Marine Mikrobiologie II

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VL Mikrobielle Ökologie: Standorte und Prozesse, 25.11.2003

Welche Leistungen sind nachweisbar?

• Aktivitäten

• Wachstumsraten

• Wodurch sind die Aktivitäten und Wachstum limitiert?

• Wie mißt man die Leistungen?

Welche Arten dominieren das Ökosystem?

• Größenklassen, Arten

• Wie analysiert man die Populationen?

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Größenklassen von Mikroben im Meerwasser Mesoplankton 0.2 - 20 mm

Microplankton 20 - 200 µm Nanoplankton 2 - 20 µm Picoplankton 0.2 - 2 µm Femtoplankton 0.02 - 0.2 µm

Bakterioplankton

Bakterien meist 0.03 bis 0.4 µm klein Die wichtigsten Gruppen:

Phytoplankton Diatomeen Dinoflagellaten Mikroflagellaten Cyanobakterien

Zooplankton

heterotrophe Nanoflagellaten Copepoden

Wie analysiert man die Populationen?

Phytoplankton (> Picopl.) im Mikroskop (Morphologie, Autofluoreszenz) Pigmente (Satelitenbilder, HPLC, Flowcytometrie)

Bakterien: Kultivierung (MPN), Molekularbiologie (FISH, DGGE)

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Verteilung von Chlorophyll im Ozean

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20 m

80 m

150 m

Wind UV

NO3 PO4 Fe

Thermocline

Prochlorococcus

Picoeucaryoten Viren

Mikrozooplankton

Oberfläche Bakterien

Synechococcus

Abbildungen: Station Biologique de Roscoff CNRS and Université Pierre et Marie Curie, France

10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴

FL3-Height 100101102103104

SSC-Height

Prochlorococcus Synechococcus

Picoeucaryotes

Chlorophyll

Flowcytometrie

Analyse von Bakteriengemeinschaften

A

H G F E D C

1

B

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kontrolle Parallele 1 Parallele 2 Parallele 3

MPN-Methode

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Kultivierung:

Anreicherung

Ilsolierung

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Welche Aktivitäten zeigen Mikroorganismen?

Phytoplankton:

Produktion im Mittel 68.7 g C_orgm²a ^-1

(etwa 1 Tafel Schokolade) Zooplankton:

Freßraten von Flagellaten: 5 - 300 Bakterien h^-1 Bakterien:

Ekto-, Exoenzyme, zersetzen Detrituspartikel und Polymere Merke: Bakterien haben keine Zähne!

ingestierte Partikel werden stets osmotroph aufgenommen das ganze Gewässer dient als Nahrungsvakuole der Bakterien Effektive Aufnahme von N, P, Fe

Bakterien

Verdopplungszeit von 1 - 20 d

Wodurch sind die Aktivitäen und Wachstum limitiert?

Nicht grundsätzlich durch Licht, Temperatur, CO₂ Meist durch Nährstoffe: Fe > N > P > (Mn) (Si) Welche Wachstumsraten zeigen Mikroorganismen?

Phytoplankton

abhängig von Jahreszeit, N, P Fe, Licht etc. (Temp.?)

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Wie mißt man die Aktivitäten, Probleme???

System ist im Fließgleichgewicht (Es tut sich fast nichts) Erhebliche Veränderung der Situation durch:

Div. Kontrollen Substratzusatz

Ausschluß von Größenklassen oder Licht etc.

=> Tracer in Spurenkonzentrationen am besten geeignet

Wie mißt man die Aktivitäten?

Messung von Primäproduktion:

14CO₂-Fixierung im Licht (minus Dunkelkontrolle) O₂-Freisetzung (minus Dunkelkontrolle)

Messung von Bakterienwachstum:

3H-Thymidin-Aufnahme (1/4 der DNA)

Einbau von markierten Aminosäuren (Leucin)

35S-SO₄^2-Assimilation ATP-Zunahme

Messung von mikrobiellen Abbauvorgängen:

CO₂-Freisetzung O₂-Aufnahme

Umsatz von Modellsubstraten

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Molekularbiologische Analyse von Bakteriengemeinschaften

V2 V1 V3

V5 V6

V7

V8

V9 5’

3’

Yves VandePeer (1996), modifiziert

hoch variabel absolut konserviert

E. coli, aber nicht in > 75% aller Bakterien

Die prokaryontisch 16S rRNA - in allen lebenden Organismen vorhanden - hohe Kopienzahl

- ausreichend lang (16S rDNA: ca. 1.500 bp),

- Mutation hat oft letale Wirkung

- von Umweltbedingungen unabhängiger (konstanter) Selektionsdruck

- Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert - Vergleich analoger, variablerer Sequenzabschnitte

Die Evolution des Moleküls spiegelt die ihrer Träger wider („molekulare Uhr“)

Analyse von Bakteriengemeinschaften (TGGE / DGGE)

- +

Elektrophorese

T 1

T 2

∆T [°C]

[cm]

Linearer thermischer Gradient Aufbau TGGE

Molekularbiologie:

Doppelstrang

Einzelstränge Teilweise geschmolzen

+ - 30 %

70 %

PCR-Produkt

Trennprinzip DGGE / TGGE

Denaturierender Gradient parallel zur Elektrophoreserichtung

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Temperatur-Gradient

Schematischer Verlauf einer TGGE

Bakterien Reinkulturen

Bakterien Gemeinschaften

Elektrophorese

+ -

Umwelt-Probe

Extraktion

PCR

16S rDNA / rRNA der Bakteriengemeinschaft

Nukleinsäuren DNA / RNA

DGGE

Fingerprints der Bakterien- gemeinschaft

rT-PCR

TGGE

Clusteranalyse

Bildanalyse

Digitalisierung

Sequenzierung

16S rDNA/rRNA Sequenzen

Phylogenetische Zuordnung

„Fingerprinting“ von Bakteriengemeinschaften