz Infarktextension
Rekrutierung myeloischer Zellen
Phagozytose von nekrotischem Gewebe
Degradation von Extrazellulärer Matrix (EZM)
Bildung von Granulationsgewebe
Neoangiogenese Bildung einer Kollagenmatrix
Progressives kardiales Remodeling
Nekrose Apoptose Arrhythmogenität
sehr früh (Stunden) früh (Stunden bis Tage) spät (Wochen bis Monate)
Einleitung
eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Gefäßsystems, indem sie tote Endothelzellen sowie Pathogene phagozytieren, jedoch ohne dabei das Gefäßsystem zu verlassen.38, 43-46 Ly6Chigh-Monozyten werden dagegen häufig als „inflammatorische Monozyten“ bezeichnet, da sie in das Gewebe einwandern können und dabei hohe Level an pro-inflammatorischen Zytokinen wie Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) sowie Interleukin-1β (IL-1β) produzieren.38, 44 Dabei sind Ly6Chigh-Monozyten typischerweise CX3CR1low und CC- Motiv-Chemokin-Rezeptor 2-positiv (CCR2high).47
Makrophagen wurden im späten 19. Jahrhundert von Ilja Metschnikow entdeckt und stellen evolutionär konservierte Phagozyten dar, welche sich bereits vor 500 Millionen Jahren entwickelten.38, 48, 49 Man findet sie in allen Geweben von Wirbeltieren, wobei sie eine große funktionelle und anatomische Diversität zeigen.50 Als Teil des angeborenen Immunsystem spielen sie eine große Rolle bei der Abwehr von eingedrungenen Pathogenen und sind wesentlich an der Brückenbildung zur adaptiven Immunantwort beteiligt.51, 52 Zusammen mit den Monozyten, den DCs sowie ihren entsprechenden Vorläuferzellen aus dem Knochenmark bilden Makrophagen das sog. MPS des Körpers.42, 52-54 Darüber hinaus spielen sie im Organismus jedoch auch eine wichtige Rolle in der fetalen Entwicklung, bei der Aufrechterhaltung von homöostatischen Prozessen, dem Metabolismus sowie der Wundheilung.55-57
Lange Zeit ist man davon ausgegangen, dass alle Gewebemakrophagen von eingewanderten im Blut zirkulierenden Monozyten abstammen.38, 58, 59 Jedoch zeigte sich in den letzten Jahren, dass viele der residenten Gewebsmakrophagen schon in der Embryonalentwicklung entstanden sind und seitdem im jeweiligen Gewebe unabhängig von Blutmonozyten bestehen.38, 42, 60-63 So entstehen und expandieren in Mäusen die ersten Makrophagen im Dottersack vom 6.5-8.5 Tag der Embryonalentwicklung (E6.5-E8.5). Ein Prozess der auch als primitive Hämatopoese bezeichnet wird.38, 64 Erst anschließend vom E8.5-10.5 tauchen die ersten hämatopoetischen Stammzellen in der AGM-Region (Aorta-Gonaden-Mesonephros) auf, welche anschließend zu allen Immunzelllinien beitragen. Beginnend mit Tag E10.5 migrieren die hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) in die fetale Leber, welches im verbleibenden Verlauf der Embryonalentwicklung das wesentliche hämatopoetische Organ darstellt. Erst in der Perinatalzeit werden die HSC des Knochenmarks zum primären Ort der Hämatopoese.38, 65 Im Erwachsenenalter hat jedoch jedes Gewebe eine individuelle Komposition von aus der Embryonalentwicklung hervorgegangenen sowie von Blutmonozyten der HSCs abstammenden Makrophagen.38, 57
Makrophagenpopulationen im Herz
Makrophagen finden sich auch in großer Anzahl innerhalb des Säugetierherzen.50, 61, 66-68 Zellen der hämatopoetischen Reihe machen im Herz etwa 5-10% aller Nicht-Kardiomyozyten aus, von denen wiederum Makrophagen den Hauptteil darstellen.34, 69
Epelman et al.61 konnten zeigen, dass das Herz aus verschiedenen Populationen von residenten Gewebemakrophagen zusammengesetzt ist, welche eine unterschiedliche ontogenetische Herkunft sowie Funktionen aufweisen.46 Diese Charakterisierung wurde durch aufwendige Messungen in der Durchflusszytometrie (FACS) unter Zuhilfenahme der Zelloberflächenmarker CD11b, F4/80, CX3CR1, MHC-Klasse-II-Komplex (MHC-II), CCR2 und Ly6C möglich.50, 61, 67, 70 Es zeigte sich, dass das Herz auch im Erwachsenenstadiumeine hohe Anzahl von Makrophagen mit embryonalem Ursprung enthält.61 Dabei definierten Epelman et al. anhand der jeweiligen Expression von MHC-II und CCR2 drei verschiedene Makrophagen-Subpopulationen sowie eine Monozyten-Population im Herzen.
Die CCR2-Expression der Makrophagen ermöglicht dabei die Unterscheidung zwischen Makrophagen mit embryonalem Ursprung aus dem Dottersack sowie von Makrophagen, die aus Monozyten abgeleitet sind.
CCR2–-Makrophagen entstammen primär aus dem Dottersack und können durch unterschiedliche MHC-II-Expression in zwei Subpopulationen eingeteilt werden (MHC-IIlow CCR2- und MHC-IIhigh CCR2-). Diese beiden Subpopulationen erneuern sich im Laufe des Lebens vornehmlich durch in situ-Proliferation. Die dritte Subpopulation besteht aus CCR2+- Makrophagen, welche aus zirkulierenden Monozyten des Blutes hervorgegangen ist und damit hämatopoetischen Ursprungs sind (MHC-IIhigh CCR2+). Dazu besteht eine Monozyten- Subpopulation, welche sich als MHC-IIlow CCR2+ charakterisieren lässt.46, 61, 70
Die einzelnen Makrophagen-Subpopulationen zeigen auch große funktionelle Unterschiede. So zeigen kardiale MHC-IIhigh-Makrophagen eine größere Effizienz in der Antigenpräsentation für T-Zellen, wohingegen MHC-IIlow-Makrophagen effektiver in der Phagozytose von Zellbestandteilen und Zelldebris sind. Außerdem exprimieren CCR2+-Makrophagen mehr Gene aus dem NLRP3-Inflammasom, was ihnen eine wichtige Rolle bei der Inflammation nahelegt.56, 61
Mit zunehmenden Alter der Maus werden die residenten Makrophagen mit embryonalem Ursprung sukzessive durch aus Monozyten hervorgegangenen Makrophagen ersetzt.67
Die Ischämie bedingte Hypoxie im Myokard schädigt die Integrität der Endothelzellschicht.
Dies hat eine erhöhte vaskuläre Permeabilität zur Folge, welche eine Infiltration von Leukozyten erleichtert.7, 72, 73 Daraufhin schütten nekrotische bzw. kritisch geschädigte Zellen sowie die EZM Substanzen aus, welche als Alarmsignale fungieren und auch als damage- associated molecular patterns (DAMPs) bezeichnet werden. Diese DAMPs werden von speziellen Rezeptoren, den sog. pattern recognition receptors (PRRs), die von Immunzellen des angeborenen Immunsystems exprimiert werden, erkannt. Dies setzt eine Kaskade von inflammatorischen Signalmolekülen frei, welche pro-inflammatorische Zytokine, Chemokine sowie Zelladhäsionsmoleküle umfassen.7, 74-78
Als Reaktion auf DAMPs, Zytokine, Prostaglandine, Leukotriene, Histamin sowie Bestandteile des Komplementsystems infiltrieren neutrophile Granulozyten als erste Immunzellen in das infarzierte Myokard.7, 79-81 Die im Blut zirkulierenden neutrophilen Granulozyten exprimieren dabei Selektinliganden, welche von aktivierten Endothelzellen erkannt werden und ein Entlangrollen der Neutrophilen an der Endothelzellschicht zur Folge haben. Die „rollenden“
Neutrophilen wechselwirken anschließend über Chemokine mit Glykosaminoglykanen an der luminalen Endothelzelloberfläche, was schließlich eine vermehrte Expression von Integrinen zur Folge hat. Interaktionen zwischen CXC-Chemokinen und dem von Neutrophilen exprimierten CXCR2-Rezeptor induzieren eine Konformationsänderung der Integrine. Diese Prozesse münden in einen Arrest sowie einer festen Adhäsion der neutrophilen Granulozyten an das Endothel.7, 82, 83 Wesentliche beteiligte Moleküle in diesem Prozess sind E-Selektin, P- Selektin, ICAM-1 sowie IL-8.30, 84 Nach anschließender Transmigration durch das Endothel phagozytieren sie tote Zellbestandteile, sorgen durch Ausschütten von Matrix- Metalloproteasen (MMPs) enthaltenden Granula für eine Degradation der EZM und produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS).7, 85-87 Außerdem sezernieren die neutrophilen Granulozyten Faktoren, welche chemotaktisch auf Monozyten wirken und dadurch zum Prozess der Monozyten-Infiltration beitragen.86, 88, 89 Es zeigte sich, dass neutrophile Granulozyten innerhalb der ersten Stunden nach Einsetzen der Ischämie auftauchen und der Höhepunkt ihrer Akkumulation in der Maus etwa einen Tag nach MI besteht.31, 90, 91
Nach dem frühen Auftauchen der neutrophilen Granulozyten sind in der Folge die Monozyten und Makrophagen die dominierenden Zelltypen im Infarktgebiet.30, 31, 92 Aus zahlreichen Studien ist bekannt, dass Monozyten/Makrophagen eine Schlüsselrolle als Regulatoren/Effektoren der myokardialen Wundheilung sowie des sich anschließenden ventrikulären Remodelings zukommt.5, 44, 50, 93, 94
Einleitung
In vivo-Bildgebungen konnten zeigen, dass bereits innerhalb von 30min nach Induktion eines durch permanente Ligatur der LAD herbeigeführten, experimentellen Myokardinfarktes, Monozyten in das Infarktgebiet rekrutiert wurden.50, 84, 95
Grundlegende Arbeiten von Nahrendorf et al. zeigten, dass es nach Myokardinfarkt zu einer bi- phasischen Antwort von Ly6Chigh- und Ly6Clow-Monozyten/Makrophagen im Herz kommt, welche dabei eine funktionelle Heterogenität aufweisen und den sequentiellen Prozess der Wundheilung leiten.31, 96
Die Infiltration von pro-inflammatorischen Ly6Chigh-Monozyten stellt die dominierende Subpopulation in den ersten 3-4 Tagen nach Myokardinfarkt dar.31, 46, 61, 97 Die eingewanderten Ly6Chigh-Monozyten stammen dabei einerseits aus dem Blut und andererseits aus einem Reservoir in der Milz.40, 44, 98 Sie phagozytieren dabei toxische Moleküle, abgestorbene Zellbestandteile, weisen eine proteolytische Aktivität auf und produzieren inflammatorische Zytokine wie IL-1α, IL-6 oder TNF-α.96, 99-101 Jedoch sind diese inflammatorischen Prozesse potentiell schädlich für das Myokard.102
Im Gegensatz dazu scheinen Ly6Clow-Monozyten nicht direkt in das Infarktgebiet einzuwandern.103 Initiale Studien gingen zwar davon aus, dass die Ly6Chigh/Ly6Clow- Monozyten in zwei separaten Wellen aus dem Blut zirkulierend ins Herz einwandern.31, 96 Jedoch konnte kürzlich gezeigt werden, dass sich die in der Inflammationsphase akkumulierten Ly6Chigh-Monozyten/Makrophagen in Ly6Clow-Makrophagen differenzieren.
Die Ly6Clow-Makrophagen spielen in der sich anschließenden reparativen Phase eine wichtige Rolle bei der Begrenzung der Inflammation, der Neovaskularisation sowie der Ausbildung einer kollagenen Narbe.50, 93, 96, 103 Hilgendorf et al. konnten dabei verdeutlichen, dass dem Transkriptionsfaktor Nr4a1 in den Ly6Clow-Makrophagen eine entscheidende Bedeutung für die Resolution der Entzündung zukommt, indem er die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen abschwächt.103
Nachdem die Infarktzone von abgestorbenen Zellen und EZM-Bestandteilen befreit wurde, kommt es zu einer Suppression der Inflammation. Neutrophile Granulozyten werden apoptotisch und anschließend von Makrophagen phagozytiert.35, 96 Das Erkennen von Phosphatidylserin-Motiven auf apoptotischen, neutrophilen Granulozyten sowie deren Phagozytose resultiert in einer geänderten Genexpression der Makrophagen. Pro- inflammatorische Zytokine wie TNF und IL-1 werden herunterreguliert, wohingegen anti- inflammatorische Zytokine wie IL-10 und TGF-β hochreguliert werden.46, 104-106
Die Formation und Reifung von neuen Blutgefäßen im Rahmen der Neoangiogenese markiert einen weiteren wesentlichen Schritt innerhalb der Wundheilung.
Abbildung 3: Phasen der Infarktheilung II. Vereinfachte Darstellung der zellulärer Infliltration der Immunzellen sowie der domierenden Zytokine entnommen aus/ modifiziert nach Westmann, P.C. et al. J Am Coll Cardiol.
2016;67(17):2050-60. (cc by Elsevier Lizenznummer: 4577810013267)
(Myo)Fibroblasten: Regulatoren/Effektoren der Infarktheilung
Fibroblasten stellen den vorherrschenden interstitiellen Zelltyp im adulten Myokard des Säugetierherzens dar.35, 107, 108 Schätzungsweise machen sie unter Homöostase etwa 15% aller Zellen des adulten Myokards aus.69, 109 Morphologisch zeichnen sich Fibroblasten als flache Zellen mit spindelförmigem Nukleus und mehreren vom Zellkörper ausgehenden Fortsätzen aus. Kardiale Fibroblasten stellen eine sehr heterogene Zellpopulation dar, welche eine wichtige Rolle bei der strukturellen und mechanischen Aufrechterhaltung des Bindegewebes im Herzen
Einleitung
spielen. Als Hauptproduzenten von EZM-Proteinen koordinieren sie die Aufrechterhaltung der Integrität des Kollagennetzwerks innerhalb des Herzens und erhalten somit die kardiale Geometrie.107-110
Darüber hinaus bilden Fibroblasten ein Gerüst für Kardiomyozyten und sind außerordentlich wichtig zur Gewährleistung einer geregelten Reizweiterleitung im Myokard und damit zur Sicherstellung eines korrekten Herzrhythmus.109, 111, 112 Dabei interagieren Fibroblasten über zahlreiche biochemische und biophysikalische Signalwege mit Immunzellen, Kardiomyozyten, Gefäßmuskelzellen sowie Endothelzellen und modulieren somit in vielfältiger Weise die Gen- und Proteinexpression, zelluläre Prozesse und letztendlich die Herzfunktion.113, 114
Ihre interstitielle Lage prädestiniert sie als „Wächterzellen“, welche in der Lage sind Gewebsverletzungen zu detektieren und daraufhin Zytokine und Chemokine zu sezernieren.
Dies macht sie zu wichtigen Regulatoren der inflammatorischen und reparativen Antwort in Folge einer Myokardschädigung, wodurch sie auch eine große Rolle in der Pathogenese des kardialen Remodelings spielen.13, 35, 115
In Folge einer ischämischen Myokardschädigung sind Fibroblasten in der Lage den Verlust der strukturellen Integrität der EZM sowie weitere biochemische Signale zu detektieren. Dabei differenzieren sie zu Myofibroblasten, welche große Mengen an EZM-Molekülen sekretieren.116-118 Die Expansion von kardialen Fibroblasten sowie deren Differenzierung in Myofibroblasten ist das Kennzeichen der proliferativen Phase der Heilung nach Myokardinfarkt.117, 119, 120
Neben ihrer Fähigkeit neue EZM zu produzieren, sind kardiale Fibroblasten auch in der Lage EZM abzubauen. Dazu sekretieren sie Matrix-Metalloproteasen (MMPs), welche eine Gruppe von proteolytischen Enzymen darstellen, die Kollagenfasern zersetzen können.107, 116, 121, 122 Im normalen Herz ist die MMP-Expression sowie deren Funktion streng reguliert. Hierbei spielen auch tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) eine große Rolle, indem sie die MMPs im Gewebe hemmen.116, 123 Unter pathologischen Bedingungen ist die MMP-Expression und Aktivität erhöht, was zur exzessiven Degradation von EZM führt und damit letztendlich erhebliche Einflüsse auf die Herzfunktion hat.107 Denn überaktive MMPs können zur Infarktausdünnung, Bildung von Herzaneurysmata, Ventrikeldilatation oder Remodeling von unbeeinträchtigtem Myokardgebieten beitragen.12
Die Transformation zu Myofibroblasten erfolgt in zwei Schritten.124, 125 Im ersten Schritt entstehen Proto-Myofibroblasten aus den Fibroblasten, welche sich durch die Formation von zytoplasmatischem Aktin sowie der Expression von kleinen Adhäsionsmolelül-Komplexen
auszeichnen und die Einwanderung ins Wundgebiet ermöglichen.124-126 In einem zweiten Schritt reifen die Proto-Myofibroblasten durch hohe Zytokinspiegel und den mechanischen Stress in der Infarktzone zu Myofibroblasten heran.
Letztere sind spezialisierte Zellen mit kontraktilen Eigenschaften, wozu sie charakteristischerweise eine erhöhte Expression von kontraktilen Proteinen wie alpha smooth muscle actin (α-SMA) aufweisen.117, 124, 127, 128 Außerdem zeigen sie eine erhöhte Proliferationsrate und eine große synthetische Aktivität.117, 129, 130 Auch phänotypisch unterscheiden sich Myofibroblasten von Fibroblasten unter Homöostase, da sie deutlich größere Zellen mit gekräuselter Zellmembran sind und eine hohe Dichte an Stressfasern aufweisen.131, 132
Die Aktivierung und Akkumulation von Myofibroblasten wird von komplexen Interaktionen durch mechanische, neurohumerale sowie inflammatorische Signale kontrolliert.104, 125, 133, 134
Ein zentrales Zytokin in dem geschilderten Prozess der Konversion von Proto-Myofibroblasten zu Myofibroblasten ist TGF-β. Die Bindung von TGF-β führt zu einer Homodimerisierung des TGF-β-Rezeptors 1 und 2 an der Zellmembran der Fibroblasten. Dies hat eine direkte Phosphorylierung der zytoplasmatischen Transkriptionsfaktoren SMAD2 und SMAD3 zur Folge, welche daraufhin in den Nukleus translozieren und dort nach Komplexbildung mit SMAD4 die spezifische Genexpression der Fibroblasten-Differenzierung aktivieren.109, 135 Der TGF-β Superfamilie kommen pleiotrope Wirkungen in den Prozessen nach einem Myokardinfarkt zu. Als multifunktionale Wachstumsfaktoren hat die TGF-β-Superfamilie unter anderem Einfluss auf die Proliferation, Migration, Differenzierung und Apoptose von Zellen.30, 35 Auf Fibroblasten wirkt sich TGF-β antiproliferativ aus und fördert die Transition von der Inflammations- zur Proliferationsphase, indem es die Deposition von Kollagen sowie die Neoangiogenese fördert.35, 136, 137
Die Bildung von neuen Blutgefäßen ist von zahlreichen Umgebungssignalen abhängig, welche die Endothelzellfunktion beeinflussen.138, 139 Während der Wundheilung kommt es zu einem Zusammenspiel von zahlreichen die Neovaskularisation beeinflussenden Faktoren, welche die Formation und Reifung von Endothelzellen zu neuen Blutgefäßen leiten. Dabei zeigte sich, dass es enge Assoziation zwischen Fibroblasten und Endothelzellen besteht, welche wichtig für die Formation von neuen Blutgefäßen nach Gewebeschädigung ist.107
Einleitung
Glukokortikoide
Glukokortikoide stellen eine Klasse von Steroidhormonen dar, welche aus der Zona fasciculata sowie der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde sekretiert werden. Dabei spielen sie eine entscheidende Rolle in der Regulation von verschiedensten Zellfunktionen, welche unter anderem wichtig bei der Entwicklung sowie Homöostase zahlreicher Organsysteme, dem Stoffwechsel sowie der Inflammation sind.140-142 Die Produktion und Ausschüttung von Glukokortikoiden aus der Nebennierenrinde erfolgt dabei in einem zirkadianen Rhythmus sowie in Reaktion auf Stress. Die Regulation erfolgt über die Hypothalamus-Hypophysen- Nebennierenrinden-Achse (engl. HPA-axis). In Folge von neuronalen oder endokrinen Signalen sowie durch Zytokine kommt es zur Sekretion von corticotropin-releasing-Hormonen (CRH) aus dem Hypothalamus. Dies wiederum stimuliert die Ausschüttung des adrenocortikotropen Hormons (ACTH) aus dem Hypophysenvorderlappen. ACTH induziert dabei die Synthese von Glukokortikoiden in der Nebennierenrinde. Die anschließende Ausschüttung des Kortisols in die Zirkulation initiiert die systemischen Effekte der Glukokortikoide. In Form eines negativen Feedbacks wirken erhöhte Kortisolspiegel in der Blutzirkulation hemmend auf die Ausschüttung von CRH und ACTH im Hypothalamus sowie der Hypophyse (siehe Abb. 4).140, 143
Aufgrund ihrer potenten immunregulativen Effekte finden synthetische Glukokortikoide eine breite klinische Anwendung in der Behandlung von inflammatorischen Krankheitsbildern, Autoimmunerkrankungen sowie bestimmten hämatologischen Krebsarten.144 Unglücklicherweise ist jedoch insbesondere eine höher dosierte und längerfristige Glukokortikoid-Therapie mit zahlreichen und schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden.
Diese umfassen unter anderem Osteoporose, diabetische Stoffwechsellage, stammbetonte Adipositas, Atrophie der Haut, Glaukome, erhöhte Anfälligkeit für Infektionen sowie Wachstumshemmung bei Kindern.140, 145
Die systemischen Glukokortikoid-Spiegel werden durch die Synthese in der Nebenniere aufrechterhalten, allerdings ist die Verfügbarkeit von Glukokortikoiden zusätzlich auf Gewebe- sowie zellulärer Ebene reguliert. Im Menschen ist ein Großteil der zirkulierenden Glukokortikoide an Transkortin (engl. Corticosteroid-binding globulin, CBG) sowie ein weiterer, kleinerer Anteil an Albumin gebunden und ist dadurch inaktiviert. Nur etwa 5% der Glukokortikoide zirkulieren biologisch aktiv und ungebunden im Blut.142, 146
Auf zellulärer Ebene wird die Verfügbarkeit von Glukokortikoiden durch das
Einleitung
Die zell- und gewebespezifischen Wirkungen der Glukokortikoide werden durch den Glukokortikoidrezeptor (GR) vermittelt, welcher zu zahlreichen Änderungen in der Genexpression führt. Im Nukleus werden grundsätzlich drei Mechanismen unterschieden, durch die der GR auf die Genregulation einwirkt.
Im ersten Mechanismus fungiert der GR als Transkriptionsfaktor, indem er an spezifische Sequenzen der DNA – die sog. Glucocorticoid response elements (+GRE) bzw. negative glucocorticoid response elements (nGRE) – bindet und dadurch die Gentranskription aktiviert bzw. inhibiert.147-150
Der zweite Mechanismus beschreibt die Interaktion des GR mit anderen Transkriptionsfaktoren im Sinne einer Protein-Protein-Interaktion, welches wiederum Einfluss auf die Genexpression in der Zelle hat. Dieser Prozess wird als auch ‚tethering‘ bezeichnet.147, 151
Im dritten Mechanismus beeinflusst der GR die Genexpression durch eine Kombination aus direkter DNA-Bindung an GREs sowie einer gleichzeitigen Interaktion mit einem anderen Transkriptionsfaktor.147, 152
Studien zur Glukokortikoid-Administration nach Myokardinfarkt zeigen widersprüchliche Ergebnisse. In einigen Studien waren Glukokortikoiden mit einer beeinträchtigten Infarktheilung assoziiert, wohingegen andere Studien protektive Effekt durch Glukokortikoide nach Myokardischämie feststellen konnten.12, 153-158
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der GR in Makrophagen die Wundheilung nach Myokardinfarkt fördert. Mäuse, in denen der GR in den myeloischen Zellen deletiert war, zeigten eine beeinträchtigte Herzfunktion sowie ein nachteiliges kardiales Remodeling. Die Deletion des GR veränderte die Differenzierung von Monozyten abgeleiteten Makrophagen im Infarktgebiet während der frühen Phase der Wundheilung, was wiederum eine Deregulation von die Inflammation, die Neoangiogenese, die Kollagendegradation, sowie die Narbenbildung kontrollierenden Faktoren zur Folge hatte.
Material
Tabelle 1: Geräte und Utensilien
Material Herkunft
ADInstruments PowerLab®, Chart 5 Data Acquisition Systems
Millar Instruments, Inc.
Houston, Texas USA ARIA™ Pressure-Conductance Unit
Model MPCU-200
Millar Instruments, Inc.
Houston, Texas USA
BD FACSAria™ Fusion cell sorter BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies GmbH & Co. KG Böblingen, Deutschland
Bright-field microscope Eclipse 50i Nikon GmbH Düsseldorf, Deutschland
Centrifuge 5810 R Eppendorf AG Hamburg, Deutschland
CFX96 Real-Time PCR System Detection System Bio-Rad, Hercules, CA, USA ChemiDoc Touch Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA, USA Conductance Katheter SPR-839 Millar Instruments, Inc.
Houston, Texas, USA
Cryotom CM1850 Leica Biosystems GmbH
Nussloch, Deutschland
Cytospin™ 4 Cytocentrifuge Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA
Digital camera DS-5Mc Nikon GmbH Düsseldorf, Deutschland
Eclipse TE2000 Inverted Microscopes Nikon GmbH Düsseldorf, Deutschland Fluorescence microscope Upright Eclipse Ni-E Nikon GmbH Düsseldorf, Deutschland Gallios™ 3C Flow Cytometer Beckmann Coulter, Brea, CA, USA
Gallios™ software Beckmann Coulter, Brea, CA, USA
Image Analysis Software- SigmaScan® Pro 5.0 Systat Software, Inc. San Jose, California USA Langendorff heart perfusion system FMI Föhr Medical Instruments GmbH
Seeheim-Jugenheim, Deutschland
Microtom RM 2235 Leica Biosystems Nussloch GmbH
Nussloch, Deutschland
Material
MINIVENT mouse ventilator model 845 Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
NanoDrop 2000c Microvolume Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA NIS-Elements Viewer Microscope Imaging Software Nikon GmbH Düsseldorf, Deutschland
Platform shaker Polymax 104C Heidolph Instruments GmbH & CO KG Schwabach, Deutschland
PVAN Pressure Volume Analysis Software Millar Instruments, Inc. Houston, Texas USA
T100™ Thermal Cycler Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Univentor 1200 Anaesthesia Unit Univentor Zejtun, Malta Univentor 2010 Scavenger Unit Univentor Zejtun, Malta
Vortex-Genie® 2 Scientific Industries, Inc. Bohemia, New York, USA
XT- 2000i Sysmex, Kobe, Japan
Tabelle 2: Chirurgische Instrumente/Material
Material Cat. No. Herkunft
Arterienklemme nach Baby-Mosquito BH105R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland
Gefäßschere BC030R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland Klammeranlegepinzette nach Michel BN730R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland
Mikro-Pinzette BD329R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland
Nachstarschere nach Vannas OC498R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland
Nadelhalter Durogrip BM054R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland Permaseide-Faden schwarz geflochten 5-0 FS-2
Nadel
682H Ethicon Endo-Surgery GmbH
Norderstedt, Deutschland Permaseide-Faden schwarz geflochten 6-0, FS-3
Nadel
681H Ethicon Endo-Surgery GmbH
Norderstedt, Deutschland
Splitterpinzette BD312R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland
Wundspreizer nach Alm BV010R Aesculap AG
Tuttlingen, Deutschland
Tabelle 3: Chemikalien
Tabelle 4: Puffer
PBS Puffer: Lösung aus 1 Päckchen in 1 Liter destilliertem Wasser:
0,01 M PBS NaCl 0,138 M KCl 0,0027 M pH 7,4 bei 25°C
Perfusionspuffer: 113mM NaCl, 4.7mM KCl, 0.6mM
KH2PO4, 0.6mM Na2HPO4, 1.2mM MgSO4, 12mM NaHCO3, 10mM KHCO3, 10mM HEPES, 30mM taurine, 5.5mM glucose, 10mM 2,3-Butanedione monoxime, pH=7.46
Digestionspuffer: 0.2mg/ml Liberase™ DL Research Grade + 400µM calcium chloride
+ Perfusion Buffer
Stoppuffer: 10 % Gibco® HI FBS in Perfusion Buffer
FACS-III-Puffer: PBS
+ 0,5 % FBS + 2mM EDTA pH=7,2
Lysis Buffer 1 mL RBC Lysis Buffer + 8 mL Aqua injectabilia)
Material Cat. No. Herkunft
PBS-Pulver P5368 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Gibco® HI FBS
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum, Certified
10082-139 Life Technologies GmbH Darmstadt, Deutschland
Liberase™ DL Research Grade 000000005401160001 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Direct Red 80 (Sirius Red F3B)
Sirius red F3B
365548 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Picric Acid 197378 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Hank’s Balanced Salt Solution H6648 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
RBC Lysis buffer 420301 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
Material
Tabelle 5: Reagenzien und Kits Immunhistochemie/Immunfluoreszenz
Tabelle 6: Antikörper Immunhistochemie
Antikörper Clone Cat. No. Hersteller
anti-CD31 ER-MP12 MCA2388 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
anti-α-SMA _sm-1 VP-S281 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA Biotinylated Goat Anti-Rat
IgG Antibody
BA-9401 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA
Reagenzien/Kits Cat. No. Herkunft
Avidin/Biotin Blocking-Kit SP 2001 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA
BD Cytofix® 554655 BD Biosciences, San Jose, CA, USA
DAB Substrate Kit 550880 BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Hematoxylin QS H-3404 Vector Laboratories, Inc. Burlingame,
California USA HISTOPRIME®
HistoGreen Substratkit für Peroxidase
E109 Linaris GmbH, Drossenheim, Deutschland M.O.M ™ Immunodetection Kit FMK-2201 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA
NucBlue Live Cell Stain Ready Probes R37605 Molecular Probes, Eugene, OR, USA
Slowfade Diamond Antifade Mountant S36963 Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA
Tissue-Tek®
O.C.T.™ Compound
4583 Sakura Finetek Europe B.V.
Alphen aan den Rijn, Niederlande Vecta Mount™
Permanent Mounting Medium
H-5000 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA Vectastain® ABC KIT PK-6200 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA
Tabelle 7: Antikörper Immunfluoreszenz
Antikörper Clone Cat. No. Hersteller
anti-Neutrophil NIMP-R14 sc-59338 Santa Cruz Biotechnology, Inc., TX, USA
anti-Histone H2A ab18255 abcam, Eugene, USA
anti-CD68 FA-11 MCA1957 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
anti-CD 68-Biotin FA-11 MCA1957BT Bio-Rad, Hercules, CA, USA Vimentin XP Rabbit mAb
(Alexa Fluor 594 Conjugate)
D21H3 7675 Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA
FITC-labeled anti- α-SMA 1A4 F3777 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Alexa Fluor 594
anti-mouse CD68 Antibody
FA-11 137020 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA Alexa Fluor 488
anti-mouse Ly-6C Antibody
HK1.4 128022 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
anti-TGF-β TB21 MCA797 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
anti-MMP-13 LIPCO IID1 MA5-14247 Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, MA, USA Alexa Fluor® 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rat IgG (H+L)
712-545-153 Jackson ImmunoResearch West Grove, PA, USA
Cy™3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)
711-165-152 Jackson ImmunoResearch West Grove, PA, USA
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG Antibody, mouse adsorbed
B9401 Vector Laboratories, Inc.
Burlingame, California USA Cy™3 AffiniPure Donkey
Anti-Rat IgG (H+L)
712-165-153 Jackson ImmunoResearch West Grove, PA, USA
Streptavidin, Dylight 488 Conjugated
21832 Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA Wheat germ agglutinin (WGA) W7024 Life Technologies, Thermo Fisher
Scientific Inc. Waltham, MA, USA
Tabelle 8: Reagenzien und Kits der Durchflusszytometrie
Tabelle 9: Antikörper Durchflusszytometrie
Antikörper Fluorochrom Clone Hersteller
anti-CD31 Alexa Fluor® 488 390 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
anti-TER-119 FITC TER-119 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
anti-CD45 PerCP/Cy5.5 104 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
anti-CD11b eVolve 605 M1/70 eBioscience, Thermo Fisher
Scientific Inc. Waltham, MA, USA
anti-NG2 PE 1E6.4 Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA,
USA
anti-PDGFRβ PE APB5 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
anti-MEFSK4 APC mEF-SK4 Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA,
USA
anti-F4/80 APC BM8 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
anti-Ly6C FITC AL-21 BD Biosciences, San Jose, CA, USA
anti MHC-II BV421 AF6-120.1 BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Anti Ly6G BV785TM 1A8 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
Reagenzien/Kits Cat. No. Herkunft
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)
553141 BD Biosciences, San Jose, CA, USA
RBC Lysis Buffer (10X) 420301 BioLegend Inc. San Diego, CA, USA
Flow-Check™ Pro Fluorospheres A63493 Beckmann Coulter, Brea, CA, USA Flow-Set™ Pro Fluorospheres A63492 Beckmann Coulter, Brea, CA, USA IsoFlow™ Sheath Fluid 8546859 Beckmann Coulter, Brea, CA, USA
Methoden
Versuchstiere
Die vorliegende Studie wurde mit adulten Mäusen beider Geschlechter des Stammes C57BL/6J, welche von Herrn Prof. Dr. Tuckermann (Leibniz-Institut für Altersforschung – Fritz-Lipmann-Institut, Jena), gezüchtet wurden, durchgeführt.
Alle Versuche wurden gemäß der EU-Direktive 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere sowie nach dem Deutschen Tierschutzgesetz (TierSchG) durchgeführt. Sie erfolgten mit vorheriger Genehmigung nach §8, 8a TierSchG /
§31 Tierschutz-Versuchstierverordnung (TierSchVersV) durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) in Oldenburg, Deutschland (Aktenzeichen: 33.12-42502-04-11/0644).
Die Versuche erfolgten im zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover. Die Haltung der Versuchstiere erfolgte gemäß ETS123. Die Versuchstiere waren über den gesamten Zeitraum der Studie in einem klimatisierten Tierlabor in einem standardisierten Käfig (Typ 22 IVC, A= 440 cm2) mit einer maximalen Besatzdichte von 5 adulten Tieren untergebracht. Die Tiere wurden während der gesamten Versuchsdauer unter sog. Specific-Pathogen-Free (SPF)- Bedingungen gehalten. Es bestand ein freier Zugang zu Wasser und Futter. Zur Einhaltung konstanter Umweltbedingungen waren die Versuchstiere durch künstliche Beleuchtung einem zwölfstündigen Tag-Nacht-Zyklus (12 Stunden hell, 12 Stunden dunkel) unterworfen.
Für die Studie wurden Nr3c1tm2Gsc (GRflox, Wildtyp-Kontrollen) sowie Nr3c1tm2Gsc Lyz2tm1(cre)lfo/J (GRLysMCre) Mäuse, bei denen eine spezifische Deletion des GR-Rezeptors in den myeloischen Zellen vorliegt, verwendet. Mäuse mit homozygoten GR werden als flox/flox bezeichnet. Mäuse bei denen eine heterozygote Insertion von Cre im Lyz2-Lokus besteht werden als tg/+ gekreuzt mit +/+ bezeichnet. Das bedeutet, dass alle Wildtyp-Kontrollen in den Experimenten GR flox/flox; +/+ sind und alle transgenen Mäuse GR flox/flox; tg/+ sind.
Die experimentelle Myokardischämie wurde durch eine Ligatur der linken Koronararterie herbeigeführt. Alle belastenden und schmerzhaften Eingriffe wurden unter Isoflurannarkose durchgeführt. Die postoperative Analgesie erfolgte mit Buprenorphin (Temgesic®). Wenn Tiere postoperativ verstarben, so passierte dies fast ausschließlich kurz nach der Infarktsetzung d.h.
noch in Narkose oder unter Analgesie. Die ersten postoperativen Stunden wurden unter ständiger Kontrolle des OP-Personals verbracht. Die Tötung der Versuchstiere erfolgte am
Methoden
Ausschlusskriterien für die Studie waren der perioperative Tod innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Operation sowie eine Infarktgröße von <40% des Myokards. Alle Versuchstiere, die in die Kaplan-Meier-Überlebenskurve eingeschlossen wurden, sind spontan durch Ruptur des Myokards oder durch akute, dekompensierte Herzinsuffizienz verstorben.
Myokardinfarzierung
Der experimentell-operative Myokardinfarkt wurde durch eine permanente Ligatur des proximalen Astes der LAD der Arteria coronaria sinistra induziert. Zu Versuchsbeginn erfolgte zunächst eine Erhebung des Körpergewichtes (KG) des Versuchstieres. Anschließend erfolgte die Inhalationsnarkose der Mäuse mit Isofluran 5% in einem 100%-igem O2-Gemisch. Die Anästhesie der Mäuse erfolgte dabei in einer Narkoseinduktionsbox, welche mit einem geschlossenen Narkosesystem, bestehend aus einer 1200 Anaesthesia Unit und einer 2010 Scavenger Unit, verbunden war. Anschließend wurden die Tiere endotrachial intubiert und in Rückenlage mithilfe eines MINIVENT mouse ventilator volumenkontrolliert beatmet. Das Atemzugvolumen wurde dabei nach Körpergewicht des Versuchstieres adjustiert (10µL/g KG).
Die Beatmungsfrequenz wurde auf 120/min festgelegt.
Die prä- und postoperative Analgesie erfolgte mit Buprenorphin (intraperitoneal 0.1mg/kg KG in 100µl Lösung) vor Thorakotomie. Im weiteren Verlauf nach der Operation wurde die Analgesie durch Novalgin®-Applikation (40mg/kg KG) im Trinkwasser sichergestellt.
