Die Rolle von 4-1BB bei der pro-inflammatorischen Antwort von Makrophagen

Institut für Mikrobiologie Zentrum für Infektionsmedizin

Die Rolle von 4-1BB bei der pro-inflammatorischen Antwort von Makrophagen

INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades

einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von Franziska Müller

Walsrode

Hannover 2010

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. R. Goethe

2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. G. Herrler

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2010

Meiner Familie

1  EINLEITUNG ... 7 

1.1  Der Makrophage in der Immunabwehr ... 7 

1.2  Charakteristika der Familie Mycobacteriaceae ... 9 

1.3  Signalvermittlung über TLR ... 14 

1.4  Das 4-1BB/4-1BBL-System ... 19 

1.5  Zielsetzung dieser Arbeit... 24 

2  MATERIAL UND METHODEN ... 25 

2.1  Material ... 25 

2.2  Methoden... 31 

3  ERGEBNISSE ... 49 

3.1  Die Expression von entzündungsrelevanten Genen in Makrophagen nach MAP-Infektion und LPS-Stimulation ... 49 

3.2  Transkriptionelle Regulation des 4-1BB Gens ... 55 

3.3  Funktion von 4-1BB... 63 

3.4  Die Regulation von IL-6 im Klon R#1.9.10... 71 

3.5  Signalvermittlung über 4-1BB ... 76 

3.6  Signalwege im Klon R#1.9.10 ... 80 

4  DISKUSSION... 84 

4.1  Die MAP-Infektion von Makrophagen führt zu einer späten Induktion der 4-1BB Expression ... 84 

4.2  Die 4-1BB Expression in MAP-infizierten und LPS-stimulierten Makrophagen wird über die NF-κB-Bindungsstelle vermittelt... 87 

4.3  RAW264.7 Makrophagen exprimieren zwei 4-1BB Transkripte ... 90 

4.4  Phänotypische Charakterisierung 4-1BB-defizienter Makrophagen... 92 

4.5  Die mögliche Rolle von 4-1BB in aktivierten Makrophagen... 99 

5  ZUSAMMENFASSUNG... 101 

6  SUMMARY ... 102 

7  LITERATURVERZEICHNIS... 103 

8  ANHANG ... 110 

8.1  Vektorkarten... 110 

8.2  Microarray-Daten ... 113 

8.3  Geräte und Verbrauchsmaterialien... 121 

8.4  Verwendete Abkürzungen ... 130 

1 Einleitung

1.1 Der Makrophage in der Immunabwehr

Makrophagen bilden die erste Verteidigungslinie gegenüber eingedrungenen Pathogenen, denn aufgrund ihrer exponierten Lage in Geweben kommen sie sehr früh mit den pathogenen Mikroorganismen in Kontakt. Neben der Phagozytose und Eliminierung der Erreger ist eine weitere wichtige Funktion dieser professionellen Phagozyten die Prozessierung von Antigenen, um sie über MHC (major histocompatibility complex)-Klasse I- oder MHC-Klasse II-Moleküle T-Zellen zu präsentieren und dadurch die spätere, adaptierte Immunantwort einzuleiten. Der Makrophage ist somit das Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptierten Immunantwort.

Das Erkennen und die Aufnahme erfolgt über die sogenannten pattern recognition receptors (PRR) wie beispielsweise Toll-like-Rezeptoren (TLR), Komplement-, Mannose-, Fc- und scavenger-Rezeptoren. Sie erkennen konservierte Strukturen auf Pathogenen, die als pathogen-associated molecular patterns (PAMP) bezeichnet werden, wie z. B. Oligosaccharide, Lipoproteine, Peptidoglykan und mykobakterielles LAM (Lipoarabinomannan) (BASSET et al. 2003). Die wohl wichtigste Familie der PRR sind die signalgebenden TLR, die sowohl die Phagozytose einleiten als auch zu einer veränderten Genexpression, der sogenannten Aktivierung des Makrophagen, führen. Die bisher 13 bekannten TLR sind in der Lage, unterschiedlichste PAMP zu erkennen, die sowohl von Bakterien, Viren, Pilzen als auch Protozoen stammen können (MOGENSEN 2009). Nach der Phagozytose befinden sich die Mikroorganismen in einem Phagosom, das unter kontrollierten molekularen Veränderungen, wie z. B. der Ansäuerung und der schrittweisen Fusion mit Lysosomen zum Phagolysosom, heranreift. Dabei werden im Lysosom enthaltene hydrolytische Enzyme, die bei niedrigem pH-Wert aktiviert werden, freigesetzt und dadurch die Krankheitserreger abgetötet. Die auf diesem Weg prozessierten Peptidantigene werden schließlich an der Zelloberfläche über MHC-Klasse II-Moleküle präsentiert. Nach der Phagozytose erzeugt der Makrophage weitere

toxische Produkte, die beim Abtöten der Bakterien mitwirken, wie z. B.

Sauerstoffperoxid, Superoxidanion und Stickstoffoxid. Der Vorgang, bei dem diese Substanzen produziert werden, ist als respiratory burst bekannt. Der aktivierte Makrophage bildet vor allem pro-inflammatorische Cytokine (Tabelle 1), aber auch die Expression ko-stimulierender Moleküle wie z. B. B7.1, B7.2 und 4-1BB-Ligand (4-1BBL, siehe 1.4) wird induziert. Weitere Effektormoleküle und -zellen werden an den Infektionsherd gelockt um die Immunantwort zu verstärken (Tabelle 1).

Schließlich wird durch die freigesetzten Cytokine eine lokale Entzündungsreaktion ausgelöst.

Tabelle 1: Wichtige vom Makrophagen gebildete Cytokine als Antwort auf bakterielle Antigene.

Cytokin Zielzellen Effekt

Lymphozyten Verstärkt Immunantwort IL-1β

Leber Induziert Akut-Phase-Protein Sekretion Lymphozyten Verstärkt Immunantwort

IL-6

Leber Induziert Akut-Phase-Protein Sekretion

Naive T-Zellen Lenkt Immunantwort Richtung T_H1, pro-inflammatorisch, Cytokinsekretion

IL-12

NK-Zellen Aktivierung Cxcl-8

Neutrophile, Basophile, T-Zellen

Chemokin, rekrutiert Zielzellen an den Entzündungsherd

TNF-α Gefäßendothel Expression von Zelladhäsions-Molekülen und Veränderung von Zell/Zell-Verbindungen

Die meisten Krankheitserreger können durch die oben beschriebenen pro-inflammatorischen Antworten der Makrophagen zerstört werden. Im Gegensatz dazu können intrazelluläre Krankheitserreger den Abwehrmechanismen der Makrophagen entgehen, indem sie im Phagosom persistieren, wo sie sicher sind vor Antikörpern und die Erkennung durch cytotoxische T-Zellen vermeiden. Für die

Krankheitserreger manipulieren das Zusammenspiel der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Zu diesen wichtigen intrazellulären Krankheitserreger zählen die Mykobakterien.

1.2 Charakteristika der Familie Mycobacteriaceae

Die Familie der Mycobacteriaceae besteht aus der einzigen Gattung Mycobacterium (M.), wobei die meisten der über 100 darin vorkommenden Spezies apathogene, ubiquitär vorkommende Bakterien sind (COSMA et al. 2003). Aufgrund ihrer lipidreichen, wachsartigen äußeren Oberflächenschicht mit vielen langkettigen Mykolsäuren verfügen die Mykobakterien über eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Umwelteinflüssen (PRIMM et al. 2004). Durch eine spezielle Färbemethode nach Ziehl-Neelsen lassen sich die säurefesten, schlanken Stäbchen leicht von anderen Bakterien im mikroskopischen Nachweis abgrenzen (MADIGAN et al. 2001). Ihre Wachstumseigenschaft auf festen Nährböden korreliert meist mit der Pathogenität: schnell-wachsende Mykobakterien (Generationszeit max. 5 h, sichtbare Kolonien innerhalb von sieben Tagen) sind überwiegend apathogen, wobei schnell-wachsend ein relativer Begriff ist, denn die Generationszeit des Gram-negativen Bakteriums Escherichia coli beträgt lediglich ca. 20 Minuten.

Langsam-wachsende Mykobakterien (Generationszeit von über 5 h, sichtbare Kolonien erst nach sieben Tagen) sind vorwiegend pathogen (LEWIN und SHARBATI-TEHRANI 2005). Beispielsweise beträgt die Generationszeit von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, dem Erreger der Paratuberkulose, auf den später noch eingegangen wird, über 24 Stunden; sichtbare Kolonien sind erst nach 2 – 3 Monaten zu verzeichnen.

1.2.1 Mykobakterien als Krankheitserreger

Die wohl bekanntesten Vertreter der Gattung Mycobacterium sind obligat pathogene Erreger wie z. B. M. tuberculosis, M. bovis, sowie der Erreger der Lepra (M. leprae).

Die humane Tuberkulose durch M. tuberculosis mit ca. 1,8 Millionen Todesfällen pro

Jahr (Schätzung der WHO 2008) gehört zu den wichtigsten bakteriellen Infektionskrankheiten des Menschen, wobei ca. 2 – 10 % der Fälle auf M. bovis beruhen. Die durch M. bovis ausgelöste Rindertuberkulose gilt in Deutschland seit 1997 als bekämpft (ROLLE und MAYR 2006).

Für den Menschen fakultativ pathogene Spezies sind z. B. Mitglieder des M.

avium-Komplex (MAC, dazu zählen M. avium ssp. avium, ssp. paratuberculosis und ssp. hominissuis), die auch als nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) bezeichnet werden. Sie besitzen eine geringe Virulenz für den Menschen und lösen oft opportunistische Infektionen bei Immunsupprimierten, z. B. HIV-Infizierten, aus (MADIGAN et al. 2001). Die in tiermedizinischer Hinsicht obligat pathogenen Mykobakterien sind z. B. der Erreger der Geflügeltuberkulose (M. avium ssp. avium, MAA) und Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) als Erreger der Paratuberkulose der Wiederkäuer.

Weiterhin werden als Mykobakteriosen alle Mykobakterien-Infektionen verstanden, die nicht zu den Tuberkulosen im engeren Sinne, d.h. der Geflügeltuberkulose, Paratuberkulose und Lepra gehören. Am häufigsten sind dies Infektionen mit Erregern des MAC bei Säugern und Vögeln. Vertreter der NTM können aber auch Fische, Amphibien und Reptilien infizieren, zu den gefährlichsten bakteriellen Erregern bei Zierfischen gilt beispielsweise M. marinum.

Zunehmend wird auch eine Rolle von MAP als Zoonose-Erreger diskutiert und in Zusammenhang mit der chronisch-inflammatorischen Darmerkrankung Morbus Crohn (MC) gebracht. Für einen Zusammenhang zwischen MC und der Paratuberkulose spricht, dass die klinischen und pathologischen Veränderungen dieser beiden Erkrankungen sich sehr ähneln. Zudem konnte MAP in vielen Fällen aus an MC-erkrankten Patienten isoliert werden (GREENSTEIN 2003). Die Ursachen von MC sind komplex, neben MAP wird auch eine genetische Prädisposition vermutet.

1.2.2 Pathomechanismen von Mykobakterien unter Einbezug von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP)

Die allgemeine herausragende Eigenschaft pathogener Mykobakterien ist die Fähigkeit, in Makrophagen innerhalb des Phagosoms zu persistieren und sich zu vermehren. Die MAP-Infektion der Wiederkäuer zeichnet sich durch einen spezifischen Krankheitsverlauf mit einer besonderen klinischen Symptomatik aus:

diese als Paratuberkulose des Rindes bekannte Erkrankung ist eine auf den Darm beschränkte granulomatöse Entzündung, die nicht therapierbar ist und tödlich endet (COUSSENS 2001). Nach der oralen Aufnahme der Erreger (z. B. über kontaminierte Milch) durch Kälber erfolgt die Infektion des gastrointestinalen Trakts, indem die Bakterien die Epithelbarriere passieren und dann von naiven, nicht durch IFN-γ vorstimulierten subepithelialen Makrophagen phagozytiert werden (SIGURDARDOTTIR et al. 2004).

Makrophagen interagieren mit Mykobakterien über verschiedene PRR. Es wird angenommen dass die Erkennung der Mykobakterien über scavenger-Rezeptoren, die Komplementrezeptoren 1, 3 und 4, surfactant Protein-Rezeptoren, den TLR 1, 2 und 6, Lektinen (wie z. B. dem Makrophagen-Mannoserezeptor oder DC-SIGN¹) oder den intrazellulären NOD²-like-Rezeptoren, erfolgt. Einige Rezeptoren initiieren nach der Erkennung des Liganden überwiegend Phagozytose, während andere, hauptsächlich die TLR, in der Signalvermittlung des Makrophagen involviert sind.

Das Zusammenspiel zwischen den TLR und/oder anderen PRR führt zur Aktivierung oder Deaktivierung des Makrophagen (EHLERS 2010). Untersuchungen mit M.

tuberculosis lassen vermuten, dass der Eintritt über den Komplementrezeptor 3 und wahrscheinlich scavenger-Rezeptoren die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies unterbindet und dass DC-SIGN und der Makrophagen-Mannoserezeptor die Expression des anti-inflammatorischen Cytokins IL-10 begünstigen. Im Gegensatz dazu fördert die Aktivierung über TLR die Expression pro-inflammatorischer Cytokine wie z. B. IL-12 und TNF-α (KORBEL et al. 2008).

1 DC-SIGN: engl.: Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin

2 NOD: engl.: Nucleotide binding Oligomerization Domain

Eine wichtige immunmodulatorische Funktion wird mykobakteriellen Zellwandbestandteilen zugeordnet. Im Prinzip gehören die Mykobakterien zu den Gram-positiven Bakterien, da sie keine äußere Membran besitzen. Die Besonderheit ist jedoch, dass sich auf der vergleichsweise dünnen Peptidoglykanschicht noch ein Polymer aus Arabinose und Galactose (das Arabinogalaktan) befindet, an das verschieden lange Mykolsäuren gebunden sind (LEWIN und SHARBATI-TEHRANI 2005). Die mykobakteriellen PAMP, die sich hauptsächlich auf der Oberfläche befinden, umfassen verschiedene Lipoglykane, Glycoproteine und Lipoproteine. Die Lipoglykane LAM, LM und PIM sind auf nicht-kovalente Weise über einen Phosphatidylmyoinositol-Anker in der Plasmamembran verankert und erstrecken sich bis ganz nach außen. Der am besten untersuchte mykobakterielle Virulenzfaktor ist das Zellwandglykolipid LAM (KOUL et al. 2004). Bei pathogenen Mykobakterien trägt LAM ein Mannose-Cap (ManLAM), wirkt anti-inflammatorisch und begünstigt das Überleben innerhalb der Makrophagen. Für das ManLAM von M. tuberculosis ist die Bindung an den Mannoserezeptor beschrieben. Obwohl auch TLR 2 und TLR 4 eine Rolle in der in der Interaktion mit M. tuberculosis zugeschrieben wird, ist ihre Rolle zwischen spezifischen mykobakteriellen Molekülen und den vermittelten Signaltransduktionswegen nicht gut verstanden (JO et al. 2007). TLR 2 bildet Dimere mit TLR 1 oder TLR 6 und erkennt vermutlich mykobakterielle Komponenten wie z.

B. Lipomannan, PILAM, PIM 2 und 6 von M. tuberculosis. Das sezernierte 19 kDa Lipoprotein von M. tuberculosis wird z. B. von TLR 2 und dem Mannoserezeptor erkannt (JO et al. 2007). Weiterhin ist beschrieben, dass der intrazelluläre Rezeptor NOD 2 Komponenten des mykobakteriellen Peptidoglykan erkennt und die Expression pro-inflammatorischer Cytokine induziert. Interessanterweise wird ein Zusammenhang zwischen Morbus Crohn und einem Polymorphismus im NOD 2-Gen angenommen (MENDOZA et al. 2009).

Nach der Erkennung und Aufnahme pathogener Mykobakterien kommt es zu keiner effektiven Erreger-Eliminierung. Für murine MAP-infizierte Makrophagen der Zellkulturlinie J774 wurde beispielsweise gezeigt, dass durch die unzureichende

der Makrophagen, wie die Zerstörung der Erreger durch hydrolytische Enzyme oder reaktive Sauerstoffspezies (die Auslöser des respiratory burst), wurden verhindert.

Diese Modulation in der Phagosomenreifung durch MAP stellt das grundlegende Ereignis in der Etablierung der persistierenden Infektion dar. Eine Infektion mit MAP unterdrückt spezifisch die pro-inflammatorische Antwort des Makrophagen, wie eine vergleichende Studie mit MAP, MAA und LPS an der murinen Makrophagen- Zellkulturlinie RAW264.7 zeigte (BASLER et al. 2008). Weitere Untersuchungen am pro-inflammatorischen Cytokin TNF-α und am Immuneffektor-Molekül IRG-1 zeigten, dass die Beeinflussung der Cytokin-Expression nach einer MAP-Infektion sowohl auf transkriptioneller als auch auf post-transkriptioneller Ebene stattfand (BASLER et al.

2006; BASLER et al. 2010).

Bei der Paratuberkulose wird angenommen, dass das intrazelluläre Bakterienwachstum schließlich zum Absterben der Makrophagen führt und zur Freisetzung der Erreger, die entweder ausgeschieden oder erneut phagozytiert werden. Die Infektion breitet sich dabei im distalen Dünndarm aus und äußert sich in immer größer werdenden Läsionen der Darmschleimhaut und einer diffusen granulomatösen Entzündung. Dies ist u. a. auf eine verminderte TNF-α-Produktion und dem Verlust der CD4⁺-T-Zellantwort zurückzuführen. In einem weiteren in vitro MAP-Infektionsmodell mit der murinen Makrophagen-Zelllinie J774 konnte gezeigt werden, dass die Antigen-spezifische Stimulation von CD4⁺-T-Zellen inhibiert wurde, die Expression von Molekülen wie z. B. B7.1, B7.2 oder MHC-Klasse II aber unverändert war. Die Autoren dieser Studie kamen zu dem Schluss, dass MAP möglicherweise die Expression anderer ko-stimulierender Moleküle des Makrophagens beeinflusst (ZUR LAGE et al. 2003). Eine große Gruppe ko-stimulierender Moleküle sind Mitglieder der Tumornekrosefaktor-Superfamilie (TNFSF) und TNF-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF), zu denen 4-1BB/4-1BBL gehören. Das 4-1BB/4-1BBL-System wird im Abschnitt 1.4 ausführlich beschrieben.

1.3 Signalvermittlung über TLR

Die oben bereits erwähnte breit gefächerte Erkennung von PAMP durch TLR ist von außerordentlich wichtiger Bedeutung in der Makrophagenaktivierung. Bevor die weniger gut erforschten MAP-induzierten Signalwege dargestellt werden, werden zunächst die durch LPS-induzierten bekannten Signalwege erläutert. Da die TLR-induzierten Signalwege überwiegend in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB kulminieren, der die Expression einer großen Anzahl an inflammatorischen Cytokinen kontrolliert (KAWAI und AKIRA 2007), wird die Rolle von NF-κB im Anschluss beschrieben.

1.3.1 LPS in der Makrophagenaktivierung

Das wohl am besten untersuchte PAMP ist das Lipopolysaccharid (LPS). LPS, auch als Endotoxin bezeichnet, ist die strukturelle Hauptkomponente der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Bei einer Infektion mit Gram-negativen Bakterien ist LPS fast vollständig für die Induktion der Makrophagen-Aktivierung verantwortlich (ROSENBERGER et al. 2000).

Die wahrscheinlich wichtigste Rolle in der LPS-induzierten Signalvermittlung spielt TLR 4. Zunächst wird LPS von im Plasma vorliegendem LBP (LPS binding protein) gebunden, und dieser Komplex wird wiederum von dem löslichen oder membrangebundenen Makrophagenrezeptor CD14 erkannt. CD14 verfügt über keine cytoplasmatische Domäne, ein Signal in die Zelle kann nur durch die Bindung an weitere Rezeptoren erfolgen. CD14 überträgt LPS auf TLR 4, der innerhalb eines lipid bilayer liegt. Für die LPS/TLR 4-Interaktion ist das Molekül MD2 notwendig, da es die Empfindlichkeit von TLR 4 gegenüber LPS gewährt (SHIMAZU et al. 1999).

LPS ist in der Lage, mit weiteren Rezeptoren innerhalb des lipid bilayer zu interagieren, wie z. B. CXCR4, Hsp 70 und 90 (heat shock protein), GDF5 (growth differentiation factor) und wahrscheinlich CD55 (SOMMER 2005; TRIANTAFILOU

Weiteren sind noch Integrine oder der scavenger-Rezeptor beschrieben, LPS zu erkennen (FENTON und GOLENBOCK 1998). Die Vielfalt der unterschiedlichen Rezeptoren lässt vermuten, dass eine Zelle flexibel und spezifisch auf ein LPS- Signal reagieren kann.

Die weitere Signalvermittlung erfolgt über intrazelluläre Adaptermoleküle und Kinasen und endet letztlich in der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Je nachdem, welches Adaptermolekül an die intrazelluläre Domäne des TLR 4 bindet, wird zwischen zwei unterschiedlichen Wegen unterschieden: dem MyD88 (myeloid differentiation factor 88)-abhängigen oder dem MyD88-unabhängigen Weg, der auch als TRIF-Weg bekannt ist. Der MyD88-abhängige Weg vermittelt die Expression früher NF-κB-abhängiger Gene, der TRIF-abhängige Weg vermittelt die späte Aktivierung von NF-κB (Abbildung 1). Der TRIF-Weg aktiviert zudem den Transkriptionsfaktor IRF-3, was zur Expression von IFN-β führt und über einen positiven feedback-Mechanismus zur Expression IFN-induzierbarer Gene. Beide Wege zusammen sind für die vollständige Induktion der inflammatorischen Antwort via TLR 4 verantwortlich, während bei anderen TLR entweder der MyD88- (z. B. TLR 2) oder der TRIF-abhängige (TLR 3) Weg die Cytokinexpression induziert (KAWAI und AKIRA 2007).

Abbildung 1: Die Makrophagen-Aktivierung über TLR 4 führt zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-κB und IRF-3. Der MyD88-abhängige Weg (links) führt zur frühen NF-κB-Aktivierung, der TRIF-abhängige Weg (rechts) zur IRF-und späten NF-κB-Aktivierung. Beide Wege induzieren die Transkription inflammatorischer Cytokine (modifiziert nach YAMAMOTO et al., 2003).

1.3.2 Mykobakterien in der Makrophagenaktivierung

Die Aktivierung der Makrophagen durch Mykobakterien wie MAP ist komplexer im Vergleich zu LPS und weniger gut erforscht. Das funktionelle Analogon zum LPS ist LAM, ein Hauptbestandteil der mykobakteriellen Zellwand. Das LAM von M.

tuberculosis und M. bovis beispielsweise wird wahrscheinlich von TLR 2 erkannt (JO et al. 2007), wobei TLR 2 entweder mit TLR 1 oder TLR 6 assoziiert. Es wird angenommen, dass auch andere mykobakterielle Komponenten über diese TLR erkannt werden. Weiterhin ist beschrieben, dass hitzelabile Bestandteile von M.

tuberculosis über TLR 4 erkannt werden (QUESNIAUX et al. 2004). Die weiter

beispielsweise oben angesprochene anti-inflammatorische Wirkung von ManLAM steht im direkten Gegensatz zu der pro-inflammatorischen Wirkung von LPS.

1.3.3 Die Regulation von NF-κB in der Entzündungsantwort

Die generelle Reaktion des Makrophagen auf phagozytierte Pathogene ist das Auslösen einer Entzündungsreaktion. Durch vom Makrophagen sezernierte Proteine wie z. B. Cytokine, Chemokine, Enzyme und andere biologisch aktive Substanzen entsteht eine lokale Gewebereaktion (JANEWAY 2002). Grundsätzlich ist für die Etablierung einer Entzündung eine transkriptionelle Aktivierung der diesen inflammatorischen Faktoren zugrunde liegenden Gene von Nöten (KRACHT und SAKLATVALA 2002).

Die Aktivierung aller TLR durch PAMP mündet in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, der für die Expression der meisten Cytokine der wichtigste Transkriptionsfaktor ist. NF-κB ist aus Homo- oder Hetero-Dimeren folgender NF-κB-Familienmitglieder zusammengesetzt: RelA (p65), RelB, c-Rel, p50 und p52. p50 und p52 entstehen aus den größeren Vorläuferformen p105 bzw. p100.

Im klassischen Sinn bezeichnet NF-κB das Heterodimer p50/p65 (PEREIRA und OAKLEY 2008). Nur drei Mitglieder (p65, RelB und c-Rel) besitzen eine Transaktivierungsdomäne und fördern direkt die Transkription; p50- und p52-Dimere hingegen hemmen diese. Alle fünf NF-κB-Untereinheiten verfügen über eine Rel-Homologie-Domäne, die die Dimerisierung, die Bindung an die DNA, die Translokation in den Zellkern und die Interaktion mit Inhibitoren von NF-κB, den IκB, vermitteln (NEUMANN und NAUMANN 2007).

Die transkriptionelle Aktivierung von NF-κB ist auf verschiedenen Stufen der eingeleiteten Signalwege streng kontrolliert, da eine zu starke Aktivierung dem Wirtsorganismus schaden würde. Im nicht-stimulierten Zustand der Zelle liegt NF-κB in einer inaktiven Form im Cytoplasma vor, da die „klassischen“ IκB-Proteine IκBα, IκBβ, und IκBε über ankyrin-repeat motifs an NF-κB (wie z. B. p65/p50- oder p65/cRel) binden und so die Translokation in den Zellkern verhindern (KAWAI und AKIRA 2007). Auch p105 und p100 besitzen IκB-ähnliche Wiederholungen die degradiert werden müssen. Diese cytoplasmatischen IκB-Proteine werden nach einem Stimulus schnell degradiert, freies NF-κB wird in den Zellkern transloziert und

die Transkription inflammatorischer Gene induzieren. Weitere IκB-Mitglieder wie Bcl-3, IκBζ und IκBNS liegen im Zellkern vor (Abbildung 2) und regulieren dort die Transkription, in dem sie an die NF-κB-Untereinheit p50 oder p52 binden (YAMAMOTO und TAKEDA 2008). Diese drei kernlokalisierten IκB-Proteine können die Transkription pro-inflammatorischer Gene sowohl aktivieren, reprimieren und zeitlich steuern. Die Expression des pro-inflammatorischen Cytokins IL-6 beispielsweise ist sehr gut beschrieben. Nach LPS-Stimulation wird die IκBζ-Expression schnell induziert. IκBζ ist für die Expression von IL-6 notwendig, kann aber nicht direkt an den Promotor binden. Zunächst assoziiert IκBζ mit der p50, bindet dann an die NF-κB-Bindungsstelle des IL-6 Promotors und initiiert die Transkription des IL-6-Gens (YAMAMOTO et al. 2004).

Abbildung 2: Die im Kern lokalisierten IκB-Proteine beeinflussen die Transkription NF-κB- abhängiger Gene. Bcl-3 unterdrückt die Expression früher Gene. Die IκBζ- und IκBNS-Proteine werden selbst früh synthetisiert und beeinflussen dann die Expression der späten NF-κB-abhängigen

1.4 Das 4-1BB/4-1BBL-System

1.4.1 Charakteristika von 4-1BB/4-1BBL

Das 4-1BB Gen (CD137, TNFRSF9) wurde erstmals 1989 von KWON et al. aus aktivierten T-Zellen einer Maus kloniert (KWON und WEISSMAN 1989); vier Jahre später wurde, ebenfalls aus T-Zellen, das humane Homolog ILA (induced by lymphocyte activation) kloniert (SCHWARZ et al. 1993). Der murine 4-1BB Rezeptor ist ein ca. 30 kDa großes Glycoprotein und kommt sowohl als Monomer als auch als 55 kDa großes Dimer an der Zelloberfläche vor (POLLOK et al. 1993). SETAREH et al. fanden 1995 heraus, dass 4-1BB auch von Monozyten, Fibroblasten und Chondrozyten exprimiert wird (SETAREH et al. 1995). Heute ist bekannt, dass die meisten immunkompetenten Zellen 4-1BB exprimieren. 4-1BB konnte auch in Gewebe, Tumoren etc. nachgewiesen werden. Neben dem membrangebundenen 4-1BB Rezeptor wird auch eine lösliche Form, s4-1BB, durch alternatives Spleißen der Transmembrandomäne gebildet, und s4-1BB wurde ebenfalls in den oben genanten Zelltypen gefunden (SETAREH et al. 1995). s4-1BB und 4-1BB konkurrieren um die Bindung mit dem 4-1BB Liganden (4-1BBL). Die 4-1BBL Expression wurde überwiegend auf B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen beobachtet (GOODWIN et al. 1993). Neben der Fähigkeit, die T-Zelle über 4-1BB ko- stimulieren zu können, werden auch Signale zurück in die Ligand-exprimierende Zelle vermittelt. Dieses Phänomen wird als bi-direktionale oder reverse Signalvermittlung bezeichnet. An Monozyten wurde beispielsweise gezeigt, dass die 4-1BBL Ligation zur Expression von M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), weiteren Cytokinen und verlängertem Überleben der Zellen führt (SALIH et al. 2002).

Durch die Aktivität einer Matrix-Metalloproteinase (MMP) kann eine lösliche Form des Liganden, s4-1BBL, von der Zelloberfläche freigesetzt werden (auch als shedding bekannt) (SALIH et al. 2001). Die daraus resultierende Konsequenz ist unklar, wahrscheinlich dient s4-1BBL der Limitierung inflammatorischer oder ko- stimulierender Antworten (SALIH et al. 2002).

1.4.2 Die Rolle von 4-1BB/4-1BBL im Immunsystem

Eine der zentralen zellulären Reaktionen des Immunsystems auf bakterielle Infektionen ist die Interaktion zwischen Makrophagen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) und T-Zellen; dieses Zusammenwirken ist unabdingbar für die Entwicklung einer adaptiven Immunantwort und die letztendliche Beseitigung des bakteriellen Erregers. Die wesentlichen Reaktionen des Makrophagen auf bakterielle Stimuli sind die Expression pro-inflammatorischer Cytokine, die Prozessierung von Antigenen und die Expression ko-stimulatorischer Moleküle. Letzteres ist von zentraler Bedeutung, denn die Aktivierung naiver T-Zellen erfordert zwei voneinander unabhängige Signale: der T-Zell-Rezeptor (TCR) erkennt den Antigen:MHC-Komplex der APC, zusätzlich muss von derselben APC noch ein zweites, ko-stimulierendes Signal ausgehen (BRETSCHER und COHN 1970). Die TCR-Stimulation ohne weitere ko-stimulierende Signale führt zum Tod der T-Zelle oder zur T-Zell-Anergie³. Das am besten charakterisierte ko-stimulierende Molekül auf der APC ist B7, das nach Bindung an den CD28-Rezeptor eine T-Zelle zur Proliferation anregt (Abbildung 3). Ist die naive T-Zelle aktiviert, exprimiert sie weitere Rezeptoren, die ko-stimulierende Signale erhalten und für die klonale Vermehrung und Differenzierung der T-Zelle sorgen. Solch ein aktivierungsabhängiges, ko- stimulierendes Molekül ist der 4-1BB Rezeptor (4-1BB), der seinen Liganden (4-1BBL) auf der APC bindet (JANEWAY 2002).

Abbildung 3: Für die vollständige Aktivierung einer T-Zelle bedarf es neben der TCR/MHC-Interaktion eines weiteren ko-stimulierenden Signals, z. B. durch den 4-1BB/4-1BBL-Komplex (modifiziert nach VINAY et al. 2006).

Die 4-1BB/4-1BBL-Interaktion spielt in der T-Zell-Aktivierung eine wichtige Rolle:

Während CD28 konstitutiv auf T-Zellen exprimiert wird, muss die 4-1BB Expression erst induziert werden, und ist dann als lang anhaltende ko-stimulatorische Komponente wichtig für die späten Phasen und die Aufrechterhaltung der Immmunantwort (KWON et al. 2000). 4-1BB wird sowohl von CD4⁺-, überwiegend aber von CD8⁺-T-Zellen exprimiert und induziert die Proliferation, Cytokin-Produktion und das Überleben von T-Zellen (WANG et al. 2009).

Interessanterweise ist die 4-1BB Expression nicht nur auf T-Zellen beschränkt und wurde auch auf APC, z. B. Makrophagen, gefunden. Warum Makrophagen sowohl 4-1BB als auch den 4-1BBL exprimieren, ist bisher nicht verstanden (WANG et al.

2009).

Während die Mehrzahl der Studien die Funktion von 4-1BB auf T-Zellen betrachtet, ist die Rolle von 4-1BB bei Zellen der angeborenen Immunantwort, wie z. B. den Makrophagen, kaum untersucht. Daraus ergibt sich die Fragestellung, ob 4-1BB neben der wichtigen Funktion in der adaptierten Immunantwort auch eine Rolle in der Aktivierung der angeborenen Immunantwort spielt. Im folgenden Abschnitt werden die bisher bekannten Eigenschaften von 4-1BB und 4-1BBL erläutert.

1.4.3 Signalvermittlung über 4-1BB/4-1BBL

4-1BBL (CD137L, TNFSF9) ist ein Typ-II-Transmembranprotein und gehört zur TNF-Superfamilie, einer Familie, deren Mitglieder (wie z. B. TNF, CD40L) über eine TNF-Homologie-Domäne (THD) im extrazellulären Bereich verfügen. Die THD bindet an eine cysteinreiche Domäne (CRD) im extrazellulären Teil von 4-1BB. Aufgrund der CRD zählt das Typ-I-Transmembranprotein zur TNF-Rezeptorsuperfamilie (TNFRSF) mit bisher über 20 bekannten Mitgliedern (z. B. TNFR, CD40) (BODMER et al. 2002). TNF und einige andere Liganden (LT-α und LT-β) interagieren mit mehreren Rezeptoren (TNFRI, TNFRII). Andere Liganden jedoch binden ihren Rezeptor nach dem one ligand one receptor principle (4-1BB/4-1BBL, CD27/CD27L, CD30/CD30L, CD40/CD40L) und verfügen über keinen weiteren Interaktionspartner (GRUSS und DOWER 1995). Von 17 untersuchten Liganden der TNF-Superfamilie konnte gezeigt werden, dass 4-1BBL ausschließlich 4-1BB bindet (BOSSEN et al.

2006). Des Weiteren ist beschrieben, dass 4-1BB in der Lage ist, extrazelluläre Matrixproteine wie Laminin zu binden. So ist 4-1BB vermutlich ein Zell-Adhäsions- und ein Zell-Aktivierungsmolekül (LOO et al. 1997).

Die über 4-1BB induzierte Signalvermittlung ist am besten an T-Zellen untersucht. Es wird angenommen, dass trimerisiertes 4-1BBL 4-1BB bindet und ebenfalls eine 4-1BB-Trimerbildung induziert. Dies initiiert intrazelluläre Signalwege. An die cytoplasmatische Domäne von 4-1BB binden Adapter-Proteine der TRAF- (TNF-receptor-associated factor) Familie, von der bisher sieben Mitglieder bekannt sind (LOCKSLEY et al. 2001). Die TRAF-Proteine wiederum binden weitere Proteine und vermitteln so den von 4-1BBL induzierten zellulären Effekt. Das murine 4-1BB assoziiert über die cytoplasmatische Domäne mit TRAF 1 und 2, was u. a. zu der Aktivierung von NF-κB führt. Dadurch wird die Expression von u. a.

anti-apoptotischen Genen der Bcl-2-Familie induziert, was letztendlich zum Überleben der T-Zelle führt (WANG et al. 2009).

Die Mechanismen der reversen Signalübertragung durch 4-1BBL in APC sind

an 4-1BBL und 4-1BB knock-out Makrophagen zeigten, dass 4-1BBL verantwortlich ist für die Aufrechterhaltung der TNF-α-Expression über den TRIF-abhängigen Weg.

Da 4-1BB keinen Einfluss auf die TNF-α-Expression hatte, ist dieser Weg wahrscheinlich unabhängig von 4-1BB (KANG et al. 2007).

Das komplexe Expressionsmuster, die reverse Signalübertragung und die mögliche Assoziation mit anderen Rezeptoren lassen vermuten, dass das 4-1BB/4-1BBL- System eine wichtige Rolle in verschiedenen Stufen der angeborenen und erworbenen Immunität spielt.

1.4.4 4-1BB/4-1BBL im Krankheitsgeschehen

Das größte Interesse der 4-1BB/4-1BBL-Untersuchungen galt bisher der CD8⁺-T-Zell-Immunität. Vieles weist jedoch darauf hin, dass die 4-1BB/4-1BBL- Interaktion auch bei Autoimmunkrankheiten und in Entzündungsgeschehen involviert ist, von denen angenommen wird, dass sie hauptsächlich über CD4⁺-T-Zellen reguliert werden (KWON 2009).

4-1BB ist möglicherweise auch in der Ausbildung einer immunologischen Antwort gegen mykobakterielle Infektionen involviert. In den Lungen-Granulomen von Mycobacterium tuberculosis-infizierten Patienten konnte die 4-1BB Expression auf T-Zellen nachgewiesen werden (BOUSSAUD et al. 1998). Auch humane Mikroglia-Zellen (die Makrophagen des Gehirns) exprimierten nach Infektion mit M.

tuberculosis und M. avium 4-1BB (CURTO et al. 2004). Interessanterweise wurde auch bei der chronisch-entzündlichen Darmerkrankung Morbus Crohn (MC) eine vermehrte 4-1BB-Expression in entzündetem Darmgewebe der Patienten gefunden (LEE et al. 2005a; MAERTEN et al. 2004). Da, wie oben schon beschrieben, vermutlich ein ätiologischer Zusammenhang zwischen MC und einer MAP-Infektion besteht, wäre es durchaus denkbar, dass die vermehrte 4-1BB-Expression auf eine MAP-Infektion zurückzuführen ist.

1.5 Zielsetzung dieser Arbeit

Die Expression und Interaktion der ko-stimulierenden Moleküle 4-1BB und 4-1BBL wird vermehrt mit inflammatorischen Krankheitsgeschehen in Verbindung gebracht.

Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von 4-1BB für den Makrophagen in Zusammenhang mit der pro-inflammatorischen Stimulation durch LPS und Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), dem Erreger der Paratuberkulose, zu ermitteln.

2 Material und Methoden

2.1 Material

Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden, falls nicht anders gekennzeichnet, von Roth (Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Serva (Heidelberg) oder Sigma (Deisenhofen) bezogen. Die Restriktionsendonukleasen waren von New England Biolabs (Frankfurt am Main) und weitere molekularbiologische Enzyme von Invitrogen (Karlsruhe) oder Merck (Darmstadt).

Für die Kultivierung der Zelllinien wurden Zellkulturmedien und –zusätze der Firma Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) eingesetzt.

2.1.1 Zelllinien

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit folgenden Zelllinien gearbeitet:

• RAW264.7-Zellen (ATCC⁴-Nr. TIB-71), eine mit dem murinen Abelson Leukämievirus transformierte Mausmakrophagenzelllinie (RASCHKE et al.

1978);

• HEK-293-Zellen (ATCC-Nr. CRL-1573), eine mit dem Adenovirus transformierte humane Epithelzelllinie (GRAHAM et al. 1977);

• die primären murinen Knochenmarksmakrophagen wurden freundlicherweise von Prof. Dr. W. Bäumer⁵ zur Verfügung gestellt.

In dieser Arbeit wurden weiterhin hergestellt:

• eine 4-1BB-knock-down Makrophagenzelllinie;

• eine 4-1BB-Promotor Zelllinie (beide RAW264.7 Hintergrund) und

• eine s4-1BB-überexprimiernde Zelllinie (HEK-293 Hintergrund), auf die an entsprechender Stelle eingegangen wird.

4 American Type Culture Collection

5 Institut für Pharmakologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover

2.1.2 Bakterienkulturen

• Mykobakterien

Für die Infektionsversuche wurde Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) eingesetzt. Der verwendete MAP Feldstamm 6783, der erstmals von JARK et al.

(JARK et al. 1997) beschrieben wurde, stammte von der DSMZ⁶ (Nr. 44135). Der Stamm weist ein mycobactinabhängiges Wachstum auf und wurde vom nationalen Referenzzentrum für Mykobakterien⁷ durch Sequenzanalyse der 16S rRNA als MAP identifiziert. Die Bestätigung der Klassifizierung erfolgte am Institut für Mikrobiologie an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durch den PCR-gestützten Nachweis der Insertionssequenz 900 (IS900).

• Escherichia coli

Für sämtliche Klonierungsarbeiten wurde der Escherichia coli (E. coli) Stamm DH5α mit dem Genotyp F^- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ^- von Invitrogen (Karlsruhe) eingesetzt.

2.1.3 Plasmide

Die in dieser Arbeit verwendeten, kommerziell erworbenen Plasmide pGL3-Basic, pRL-TK (beide Promega, Mannheim), pCR^®2.1-TOPO und pRc/CMV (beide Invitrogen, Karlsruhe), pIMG-800 (Imgenex, Hamburg) und pTK-neo (Novagen, Darmstadt) sind im Anhang aufgeführt. Das 4-1BB shRNA Plasmid (Amp⁺, Neo⁺) wurde freundlicherweise von Herrn Jiahuai Han⁸ zur Verfügung gestellt (KANG et al.

2007). Die Zielsequenz richtet sich gegen 21 Nukleotide im Exon 6 des murinen 4-1BB Gens (siehe Ergebnisteil). Des Weiteren wurden folgende Plasmide hergestellt:

Tabelle 2: Übersicht über die in dieser Arbeit konstruierten Plasmide.

Plasmid DNA-Insertion Primer Methode Vektor-backbone

p4-1BB -276 bp (Minimalpromotor)

genomische RAW264.7 DNA des 4-1BB

Promotors

1+2 über BGLII,HINDIII Schnittstellen

kloniert

pGL3-basic (Reportergenvektor)

p4-1BB -247 bp 3+2

p4-1BB -206 bp 4+2

p4-1BB -130 bp 5+2

p4-1BB -100 bp

sukzessive Deletionen ausgehend vom Minimalpromotor-Insert

6+2

über BGLII,HINDIII Schnittstellen

kloniert

pGL3-basic (Reportergenvektor)

ΔcRel 7+8

ΔSTAT6 9+10

ΔcRelΔSTAT6

ortsgerichtete Mutationen ausgehend

vom Minimalpromotor- Plasmid

11+12

Plasmidbasiert (site directed mutagenesis)

pGL3-basic (Reportergenvektor)

s4-1BB RAW264.7 4-1BB

cDNA 13+14

über HINDIII,APAI Schnittstellen

kloniert

pRc/CMV (Expressionsvektor)

Tabelle 3: Übersicht über die bei den Klonierungen eingesetzten Oligonukleotidprimer. Unterstrichen sind die eingefügten Restriktionsenzym-Schnittstellen, fett gedruckt die eingeführten Mutationen.

Plasmid Primersequenz (5’ Æ 3’)

1 p4-1BB -276 bp forward CCGCAGATCTTCCAGGAAACGTCCTAATGG

2 reverse CCCAAGCTTTAGTCCCCAGCAGACAAACC

3 p4-1BB -247 bp forward CGCGAGATCTGCTGATTCCAAGAAACCCTTC 4 p4-1BB -206 bp forward GGGGAGATCTCTGAAGCTCTGGGGATTTTG 5 p4-1BB -130 bp forward GGCGAGATCTACAGAGCAGCTGGGGATTT 6 p4-1BB -100 bp forward GGGGAGATCTTTTGACCTGTGGTTTGTGG

7 ΔcRel forward CCTCACAGAGCAGCTGCCGCTTTCCCAGGAGGCCC

8 reverse GGGCCTCCTGGGAAAGCGGCAGCTGCTCTGTGAGG

9 ΔSTAT6 forward GGGGATTTCCCAGCCGGCCCTGCTCAGTTGAGTCACAGG

10 reverse CCTGTGACTCAACTGAGCAGGGCCGGCTGGGAAATCCCC

11 ΔcRelΔSTAT6 forward CCTCACAGAGCAGCTAACACTCTCCCAGGCGGCCCTGC

12 reverse GCAGGGCCGCCTGGGAGAGTGTTAGCTGCTCTGTGAGG

13 4-1BB (Startcodon) forward GCGCAAGCTTATGGGAAACAACTGTTACAACG 14 4-1BB (Stoppcodon) reverse TTATGGGCCCTCACAGCTCATAGCCTCCTC

Die in dieser Arbeit verwendeten IL-6 Reportergenplasmide wurden freundlicherweise von Frau Sandra Sommer zur Verfügung gestellt und sind in ihrer PhD-These beschrieben (SOMMER 2005). Das AP1-Triplett wurde freundlicherweise von Herrn Dirk Werling⁹ zur Verfügung gestellt.

2.1.4 Oligonukleotide und Antikörper

Die verwendeten Oligonukleotide 1-6 (Tabelle 3) wurden in HPLC-gereinigter

HPLC-gereinigter Qualität von der Firma MWG Biotech AG (Ebersberg) synthetisiert (Tabelle 3, Tabelle 5). Eine Aufstellung der eingesetzten Antikörper gibt Tabelle 4.

Tabelle 4: Übersicht über die beim Western Blot eingesetzten Antikörper.

Antikörper Verdünnung 2. AK

(1:10000) Größe [kDa] Anmerkung Firma 4-1BB 1:400 Biotin-AP 30 Monomer

55 Dimer Nicht-

reduzierend eBioscience

4-1BBL 1:400 Goat-AP 97 - Santa Cruz

p38 1:1000 Rabbit-AP 38 Proteinabgleich NEB

Aktin 1:1000 Rabbit-AP 42 Proteinabgleich Sigma

Tabelle 5: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotidprimer.

Gen Primersequenz (5’ Æ 3’)

15 4-1BB forward AGT GCA TTG AAG GAT TCC ATT G 16 reverse CTC TGG AGT CAC AGA AAT GGT G 17 4-1BBL forward GCC TAG TCG CTT TGG TTT TG

18 reverse GTG GCC TGT GTT TGT GAA TG

19 GeneRacer^TM 5’ forward CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA 20 GeneRacer^TM 5’nested forward GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA 21 RACE_4-1BB 3’ reverse GGC TGA CAG TTA TCA CAG GAG TTC 22 RPS9 forward CTG GAC GAG GGC AAG ATG AAG C

23 reverse TGA CGT TGG CGG ATG AGC ACA

24 PT-4-1BB forward GCT GGG GCT TTG TAG GCT AT 25 reverse TGC TCA GGT TGA CAG ATT CG 26 Ccl-5 forward CCC TCA CCA TCA TCC TCA CT

27 reverse AGC AAG CAA TGA CAG GGA AG

28 Ccl-2 forward CTG TGC TGA CCC CAA GAA GG

29 reverse AAT TAA GGC ATC ACA CAG TCC GAG TC 30 Cxcl-2 forward TGAGTGTGACGCCCCCAGGAC

31 reverse TCA GAC AGC GAG GCA CAT CAG GTA

32 IL-1RA forward GAA AAG ACC CTG CAA GAT GC 33 reverse TTT CTC AGA GCG GAT GAA GG 34 IL-1β forward TTG ACG GAC CCC AAA AGA TG

35 reverse AGA AGG TGC TCA TGT CCT CA

36 TNF-α forward TCTCATCAGTTCTATGGCCC 37 reverse GGGAGTAGACAAGGTACAAC 38 IL-6 forward GTT CTC TGG GAA ATC GTG GA

39 reverse TGT ACT CCA GGT AGC TAT GG

40 IFN-β forward ACC ACA GCC CTC TCC ATC AAC TA

2.1.5 Lösungen, Puffer und Geräte

Alle in dieser Arbeit verwendeten Lösungen, Puffer und Geräte sind, wenn nicht anders gekennzeichnet, im Anhang aufgelistet.

2.2 Methoden

2.2.1 Zellbiologische Arbeiten

• Kultivierung der Zellen

Die Kultivierung aller Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C unter 8 % Kohlendioxidbegasung und unter feuchter Atmosphäre in Gewebekulturflaschen oder Petrischalen. Die RAW264.7 und HEK-293 Zellen wurden in mit 10 % [v/v] FCS und 2 mM L-Glutamin supplementiertem DMEM (sog. Vollmedium) kultiviert.

Die Passagierung der RAW264.7 Zellen erfolgte alle zwei Tage in einer 1:2 oder 1:3 Verdünnung, wobei die Makrophagen in DMEM abgeschabt und auf Zellkulturflaschen mit frischem Medium verteilt wurden.

Zur Passage der HEK-293 Zellen wurden diese alle zwei Tage in warmen PBS gewaschen und zum Ablösen für 5 min mit Trypsin/EDTA inkubiert. Die Zellen wurden in Medium suspendiert und in einer Verdünnung von 1:5 bis 1:10 auf Zellkulturflaschen mit frischem Medium verteilt.

Zur Kryokonservierung wurden die Zellen vor Erreichen der Konfluenz abgelöst, zentrifugiert und in eiskaltem Einfriermedium¹⁰ suspendiert. Nach Überführen in Kryoröhrchen wurden die Zellen 8 h bei –20°C und dann mindestens 24 h bei -80°C gelagert. Die dauerhafte Konservierung erfolgte in flüssigem Stickstoff.

Zum Auftauen wurden die Zellen durch kurzes Überführen in ein 37°C warmes Wasserbad zügig angetaut und mit frischem Medium wieder in Kultur gebracht.

Die primären Knochenmarksmakrophagen wurden in Zusammenarbeit mit Prof. Dr.

W. Bäumer¹¹ nach der von LUTZ et al. (LUTZ et al. 1999) beschriebenen Methode

10 Einfriermediumm: 70 % [v/v] DMEM; 20 % [v/v] FCS; 10 % [v/v] DMSO

11 Vgl.⁵

isoliert und nach der Ausdifferenzierung zu Makrophagen für Stimulations- bzw.

Infektionsversuche verwendet.

• Kultivierung der stabil transformierten Zellen

Die Kultivierung der stabil transformierten Zellen (siehe 2.2.3) erfolgte wie oben beschrieben mit der Ausnahme, dass dem Vollmedium 600 µg/ml G418¹² zugesetzt wurde. Bei einem Infektions- oder Stimulationsversuch (siehe 2.2.2) wurde das Selektionsmedium einen Tag vorher gegen Vollmedium ersetzt.

• Kultivierung der Mykobakterien

Die Kultivierung von MAP erfolgte an der Oberfläche in Zellkulturflaschen über acht Wochen in 20 ml Watson-Reid-Medium (supplementiert mit 4 g/l Natriumpyruvat und 2 mg/l Mycobactin J) bei 37°C und unter feuchter Atmosphäre im Brutschrank. Zur längeren Konservierung wurden die Mykobakterien in Watson-Reid oder LB-Medium mit 25 % [v/v] Glyzerol bei -80°C eingefroren oder es erfolgte die Anfertigung von Lyophilisaten. Dabei wurde Kulturmaterial in 10 ml FCS mit Zusatz von 10 % [w/v]

Glukose aufgenommen, je 1 ml in ein Lyophilisatgefäß überführt und 12 bis 16 h lyophilisiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

Für die Infektionsversuche wurden Kolonien von MAP mit einer sterilen Impföse von der Oberfläche des Mediums in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml DMEM überführt und mit 30 sterilen Glasperlen für 5 min gevortext und bei 200 x g für 10 min und RT zentrifugiert. Die Bakteriensuspension wurde vorsichtig abpipettiert und mit DMEM auf eine OD660 von 0,15 eingestellt. Die Vitalität der gewonnenen Mykobakterien wurde mit dem BacLight^® System nach Herstellerangaben überprüft. Im Allgemeinen betrug die Vitalität der Bakterien ca. 70 bis 80 %.

2.2.2 Infektion und Stimulation der Makrophagen

• MAP-Infektion und LPS-Stimulation der Makrophagen

Die RAW264.7 Zellen wurden wie beschrieben abgelöst und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Die Aussaat erfolgte in Vollmedium in Zellkulturplatten oder Zellkulturschalen, so dass sich bei der Infektion eine Konfluenz von ca. 90 % ergab.

Die Zellzahl ist bei der jeweiligen Methodenbeschreibung aufgeführt. Am Versuchstag wurde zur Stimulation der Makrophagen entweder LPS¹³ (finale Konzentration von 1 oder 5 µg/ml je nach Angabe) oder Pam3CSK4¹⁴ (finale Konzentration von 1 µg/ml) in das Medium pipettiert und bis zu den entsprechenden Erntezeitpunkten auf den Zellen gelassen. Die Kontrollen blieben unbehandelt. Für die MAP-Infektion wurde das Medium abgesaugt und gegen die Bakteriensuspension ersetzt. Nach einer Infektionszeit von 2 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um alle noch extrazellulär gelegenen Mykobakterien zu entfernen und anschließend mit frischem Vollmedium bis zu dem entsprechenden Erntezeitpunkt inkubiert.

• Stimulation der Makrophagen mit dem s4-1BB HEK-293 Überstand

Die s4-1BB überexprimierenden HEK-293 Zellen (siehe 2.2.3) wurden wie oben beschrieben ausgesät und am nächsten Tag gegen G418-freies Medium ersetzt.

Nach 24 h wurde der Überstand gesammelt, steril filtriert und am gleichen Tag zu Stimulationsversuchen verwendet.

2.2.3 Herstellen von Zelllinien mittels stabiler Transfektionen

• Herstellen der 4-1BB-knock-down Makrophagenzelllinie

Zunächst wurde endotoxinfreie 4-1BB shRNA Plamid-DNA präpariert. 5 x 10⁶ RAW 264.7 Zellen wurden in 10 cm Schalen ausgesät und waren am Tag der Transfektion 50 – 70 % konfluent. 6 µg Plasmid DNA wurde mit Hilfe des Transfektionsreagenzes

13 LPS von Salmonella Typhimurium, Sigma, Deisenhofen

14 Pam3CSK4, synthetisches bakterielles Lipoprotein, InvivoGen, Toulouse, Frankreich

Lipofectamine^TM LTX (Invitrogen) nach Herstellerangaben transfiziert. Nach 6 h wurde das Medium gewechselt. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen unter stufenweisem Anstieg (alle drei Tage) der G418 Konzentration von 200 µg/ml bis hin zu 600 µg/ml selektiert, wobei eine finale Konzentration von 600 µg/ml beibehalten wurde. Nach ca. 14 Tagen wurden inselförmig wachsende Zellklone gepickt und auf 24-well Platten vereinzelt. Putative 4-1BB-knock-down Klone wurden zunächst durch Northern Blot-Analysen untersucht, positive daraufhin weiter kultiviert. Um auszuschließen, dass ein putativer 4-1BB-knock-down Klon aus gemischten Klonen bestand, wurden wiederum Einzelklone gepickt und diese im Western-Blot analysiert.

• Herstellen der stabilen 4-1BB-Promotor-Zelllinie

Die 4-1BB Minimalpromotor-Plasmid DNA (siehe Tabelle 2) wurde endotoxinfrei präpariert. Die Transfektion erfolgte mit dem Transfektionsreagenz ExGen 500 (Fermentas). Am Vortag wurden 1,5 x 10⁵ RAW264.7 Makrophagen in eine 35 mm Schale in Vollmedium ausgesät, und am nächsten Tag wurden 6 µg Minimalpromotor-Plasmid-DNA sowie 2 µg pTKNeo (Novagen) mit dem Selektionsmarker für Neomycin ko-transfiziert wurde. Die Antibiotikaselektion erfolgte wie oben beschrieben. Es wurde angenommen, dass RAW264.7 Zellen, die das 4-1BB-Promotorkonstrukt inserierten, auch das Plasmid mit Selektionsmarker aufnahmen. Erfolgreich transformierte Klone wurden über die Messung der Luciferase im Mikroplatten-Reader (Tecan) bestimmt (siehe 2.2.8).

• s4-1BB Überexpression in HEK-293

Die Plasmid-DNA des s4-1BB-pRc/CMV-Konstruktes (siehe Tabelle 2) wurde ebenfalls endotoxinfrei präpariert und wie oben beschrieben mit ExGen 500 (Fermentas) in HEK-293 Zellen transfiziert. Die Antibiotikaselektion mit G418 erfolgte ebenfalls wie oben beschrieben. Die Überprüfung der Klone erfolgte über Western Blots an Zelllysaten und Zellkulturüberständen.

2.2.4 Transiente Transfektion von Makrophagen

Mit Hilfe der transienten Transfektionen wurde die Aktivität der Reportergenkonstrukte (siehe 2.2.6) in RAW264.7 und 4-1BB-knock-down Makrophagen getestet. 1,5 x 10⁵ RAW264.7 Zellen wurden in 1 ml Vollmedium in 24-well-Platten ausgesät und über Nacht zum Erreichen einer 80 %-igen Konfluenz inkubiert. Die benötigte Plasmid DNA wurde endotoxinfrei präpariert. Es wurden pro well 100 ng Renilla-Kontrollplasmid mit 1 µg des entsprechenden Reportergenkonstruktes und 3,3 µl ExGen 500 eingesetzt. Nach einer Inkubation von 24 h bei 37°C wurde das Medium gegen das entsprechende Infektionsmedium gewechselt. Nach weiteren 24 h Inkubationszeit erfolgte die Zellernte wie unter 2.2.7 beschrieben.

2.2.5 Molekularbiologische Arbeiten

2.2.5.1 RNA-Präparation

Die Gesamt-RNA (gRNA) der Makrophagen wurde unter Verwendung des RNeasy^® Mini Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben gewonnen. Dazu wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in RLT-Puffer mit 1 % [v/v]

β-Mercaptoethanol abgeschabt. Die Zelllysate wurden anschließend mit einer 19 G Kanüle zehnmal homogenisiert und nach Angaben des Herstellers weiterverarbeitet, inklusive einem 15-minütigem DNase Verdau mit Hilfe des RNase-free DNase Kits (Qiagen). Am Ende der Präparation wurde die gRNA mit RNase-freiem Wasser eluiert.

2.2.5.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA

Die Ermittlung der Konzentration und Reinheit von DNA und RNA erfolgte spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm. Die Messung der Proben erfolgte in einer Mikroquarzküvette gegen H2O als Standard.

2.2.5.3 Microarray-Experiment

Die Experimente mit dem Microarray 313 wurden in Zusammenarbeit mit dem Z02- Projekt des SFB566 an der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.

Eingesetzt wurden jeweils 5 µg gRNA der zu untersuchenden Probe.

2.2.5.4 RNA Ligase Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends (RLM-RACE) Die RLM-RACE wurde mit dem GeneRacer^TM Kit (Invitrogen) durchgeführt, um die Promotorregion des 4-1BB-Gens in RAW264.7 Makrophagen zu charakterisieren.

Durch die Methode konnten vollständige 5’-Transkripte gewonnen werden. Die Methode wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Ausgehend von 2,5 - 5 µg gRNA wurde zunächst nicht durch ein Cap geschützte RNA dephosphoryliert. In einem nächsten Schritt wurde das Cap intakter mRNA entfernt und ein Oligonukleotid (GeneRacer^TMRNA Oligo) bekannter Sequenz an das 5’-Ende ligiert, anschließend erfolgte die reverse Transkription in cDNA mit der SuperScript™ III Reverse Transcriptase und random primers (Promega). Die cDNA wurde für eine erste PCR mit den Primern 19 + 21 (Tabelle 5) und 2,5 U Taq DNA Polymerase durchgeführt, wobei die Amplifikation in einem 50 µl Reaktionsansatz unter folgenden PCR Bedingungen erfolgte: initiale Denaturierung für 2 min bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen bestehend aus 0,5 min bei 94°C und 1 min bei 72°C, weiteren 5 Zyklen bestehend aus 0,5 min bei 94°C und 1 min bei 70°C, gefolgt von 25 Zyklen bestehend aus 0,5 min bei 94°C, 0,5 min bei 60°C und 1 min bei 72°C sowie ein abschließender finaler Kettenverlängerungsschritt von 10 min bei 72°C. Das PCR- Produkt wurde 1:100 verdünnt in einem 50 µl Reaktionsansatz mit 2,5 U Taq DNA Polymerase in einer nested-PCR (Primer 20 + 21, Tabelle 5) eingesetzt. Die PCR Bedingungen waren: initiale Denaturierung für 2 min bei 94°C, gefolgt von 25 Zyklen bestehend aus 0,5 min bei 94°C, 0,5 min bei 65°C und 2 min bei 68°C. Ein finaler Kettenverlängerungsschritt von 10 min bei 68°C beendete die PCR. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden anschließend sequenziert.

2.2.5.5 Northern Blot

• Gelelektrophorese von RNA

Die Gelelektrophorese von glyoxaldenaturierter RNA erfolgte nach der Methode von SAMBROOK et al. (SAMBROOK et al. 2001). Es wurden 15 µg gRNA mit dem fünffachen Volumen an Glyoxalreaktionsmix¹⁵ gemischt, bei 55°C für 1 h denaturiert, auf Eis gekühlt (10 min), anzentrifugiert und mit 1/6-tel Volumen an Ladepuffer¹⁶ versetzt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte über ein 1,5 %-iges Agarosegel (QA-Agarose™ Low EEO, Qbiogene) in 1 x BTPE-Puffer¹⁷ bei 50 V (1 h) und 75 V (2 h). Zur Dokumentation wurde das Gel bei UV-Belichtung unter Berücksichtigung der beiden ribosomalen RNA Fragmente von 1,9 kb (18S rRNA) und 4,7 kb (28S rRNA) analysiert und auf eine Nylonmembran transferiert.

• Northern Blot

Um die RNA für die weitere Untersuchung zu fixieren, wurde die RNA durch einen Kapillarblot nach SOUTHERN (SOUTHERN 1975) mit 20 x SSC¹⁸ für 12-16 h auf eine Nylonmembran transferiert und per UV-Licht immobilisiert.

• Herstellen radioaktiv-markierter Sonden

Zur vergleichenden Untersuchung der 4-1BB-Expression der RAW264.7 Makrophagen und der 4-1BB-knock-down Zelllinie wurde eine radioaktiv markierte 4-1BB-cDNA-Sonde erstellt. Dabei wurde mittels PCR ein Intron überspannendes Fragment des 4-1BB Gens amplifiziert und über ein Agarosegel aufgereinigt. Die radioaktive Markierung erfolgte durch eine Nick Translation. Dazu wurden 100 ng PCR-Produkt in einem Volumen von 50 µl mit 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP, 50 µCi [α-³²P] dCTP, 0,1 M β-Mercaptoethanol, 50 mM MgCl2, 0,5 M Tris-HCl und 2,5 U DNA Polymerase I und 2 mU DNase I gemischt und bei 15°C für 90 min inkubiert. Zur Abtrennung der freien Nukleotide wurde der Ansatz über eine

15 1,2 M Glyoxal; 60 % [v/v] DMSO; 0,2 mg/ml Ethidiumbromid, 1,2 x BTPE; 4,8 % [v/v] Glyzerol

16 50 % [v/v] Glyzerol; 0,4 % [w/v] Bromphenolblau

17 10 x BTPE: 10 mM PIPES; 30 mM Bis-Tris; 0,1 M EDTA, pH 8,0

18 3 M NaCl; 0,3 M Natriumacetat

Sephadex G 50 Säule aufgereinigt. Hierzu wurde die Säule zunächst mit 3 ml TE¹⁹ äquilibriert, anschließend die radioaktive Probe aufgetragen und danach mit 400 µl TE gewaschen. Die Elution der Probe erfolgte mit 450 µl TE. Zur Bestimmung der Radioaktivität wurden 2 µl Probe im Scintillationszähler gemessen und die Sonde bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Die Konstruktion der GAPDH-Sonde ist in der Dissertation von SOMMER beschrieben (SOMMER 2005).

• Northern Hybridisierung

Die Membran wurde mit der RNA-Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche überführt und anschließend in einem Volumen von 15 ml Hybridisierungspuffer²⁰ bei 65°C für 2 h im Hybridisierungsofen prähybridisiert. Die radioaktiv markierte Sonde wurde auf 2-3 Mio cpm/ml eingestellt. Zusammen mit 0,5 mg yeast-tRNA und 0,25 mg salmon sperm DNA wurde die Sonde für 10 min bei 95°C denaturiert, anschließend 5 min auf Eis gestellt und es wurden 5 ml frischer Hybridisierungspuffer zugesetzt. Der Prähybridisierungspuffer wurde verworfen und die Hybridisierung mit der Sonde erfolgte bei 65°C über Nacht im Hybridisierungsofen. Nach erfolgter Hybridisierung wurde der radioaktive Puffer abgegossen. Um unspezifisch gebundene Sonde von der Nylonmembran zu entfernen, wurde die Membran einmal mit 50 ml Waschlösung A²¹ und dreimal mit 50 ml Waschlösung B²² für 15 min bei 65°C im Hybridisierungsofen gewaschen. Danach wurde die Membran in Frischhaltefolie eingeschlagen. Die Darstellung der hybridisierten Banden erfolgte durch Autoradiographie auf einen Röntgenfilm mit Verstärkerfolie bei -80°C.

• Entfernen der radioaktiven Sonden von der Nylonmembran

Zur Wiederverwendung des Northern Blots wurde die Nylonmembran zweimal mit 0,1 % [w/v] SDS für 5 min bei 100°C von der gebundenen Radioaktivität

19 10 mM Tris HCl pH7,4; 1mM EDTA pH 8,0

freigewaschen. Nach dem Trocknen stand die Nylonmembran einer erneuten Hybridisierung zur Verfügung.

2.2.5.6 cDNA-Synthese

Für die cDNA-Synthese wurden zunächst 2 µg gRNA in einem Volumen von 12,5 µl mit 100 pmol poly-d(T)12-18 (Roth, Karlsruhe) für 10 min bei 70°C erhitzt und auf Eis abgekühlt. Anschließend erfolgte die reverse Transkription mit 100 U M-MLV reverser Transkriptase (Promega) nach Herstellerangaben in einem Volumen von 20 µl bei 42°C für 1 h. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 80°C für 5 min und Zugabe von H2O ad 200 µl beendet. Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.

2.2.5.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Für die Amplifikation spezifischer Sequenzen mittels PCR wurden 5 µl der verdünnten cDNA oder 1 µg genomischer DNA in einem 50 µl Reaktionsansatz mit 2,5 U Taq DNA Polymerase, 0,4 µM sense und antisense Primer (siehe Tabelle 3 und Tabelle 5), 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2 in 1 x PCR-Puffer gemischt. In einigen Fällen war die Zugabe von final 3 % [v/v] DMSO erforderlich. Im Thermocycler wurden die Proben bei 94°C für 3 min denaturiert. Es folgten 20 bis 40 Zyklen bestehend aus 94°C für 45 s, 60°C für 0,5 min und 72°C für 1,5 min. Ein finaler Kettenverlängerungsschritt bei 72°C für 10 min beendete die Amplifikation bevor die Proben auf 8°C abgekühlt wurden. Im Agarosegel wurde die Produktgröße kontrolliert.

2.2.5.8 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

Die Quantifizierung von RNA Transkripten erfolgte mittels qRT-PCR. Bei dieser Methode wird nach jeder Amplifikation die Menge an DNA in der Probe gemessen.

Bei der hier verwendeten Sybr-Green-Methode interkaliert der Farbstoff Sybr-Green in die doppelsträngige DNA. Nach einer Anregung emittiert der interkalierte Farbstoff eine vielfach höhere Fluoreszenzintensität als das freie Sybr-Green. Das nach jedem Zyklus gemessene Fluoreszenzsignal ist proportional zum gebildeten Amplifikat.

In einem 20 µl Reaktionsansatz wurden 2,5 µl cDNA mit 0,2 µM sense und antisense Primer (siehe Tabelle 3 und Tabelle 5) und 10 µl 2 x Sybr-Green PCR Mastermix

versetzt und im Thermocycler mit folgendem Programm amplifiziert: eine Denaturierung bei 95°C für 10 min und 40 Zyklen bestehend aus 95°C für 20 s, 58°C für 0,5 min und 72°C für 20 s. Die Spezifizierung des Amplifikates erfolgte durch eine anschließende Schmelzkurvenanalyse. Die Fluoreszenzdaten des spezifischen Gens wurden mit den Fluoreszenzdaten des rps9 Gens normalisiert. Als Kalibrator zur Bestimmung der relativen Quantitäten wurden die unstimulierten RAW264.7 Makrophagen definiert. Die Bestimmung der Expressionsunterschiede erfolgte über die sog. 2^-ΔΔCt-Methode nach LIVAK et al. (LIVAK und SCHMITTGEN 2001), bei der für jede untersuchte Probe im ersten Schritt der Ct-Wert des Referenzgens rps9 vom Ct-Wert des zu untersuchenden Gens subtrahiert wurde (ΔCt = CtZielgen – Ctrps9).

Nach dieser Normierung wurde vom ermittelten ΔCt-Wert der stimulierten Proben der ΔCt-Wert der Kontrollgruppe subtrahiert (ΔCt = CtZielgen, Zeit x - CtZielgen, Kalibrator); woraus sich insgesamt der sog. „delta-delta CT“ –Wert (ΔΔCt) ergab. Der relative Expressionsunterschied einer Probe zwischen der Behandlung und der Kontrolle, normalisiert zum Referenzgen und bezogen auf eine Standardprobe, ergibt sich aus der arithmetischen Formel 2^–ΔΔCt.

2.2.5.9 Agarose-Gelelektrophorese

PCR-Amplifikate wurden mittels 1 %-iger Agarosegele separiert. Als Standardlaufpuffer für die Gele wurde 1 x TBE-Laufpuffer eingesetzt. Die Agarose wurde im Laufpuffer gelöst und mit 25 ng Ethidiumbromid/ml Laufpuffer versetzt.

Zum Beschweren wurde die DNA vor dem Auftragen mit Ladepuffer²³ versetzt. Als DNA-Marker wurde der 100 bp DNA Ladder (Invitrogen) aufgetragen. Der Gellauf erfolgte in einer 11-14 Horizon Kammer bei einer angelegten Spannung zwischen 60-100 V. Bei präparativen Gelen wurden die zu isolierenden DNA-Banden mit einem Skalpell ausgeschnitten.

• Elution von DNA aus Agarosegelen

Die Elution von DNA aus den Agarose-Gelen erfolgte durch das GenElute^™ Gel

2.2.5.10 Restriktionsenzymverdau

Für den Restriktionsenzymverdau der Plasmid-DNA oder der PCR-Fragmente wurden in dieser Arbeit ausschließlich Typ II Restriktionsendonukleasen von New England Biolabs (NEB) nach Empfehlungen des Herstellers verwendet. Restriktionen wurden in 25 µl Ansätzen durchgeführt, wobei für die Restriktion von 1 µg DNA 1 U Enzym eingesetzt wurde. Mitgelieferte und empfohlene Puffer wurden nach Bedarf zusätzlich mit 10 x BSA versetzt.

• Aufreinigung der DNA

Um die DNA von beigefügten Enzymen zu reinigen, wurde das QIAquick™ PCR Purification Kit (Sigma) nach Herstellerangaben verwendet.

2.2.5.11 Ligation

Bei der Ligation wurden 500 ng Vektor-DNA zusammen mit der Insert-DNA (in einem Verhältnis von 1:3), 1 µl 10 x Ligasepuffer und 0,3 U T4-DNA-Ligase (Promega) in einem finalen Volumen von 10 µl über Nacht bei 16°C inkubiert.

2.2.5.12 Transformation kompetenter E. coli

Die Transformation des Ligationsansatzes oder von Plasmid-DNA erfolgte durch die Hitzeschock Methode. Dazu wurden 100 µl der kompetenten E.coli Zellen auf Eis aufgetaut, 2,5 µl der entsprechenden Ansätze hinzugefügt und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 45 s mit sofortiger Inkubation für 2 min auf Eis. Nach der Zugabe von 400 µl LB-Medium wurden die Zellen für 1 h bei 37°C unter Rotation inkubiert. Danach wurden 200 µl des Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin-Zusatz ausplattiert. Positive Transformanden waren nach 16-24 h Bebrütung als Kolonien sichtbar. Aus den positiven Transformanden wurde die Plasmid-DNA isoliert und durch einen Restriktionsverdau kontrolliert.

2.2.5.13 Minipräparation von Plasmid-DNA

Die entsprechenden E. coli DH5α-Transformanden wurden in 5 ml LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin) angeimpft und über Nacht im Schüttelinkubator bei 120 Umin^-1 und 37°C inkubiert. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte aus 2 ml der Kultur unter