ISBN 978-3-86345-151-6
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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Sonja Christina Bröer Hannover
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-151-6
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Fokale Substanzapplikation und Neurotransplantation zur Therapie pharmakoresistenter Epilepsien
These
zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY - PhD-
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Sonja Christina Bröer
Bremen
Hannover 2013
1. Gutachten: Professor Dr. Wolfgang Löscher
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Professor Dr. Gerd Bicker Institut für Tierökologie und Zellbiologie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Professor Dr. Konstantin Wewetzer Institut für Funktionelle und Angewandte Neuroanatomie
Medizinische Hochschule Hannover
2. Gutachten: Professorin Dr. Angelika Richter
Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie
Veterinärmedizinische Fakultät Leipzig
Tag der mündlichen Prüfung: 12. April 2013
unterstützt durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes e.V.
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, L. GEY, M. GERNERT und W. LÖSCHER (2012).
Vigabatrin for focal drug delivery in epilepsy: bilateral microinfusion into the subthalamic nucleus is more effective than intranigral or systemic administration in a rat seizure model.
Neurobiol Dis 46: 362-76.
Für weitere Veröffentlichungen und Kongressbeiträge s. Publikationsverzeichnis (Ab- schnitt 11).
Die Arbeit wurde im Rahmen des PhD-Studiengangs „Systems Neuroscience“ des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften Hannover angefertigt und Teile der Arbeit gehören zu Teilprojekt 5 der DFG-Forschergruppe „Neurodegeneration und -regeneration bei ZNS- Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).
für meine Eltern
I
2. Stand der Forschung ... 11
2.1. Epilepsie ... 11
2.1.1. Definition und Bedeutung ... 11
2.1.2. Alternative Therapien ... 12
2.1.3. Tiermodelle ... 13
2.2. Zielregionen für fokale Therapie ... 14
2.2.1. Basalganglien - Anatomie und Physiologie ... 14
2.2.2. Das nigrale inhibitorische System ... 16
2.2.3. Der Hippokampus – Anatomie und Physiologie ... 17
2.3. Studie I: Fokale Substanzapplikation ... 19
2.3.1. Substanzen für fokale Therapie ... 19
2.3.2. Fokale Substanzapplikation in Basalganglienregionen ... 21
2.3.3. Fokale Substanzapplikation in den Hippokampus ... 24
2.4. Studie II: Neurotransplantation ... 26
2.4.1. Zelltransplantation bei Epilepsie ... 26
2.4.2. Neurotransplantation in den Hippokampus ... 27
2.4.3. Neurotransplantation in Basalganglienregionen ... 28
2.4.4. Zellen für die Neurotransplantation ... 29
3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen ... 35
3.1. Studie I: Fokale Substanzapplikation ... 35
3.2. Studie II: Neurotransplantation ... 36
4. Material und Methoden ... 39
4.1. Tiere ... 39
4.2. Akutes Anfallsmodell ... 41
4.2.1. Ablauf des PTZ-Tests ... 42
4.2.2. Vorabstudie: Einfluss unterschiedlicher Anästhetika auf die Anfallsschwelle .. 43
4.2.3. Einfluss des Zyklusstadiums auf die PTZ-Anfallsschwelle ... 43
II
4.3.3. Fokale Applikation von Vigabatrin ... 45
4.3.4. Verhaltensbeobachtung auf Nebenwirkungen ... 49
4.3.5. Fokale Vigabatrin-Applikation nach Status epileptikus ... 49
4.4. Studie Ib: Fokale Applikation von Botulinumtoxin ... 50
4.4.1. PTZ-Anfallsschwellen ... 50
4.4.2. Botulinumtoxin ... 51
4.4.3. Convection-enhanced delivery ... 51
4.4.4. Fokale Applikation von Botulinumtoxin B ... 52
4.4.5. Verhaltensversuche ... 55
4.4.6. Aufzeichnung des Elektroenzephalogramms (EEG) ... 56
4.5. Studie II: Neurotransplantation ... 57
4.5.1. PTZ-Anfallsschwellen ... 57
4.5.2. Studie IIa: Gewinnung und Kultivierung von GABAergen Vorläuferzellen ... 57
4.5.3. Studie IIb: Kultivierung von NT2-Zellen ... 62
4.5.4. Zelltransplantation ... 63
4.5.5. Ablauf der Zelltransplantation ... 64
4.5.6. Nachfolgestudie zu Studie IIa: Vorbehandlung der Zellen ... 66
4.5.7. In-vitro Studie ... 67
4.5.8. In-vivo Studie ... 68
4.6. Histologie... 68
4.7. Dekapitation... 69
4.7.1. Botulinumtoxin ... 69
4.7.2. Neurotransplantation ... 70
4.8. Mikroskopie ... 70
4.9. Immunhistologie ... 71
4.9.1. GABAerge Vorläuferzellen ... 71
4.9.2. NT2-Zellen ... 73
4.9.3. Konfokale Mikroskopie ... 74
III
5. Ergebnisse ... 76
5.1. Vorab-Studie: Einfluss des Anästhetikums auf die PTZ-Schwelle ... 76
5.2. Einfluss des Zyklusstadiums auf die Anfallsschwellen ... 77
5.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin ... 77
5.3.1. Auswirkungen von Vigabatrin auf die PTZ-Anfallsschwelle ... 77
5.3.2. Nebenwirkungen ... 90
5.3.3. Spezifität der Zielregionen bei fokaler Applikation ... 93
5.3.4. Akute fokale Applikation von Vigabatrin nach Status epileptikus ... 95
5.4. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B ... 97
5.4.1. Schwellenänderungen nach Botulinumtoxin B ... 97
5.4.2. Nebenwirkungen ... 99
5.4.3. Verhaltenstests ... 100
5.4.4. EEG-Aufnahmen ... 101
5.5. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen ... 104
5.5.1. Gewinnung, Kultivierung und Transplantation ... 104
5.5.2. Tiergruppen ... 104
5.5.3. Schwellenmessungen nach Transplantation ... 105
5.5.4. Verhaltensbeobachtung nach Transplantation ... 107
5.5.5. Histologie ... 107
5.5.6. Immunhistologie ... 109
5.5.7. Transplantation nach Status epileptikus ... 113
5.5.8. Nachfolgestudie: Vorbehandlung der GABAergen Vorläuferzellen ... 115
5.6. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen ... 119
5.6.1. Schwellenmessungen nach Transplantation von NT2-Zellen ... 119
5.6.2. Verhaltensbeobachtungen ... 121
5.6.3. Histologie ... 122
5.6.4. Immunhistologie ... 123
6. Diskussion ... 124
6.1. Studie Ia: Fokale Substanzapplikation von Vigabatrin ... 124
IV
6.1.4. Gewähltes Anfallsmodell ... 130
6.1.5. Vor- und Nachteile fokaler gegenüber systemischer Therapie ... 132
6.2. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B ... 134
6.2.1. Gewählte Zielregion ... 134
6.2.2. Gewähltes Anfallsmodell ... 136
6.2.3. Gewählte Dosierung und Infusion ... 136
6.2.4. Convection-enhanced delivery ... 137
6.2.5. Die gewählte Substanz ... 138
6.2.6. Verhaltensänderungen und epileptische Anfälle /EEG-Veränderungen ... 139
6.3. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen ... 141
6.3.1. Transplantation von GABAergen Zelllinien in Basalganglienregionen ... 141
6.3.2. Transplantation GABAerger Vorläuferzellen ... 142
6.3.3. Wahl der Zielregion für die Transplantation ... 143
6.3.4. Herkunft der transplantierten Zellen ... 145
6.3.5. Überleben der transplantierten Zellen ... 146
6.3.6. Differenzierung der transplantierten Zellen ... 147
6.4. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen ... 149
6.4.1. Transplantation von NT2-Zellen bei Epilepsien ... 149
6.4.2. Transplantation von NT2-Zellen in experimentellen Tiermodellen ... 150
6.5. Probleme der Zelltransplantation und ihrer Translation ... 152
6.6. Ausblick fokale Therapien ... 154
7. Zusammenfassung ... 156
8. Summary ... 158
9. Literaturverzeichnis ... 160
10. Anhang ... 197
10.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 197
10.2. Medien für die Zellkultur ... 201
V
10.4.2. Perfusion ... 203
10.4.3. Zellkultur ... 204
10.4.4. Histologie... 204
10.4.5. Immunhistologie ... 205
10.5. Färbeprotokolle ... 206
10.5.1. Histologische Färbungen ... 206
10.5.2. Immunhistologische Färbungen ... 207
11. Publikationen ... 210
12. Danksagung ... 213
VI
Abb. Abbildung
ac anteriore Kommissur
ANOVA „Analysis of Variance“; Varianzanalyse
Aqua dest. destilliertes Wasser
aSNr anteriore Substantia nigra pars reticulata
BHS Blut-Hirn-Schranke
BSA bovines Serumalbumin
BTX Botulinumtoxin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CED „convection-enhanced delivery“
CM Creatinmonohydrat
cm2 Quadratzentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
cp zerebraler Pedunkel
Cy2/ Cy3 Carbocyanin 2/ Carbocyanin 3
DAB 3,3’-Diaminobenzidin
d.h. das heißt
EEG Elektroenzephalogramm
EPN entopedunkulärer Nukleus
g Gramm
GABA Gamma-Aminobuttersäure
GAD Glutaminsäuredecarboxylase
GFAP „Glial Fibrillary Acidic Protein“
ic interne Kapsel
i.d.R in der Regel
KCl Kaliumchlorid
kg Kilogramm
LGE laterale ganglionische Eminenz
M molar
mA Milliampere
VII
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mM millimolar
ms Millisekunde
NaCl Natriumchlorid
NT2 Ntera-2
NT2/29 NT2-Zellen, die eine Woche geprimt wurden
NT2/31 NT2-Zellen, die einen Tag geprimt wurden
O2 Sauerstoff
OP Operation
PBS Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung
PLH pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus
pSNr posteriore Substantia nigra pars reticulata
PTZ Pentylentetrazol
RA Retinsäure
s. siehe
sek Sekunde
SEM Standardfehler des Mittelwerts
SNr Substantia nigra pars reticulata
STN subthalamischer Nukleus
Tab. Tabelle
TBS tris-gepufferte Saline
VPA Valproat
VPM ventraler posteromedialer thalamischer Nukleus
VGB Vigabatrin
z.B. zum Beispiel
ZID dorsaler Teil der Zona incerta
ZIV ventraler Teil der Zona incerta
µl Mikroliter
µM mikromolar
VIII
9
1. E INLEITUNG
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit neuen Therapieansätzen für Epilepsien, den häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems bei Mensch, Hund und Katze (LÖSCHER 1994; THOMAS 2010). Epilepsien sind durch spontan auftretende, wiederkehrende Anfälle zentralen Ursprungs charakterisiert. Üblicherweise werden Epilepsie- patienten lebenslang mit sogenannten Antiepileptika behandelt. Dieser Begriff ist nicht ganz korrekt, da diese Medikamente Anfälle zwar symptomatisch unterdrücken, aber nicht ursäch- lich verhindern können. Nachteile einer Dauermedikation sind Nebenwirkungen wie Müdig- keit, Konzentrationsschwierigkeiten, Übelkeit, ein eingeschränktes Sehvermögen oder Haut- veränderungen (CRAMER 2012). Trotz intensiver Forschung werden unter Therapie mit mo- dernsten Antiepileptika etwa 30 % der Patienten nicht anfallsfrei; bei ihnen treten weiterhin unkontrollierbare schwere Anfälle auf (SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; ROGAWSKI u.
HOLMES 2009; SHORVON 2009; BRODIE 2010; LÖSCHER u. SCHMIDT 2011). Sie wer- den als pharmakoresistent eingestuft. Bei der häufigsten Epilepsieform des Menschen, der Temporallappenepilepsie, liegt der Anteil pharmakoresistenter Patienten etwa bei 60-70 % (LEPPIK 1992). Bei Hunden werden etwa 70 % der an Epilepsie leidenden Tiere nicht anfallsfrei (SCHWARTZ-PORSCHE et al. 1985; RIECK 2002; RIECK et al. 2006). Neuere Therapieansätze untersuchen Alternativen zur Dauermedikation mit Antiepileptika: Vielver- sprechend ist die fokale, gerichtete Behandlung, bei der das Therapeutikum direkt auf die Hirnregionen beschränkt wird, die bei der Anfallsentstehung oder -weiterleitung eine tragende Rolle spielen. Neben dem epileptischen Fokus, aus dem die Anfallsaktivität hervorgeht, stellen vor allem die Basalganglien Schlüsselregionen bei der Anfallsweiterleitung und - modulation dar (GALE 1988; GALE et al. 2008). Wichtige Neurotransmitter sind hier u.a. die inhibitorisch wirkende Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und der exzitatorische Transmitter Glutamat. Daher habe ich in meiner Arbeit zwei unterschiedliche therapeutische Strategien verfolgt, denen gemeinsam ist, dass durch die vermehrte Freisetzung von GABA das bei Epi- lepsie bestehende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender Neurotransmission (BOUILLERET et al. 2000; SCHARFMAN 2007) ausgeglichen werden soll. In beiden Stu- dien wurde eine sehr selektiv auf das GABAerge System wirkende therapeutische Interven- tion mit einer weniger spezifischen verglichen: In der ersten Strategie haben wir die Effekti-
10
vität einer intrazerebralen Applikation von Vigabatrin mit der bisher üblichen systemischen Administration dieses Antiepileptikums verglichen (Studie Ia). Die fokale Applikation er- folgte hierbei in Basalganglienregionen, genauer in die Substantia nigra pars reticulata und den subthalamischen Nukleus. Vigabatrin verhindert irreversibel den Abbau von GABA, mit der Konsequenz, dass die GABA-Konzentration im Gehirn steigt (SCHECHTER 1989; BEN- MENACHEM et al. 1993; LÖSCHER u. HÖRSTERMANN 1994; PETROFF et al. 1996).
Vergleichend hierzu haben wir in Studie Ib fokusnah Botulinumtoxin injiziert, welches weniger selektiv wirkt und durch eine Inhibition der Neurotransmission an der präsynap- tischen Membran die Ausschüttung verschiedener Transmitter, u.a. Glutamat, hemmt (MCMAHON et al. 1992). COSTANTIN und Kollegen (2005) konnten zeigen, dass durch die Hemmung glutamaterger Neurone ebenfalls epileptische Anfallsaktivität inhibiert werden kann.
In einem zweiten therapeutischen Ansatz haben wir neuronale GABAerge Vorläuferzellen aus der Ratte in die genannten Hirnregionen transplantiert (Studie IIa). Analog der fokalen Appli- kation von Vigabatrin sollten die Transplantate die intrazerebrale GABA-Konzentration erhö- hen und somit antikonvulsiv wirken. Als Vergleich diente hier die Transplantation von huma- nen NT2-Vorläuferzellen und ausdifferenzierten NT2-Neuronen (Studie IIb). Bei NT2-Zellen handelt es sich um eine Zelllinie, die 1984 aus einem Hodentumor eines Menschen isoliert wurde und die sich in adulte Nervenzellen unterschiedlichen Phänotyps differenzieren lässt, u.a. in GABAerge, cholinerge, serotonerge oder dopaminerge Neurone (ANDREWS et al.
1984; ANDREWS 1984; LEE u. ANDREWS 1986; PLEASURE et al. 1992; PODRYGAJLO et al. 2009).
Ziel dieser Arbeit war es, zu testen, welche der untersuchten Hirnregionen sich am besten für fokale therapeutische Manipulationen eignen, als auch zu evaluieren, ob die fokale Interven- tion der systemischen Administration von Substanzen überlegen ist. Außerdem sollte über- prüft werden, ob eine selektive Manipulation des GABAergen Systems effektiv ist, hierfür dient jeweils der Vergleich mit einem weniger spezifisch wirkenden Eingriff. Zudem sollte geklärt werden, ob mit der Transplantation GABAerger Zellen ein langfristiger antikonvul- siver Effekt zu erzielen ist. In den folgenden Kapiteln referiere ich jeweils getrennt zu diesen beiden Studien als Studie I: Fokale Substanzapplikation und Studie II: Neurotransplantation.
11
2. S TAND DER F ORSCHUNG
2.1. Epilepsie
2.1.1. Definition und Bedeutung
Epilepsien sind durch wiederkehrende, spontane Anfälle zentralen Ursprungs charakterisiert.
Ein epileptischer Anfall ist in der Regel eine vorübergehende Phase abnormaler, übermäßiger oder synchroner Aktivität im Gehirn (FISHER et al. 2005). Diese kann sich je nach Anfalls- fokus im Gehirn und der lokalen oder generalisierten Ausbreitung der Anfallsaktivität im zentralen Nervensystem unterschiedlich darstellen. Eine präzise Klassifizierung des Anfalls- typs, der Ursache, des Alters des Patienten bei Erstauftreten der Anfälle, auslösender Faktoren und elektroenzephalographischer Befunde ist für die erfolgreiche Therapie unerlässlich. Man unterscheidet fokale von generalisierten Anfällen (BERG et al. 2010). Fokale Anfälle treten nur in definierten Hirnregionen auf, während sich bei primär generalisierten Anfällen die epi- leptische Aktivität von Anfang an über beide Hirnhemisphären ausbreitet. Etwa 60 % der neu diagnostizierten Epilepsien sind durch fokale Anfälle charakterisiert, oft kommt es jedoch während eines fokalen Anfalls zu einer sekundären Generalisierung (HAUSER et al. 1993;
BANERJEE u. HAUSER 2008). Man unterscheidet weiterhin einfach-fokale Anfälle mit Er- halt des Bewusstseins von komplex-fokalen Anfällen mit Bewusstseinsbeeinträchtigung. Ein Anfall hat klinisch verschiedene Erscheinungsbilder, neben Krämpfen, die sich als atonisch, myoklonisch, tonisch, klonisch oder tonisch-klonisch darstellen, treten auch sogenannte Absencen auf, bei denen lediglich eine kurze Bewusstseinspause mit anschließender, vorübergehender Amnesie zu beobachten ist (WESTBROOK 2000).
Um die Diagnose Epilepsie bei einem Patienten zu stellen, genügt ein epileptischer Anfall in Kombination mit weiteren Befunden, die auf eine Prädisposition für Epilepsie hinweisen (FISHER et al. 2005). Sowohl beim Menschen als auch beim Hund kommen Epilepsien mit einer Prävalenz von etwa 1 % in der Bevölkerung bzw. der Hundepopulation vor (ENGEL et al. 2003; LÖSCHER 1997). Die Ursachen für epileptische Anfälle können vielfältig sein. Sie reichen von symptomatischen Epilepsien, bei denen die Entstehung der Epilepsie auf eine Grunderkrankung, wie etwa einen Gehirntumor, zurückzuführen ist, über idiopathische Epi- lepsien, bei denen genetische Faktoren als Auslöser der Epilepsie diskutiert werden. Des
12
Weiteren bezeichnet man Epilepsien als kryptogen, wenn weder eine pathologische noch eine genetische Ursache festgestellt werden kann (ENGEL 2006).
2.1.2. Alternative Therapien
In der Regel ist die erste therapeutische Intervention die systemische Einnahme von Anti- epileptika. Wie eingangs erwähnt, ist neben dem Auftreten von Nebenwirkungen die Pharma- koresistenz, die bei mindestens einem Drittel der Patienten auftritt, ein stark limitierender Faktor für den Erfolg der Behandlung (SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; ROGAWSKI u.
HOLMES 2009). Pharmakoresistenz bedeutet, dass der Patient nach Behandlungsversuchen mit zwei verschiedenen Antiepileptika, in Monotherapie oder in Kombination, keine anhaltende Anfallsfreiheit erreicht (KWAN et al. 2010). Mit dem Einsatz moderner Antiepileptika kann bei 10-20 % der zuvor als pharmakoresistent eingestuften Patienten Anfallsfreiheit erreicht werden (LUCIANO u. SHORVON 2007). Trotzdem kann der Mehrheit der pharmakoresistenten Epilepsiepatienten noch nicht mit medikamenteller Therapie geholfen werden. Die Konsequenzen sind schwerwiegend: Beim Hund führt eine pharmakoresistente Epilepsie aufgrund mangelnder Therapiemöglichkeiten häufig zur Euthanasie und damit zu einer verminderten Lebenserwartung (BERENDT et al. 2007). Beim menschlichen Patienten treten neben Einschränkungen im Alltag, wie etwa beim Führen von Kraftfahrzeugen, gehäuft Komorbiditäten wie Depressionen und Angststörungen auf (TELLEZ-ZENTENO et al. 2007). Zusätzlich kommt es bei einem Teil der Patienten zu Ver- haltensauffälligkeiten oder Lern- und Gedächtnisdefiziten (POST 2004). Die Lebenserwar- tung sinkt (RYVLIN u. KAHANE 2003).
Die bislang erfolgreichste Behandlung neben der Pharmakotherapie besteht in der chirurgischen Resektion des Anfallsfokus: Seit 2001 ist durch eine randomisierte Langzeit- studie belegt worden, dass die resektive Chirurgie der rein medikamentösen Therapie überle- gen ist (WIEBE et al. 2001). Hierfür wurden 80 pharmakoresistente Patienten in zwei Grup- pen eingeteilt; eine Gruppe wurde medikamentös behandelt, die anderen Patienten unterzogen sich einer Fokusresektion mit anschließender (geringerer) Einnahme von Antiepileptika. In der Medikamentengruppe erreichten nach einem Jahr lediglich 8 % Anfallsfreiheit gegenüber 58 % in der Operationsgruppe. Zusätzlich stuften die operierten Patienten ihre Lebensqualität signifikant höher ein. Aufgrund der mit diesem schwerwiegenden Eingriff verbundenen Risi-
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ken oder wegen eines multifokalen Ursprungs der epileptischen Anfälle ist allerdings nicht jeder Patient für diese Therapie geeignet (NILSEN u. COCK 2004).
Eine weitere, erst kürzlich zugelassene Option ist die tiefe Hirnstimulation des anterioren Thalamus. Die tiefe Hirnstimulation geeigneter Hirnregionen wird bereits seit Jahren erfolg- reich in der Therapie von Schmerz- und Bewegungsstörungen eingesetzt (NGUYEN et al.
2011; FASANO et al. 2012).
Neben der zentralen Stimulation wird klinisch auch die periphere Stimulation des 10. Hirn- nervs (Nervus vagus) durchgeführt. Diese Behandlungen können bei bis zu 40 % der Patien- ten zu einer deutlichen Senkung der Anfallsfrequenz führen (BOON et al. 2009; NITSCHE u.
PAULUS 2009; FISHER et al. 2010). Die vagale Stimulation führt auch beim pharmakoresis- tenten Hund zu einer Anfallsreduktion um etwa 35 % (MUNANA et al. 2002). Allerdings ist noch relativ wenig zu Risiken einer solchen Behandlung als Dauertherapie bekannt, und es mangelt an verblindeten, groß angelegten klinischen Studien. Ein Problem stellt zum Beispiel die Verblindung bei Vagusstimulation dar, da die Patienten die Impulse wahrnehmen können.
Sowohl die tiefe Hirnstimulation als auch die Stimulation des Nervus vagus sind in ihrer Effektivität gegenüber der konventionellen medikamentösen Therapie nicht überlegen (LÖSCHER 2009b).
Die ketogene Diät, eine sehr fettreiche, kohlenhydratarme Ernährung, die vor allem bei Kin- dern eingesetzt wird, kann etwa bei einem Drittel der Patienten eine bis zu 90 %ige Anfalls- reduktion hervorrufen (KOSSOFF u. RHO 2009). Diese Diät ist allerdings eher als komplementäre denn als alleinige Therapie einsetzbar; sie ist mit viel Verzicht und gesund- heitlichen Risiken verbunden (GROESBECK et al. 2006; ENGEL u. MOSHÉ 2009). Alle weiteren Ansätze, wie etwa die Untersuchung von anderen, effektiveren Applikationsrouten alternativ zur systemischen Gabe von Antiepileptika, Zell- und Gentherapie oder auch hormonelle Intervention befinden sich noch im experimentellen Stadium. In meiner Arbeit habe ich mich mit der fokalen bzw. gerichteten Therapie beschäftigt.
2.1.3. Tiermodelle
Neue therapeutische Ansätze werden u.a. in Versuchstiermodellen getestet, da die komplexe Verschaltung epileptischer Anfallsaktivität und ihre vielfältigen endo- und exogenen Ein- flüsse oft nicht zufriedenstellend in alternativen Systemen wie etwa Zellkulturmodellen nach-
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zubilden sind (RAOL u. BROOKS-KAYAL 2012; STEWART et al. 2012). Die in der Epilepsieforschung verwendeten Tiermodelle lassen sich grob in zwei Hauptgruppen unter- teilen: Zum einen werden schnelle und sehr sensitive Screening-Methoden verwendet, um beispielsweise das antikonvulsive oder prokonvulsive Potential bestimmter Substanzen in der Wirkstoffentwicklung zu testen (LÖSCHER 2011). Diesen Modellen ist gemeinsam, dass epileptische Anfälle i.d.R. akut ausgelöst werden, d.h. die Versuchstiere zeigen keine sponta- nen Anfälle und keine pathologischen Veränderungen des Gehirns (LÖSCHER 1999). An- fälle werden mithilfe systemisch oder fokal verabreichter, prokonvulsiv wirkender Substanzen oder durch elektrische Stimulation ausgelöst. Ein viel verwendetes, akutes Anfallsmodell ist der Pentylentetrazol-Anfallsschwellentest, kurz PTZ-Test (LÖSCHER 2009a; LÖSCHER 2011), der in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde (s. Abschnitt 4.2). Weiterhin sind Mo- delle etabliert, die möglichst genau die klinische Situation des Epilepsiepatienten widerspie- geln sollen. Hierfür ist neben dem Auftreten wiederholter, spontaner Anfälle mit einem Anteil pharmakoresistenter Tiere auch eine Pathologie der beteiligten Hirnregionen ein Kriterium (s. Abschnitt 2.2.3.), um die Translation gewonnener Erkenntnisse im Tiermodell auf den humanen Patienten übertragen zu können (COULTER et al. 2002). Modelle, mit denen dies zum Teil erreicht wird, nutzen einen selbsterhaltenden Status epileptikus als Hirninsult, der elektrisch oder chemisch, mithilfe prokonvulsiver Substanzen, induziert wird und nach einer gewissen Latenzzeit zu spontanen Anfällen führt (LÖSCHER 1997). Bisher steht kein Modell zur Verfügung, das alle Kriterien zufriedenstellend erfüllt (SLOVITER 2008; SLOVITER 2009; RUBIO et al. 2010; LÖSCHER 2011). Für die Überprüfung der Wirksamkeit eines neuen Therapieansatzes, in diesem Fall der fokalen Therapie, ist auch die Determination einer geeigneten Applikationsroute entscheidend. Um fokal therapieren zu können, müssen zu- nächst geeignete Hirnregionen als Zielstrukturen identifiziert werden.
2.2. Zielregionen für fokale Therapie
2.2.1. Basalganglien - Anatomie und Physiologie
Ausgehend vom epileptischen Anfallsfokus spielen zahlreiche weitere Hirnregionen eine Rolle bei der Ausbreitung der Anfallsaktivität bis hin zur sekundären Generalisierung (LÖSCHER u. EBERT 1996). Seit Jahren ist bekannt, dass besonders den Basalganglien hier-
15
bei eine tragende Rolle zukommt (GALE 1988). Die Basalganglien sind unter der Hirnrinde (subkortikal) angelegte Kerngebiete des Vorder- und Mittelhirns. Zu den Basalganglien gehö- ren die Substantia nigra, das Striatum (bestehend aus Nucleus caudatus und Putamen), der Globus pallidus (anatomische Bezeichnung bei der Ratte, beim Menschen als Globus pallidus externus bezeichnet), der entopedunkuläre Nucleus (Ratte, beim Menschen Globus pallidus internus) sowie der subthalamische Nukleus. Diese Regionen sind anatomisch und funktionell untereinander und mit dem limbischen System verbunden (s. Abb. 1). Bei Defekten innerhalb der Basalganglien kann es zu komplexen neuropsychiatrischen Symptomen, kognitiven Ver- änderungen, Verhaltensänderungen und zu hypo- oder hyperkinetischen Bewegungsstörungen kommen. Die bekanntesten motorischen Symptome treten bei Morbus Parkinson und Chorea Huntington auf. Charakteristische, pathologische Änderungen der Motorik sind hier Tremor, Bewegungsarmut, eine gebeugte Körperhaltung und erhöhter Muskeltonus (Parkinson’sche Krankheit), sowie überschießende, unwillkürliche Bewegungen (Huntington) (DELONG 2000). Physiologisch üben die Basalganglien eine Filterfunktion aus, das sogenannte
„Gating“: die Selektion aktuell gewollter Bewegungsmuster und die Inhibition der momentan nicht erwünschten Aktivierungsmuster.
Die Verschaltung der Basalganglien besteht aus parallel verlaufenden Regelschleifen, die vom Kortex über die Basalganglien zum Hirnstamm und Thalamus und vom Thalamus wieder zum Kortex verlaufen. Die Eingangsstruktur der Basalganglien ist das Striatum, welches Eingänge aus verschiedenen Bereichen des Kortex (assoziativ, sensorimotorisch und limbisch), des Thalamus und der Substantia nigra pars compacta (SNc) erhält (DELONG 2000). Aus- gangstrukturen sind die Substantia nigra pars reticulata (SNr) und der entopendunkuläre Nukleus (Ratte, beim Menschen Globus pallidus internus), die über motorische Kerngebiete des Thalamus, den rostralen Colliculus (Mensch: superiorer Colliculus) und den pedun- kulopontinen Nukleus Informationen weiterleiten (BOLAM et al. 2000). Besonders die Substantia nigra ist einer der am besten untersuchten Kerne der Basalganglien und in der Ver- gangenheit sehr gut hinsichtlich ihrer Rolle bei der Weiterleitung und Ausbreitung epilep- tischer Anfallsaktivität untersucht worden (vgl. GALE et al. 2008).
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2.2.2. Das nigrale inhibitorische System
Die Substantia nigra besteht zum einen Teil aus einer Pars compacta (SNc) mit dicht gepack- ten, dopaminergen Neuronen. Diese sind bei Morbus Parkinson degenerativen Prozessen aus- gesetzt und aus diesem Grund Gegenstand intensiver Forschung (DELONG 2000; YUAN et al. 2010). Der zweite Teil ist die Pars reticulata (SNr). Ihr wird bei der Anfallsweiterleitung und -modulation eine „seizure gating function“ zugeschrieben (GALE 1988; GALE et al.
2008).
Die etwa zu 90 % GABAergen Neurone der SNr erhalten Input aus dem Striatum auf zwei Wegen: Eine Hemmung nigraler Neurone wird direkt, monosynaptisch, durch hauptsächlich GABAerge Projektionsneurone des Striatums (medium-sized spiny neurons) erreicht (HATTORI et al. 1973; FONNUM et al. 1978). Eine Aktivierung nigraler Neurone erfolgt dagegen über einen indirekten, polysynaptischen Input über drei Stationen (s. Abb. 1). Hier projizieren die „medium-sized spiny neurons“ des Striatums zum Globus pallidus (externus), von dort über eine GABAerge Projektion zum subthalamischen Nukleus und über eine dritte, glutamaterge Projektion vom subthalamischen Nukleus (STN) zur SNr (ALEXANDER u.
CRUTCHER 1990; ROBLEDO u. FEGER 1990; SHEN u. JOHNSON 2006; DENIAU et al.
2007). Von der SNr aus verlaufen inhibitorische Efferenzen zu verschiedenen Hirnregionen im Hirnstamm und Mittelhirn. Im Falle einer Hemmung dieses „nigralen inhibitorischen Systems“ werden die nachgeschalteten Regionen enthemmt und erhöhen so die Schwelle zur Auslösung eines Anfalls. Ein antikonvulsiver Effekt kann demzufolge neben der direkten Hemmung der SNr ebenso mit einer indirekten Hemmung erreicht werden, wenn ihre exzita- torische Afferenz, der subthalamische Nukleus, gehemmt wird (ROBLEDO u. FEGER 1990;
FEGER u. ROBLEDO 1991). Des Weiteren verlaufen von der SNr reziproke Verbindungen zum limbischen System, so dass rückwirkend auch der Anfallsfokus unabhängig von der ge- nauen Lokalisation der Anfallsentstehung sowie des Anfallstyps über eine Manipulation der SNr zu erwirken ist (DEPAULIS et al. 1994; LÖSCHER et al. 2008; GALE et al. 2008).
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Abb. 1: Schematische Darstellung der Generalisierung epileptischer Anfallsaktivität bei Temporallappen- epilepsie. Die Ausbreitung epileptischer Anfallsaktivität verläuft entlang spezifischer anatomischer Bahnen, die im physiologischen Zustand an der Vermittlung motorischer Aktivität beteiligt sind. Der epileptische Fokus liegt zumeist im limbischen System (lila). Im Falle einer Generalisierung erfolgt die Ausbreitung der Anfallsaktivität über den Kortex (blau), die Basalganglien (gelb), sowie deren Zielregionen (grün). In diesem epileptischen Netzwerk sind verschiedene Transmitter involviert, vor allem aber GABA (rote Pfeile) und Glutamat (blaue Pfeile). Modifiziert nach LÖSCHER et al. 2008.
2.2.3. Der Hippokampus – Anatomie und Physiologie
Vergleichend zur fokalen Applikation in Basalganglienregionen haben wir eine weitere Sub- stanz, Botulinumtoxin B, in den Gyrus dentatus des Hippokampus injiziert. Der Hippokampus gehört zum limbischen System, in welchem bei einem Großteil der Epilepsiepatienten der Anfallsfokus liegt (ENGEL et al. 1993). Pathologische Veränderungen bei Epilepsien werden zumeist in Form einer Sklerose im Hippokampus charakterisiert (MARGERISON u.
CORSELLIS 1966; SLOVITER 1994; KÄLVIÄINEN et al. 1998). Eine partielle Resektion des Temporallappens kann in Anfallsfreiheit resultieren (ENGEL et al. 1993; WIEBE et al.
2001), was die Hypothese stützt, dass auch fokale, therapeutische Manipulationen direkt im
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Anfallsfokus zu einem Erfolg führen können (EDER et al. 1997a; EDER et al. 1997b;
ROGAWSKI 2009).
Der Hippokampus besteht aus dem Subiculum, dem Ammonshorn und dem Gyrus dentatus (MCINTYRE u. SCHWARTZKROIN 2008). Der Gyrus dentatus ist die Haupteingangs- struktur des Hippokampus und erhält Eingänge aus dem entorhinalen Kortex. Er besteht hauptsächlich aus glutamatergen Neuronen, deren Zellsomata im sogenannten Körnerzellband liegen (Stratum granulare), ihren Dendriten, die im Stratum moleculare lokalisiert sind und dem Hilus, in dem sowohl glutamaterge Neurone, die aufgrund ihres Erscheinungsbildes so- genannten Mooszellen, als auch GABAerge Interneurone liegen (AMARAL 1978; FÖRSTER et al. 2006). Obduktionen an Patienten mit Temporallappenepilepsie haben gezeigt, dass so- wohl exzitatorische als auch inhibitorische Neurone degenerieren können, vornehmlich findet allerdings eine Reduktion der GABAergen Interneurone im Hilus des Gyrus dentatus statt (DE LANEROLLE et al. 1989; WITTNER et al. 2001). Im Kindling-Modell konnte gezeigt werden, dass sich durch Kindling die elektrophysiologischen Eigenschaften der glutamatergen Körnerzellen verändern, und dass eine hohe metabolische Aktivität der Region mit der Ge- neralisierung von Anfällen einhergehen kann (LOTHMAN 1994). Die enge Verschaltung der hippokampalen Strukturen untereinander und mit der kontralateralen Hemisphäre kann durch die hauptsächlich exzitatorischen, glutamatergen Verbindungen Anfallsaktivität amplifizieren (RIBAK et al. 1985; MCINTYRE u. SCHWARTZKROIN 2008). Der Hippokampus ist wohl die am besten untersuchte Hirnregion im Hinblick auf die Entstehung epileptischer Anfalls- aktivität.
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2.3. Studie I: Fokale Substanzapplikation
2.3.1. Substanzen für fokale Therapie 2.3.1.1. Vigabatrin
Um die effektivste Zielregion innerhalb der Basalganglien für die fokale Substanzapplikation bzw. die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen zu determinieren, haben wir zunächst ein Strukturanalogon von GABA, Vigabatrin (4-Aminohex-5-ensäure, Gamma-Vinyl-GABA, s. Abb. 2), als Modellsubstanz lokal in verschiedene Hirnareale von Ratten mikroinjiziert und dann mit etablierten Methoden die Anfallsschwelle bestimmt.
Vigabatrin hemmt irreversibel die GABA- Aminotransferase. Dieses Enzym ist für den Abbau von GABA zuständig. Wird es durch die systemische Administration von Vigabatrin gehemmt, so steigt die intrazerebrale GABA-Konzentration (SCHECHTER 1989; SABERS u. GRAM 1992).
In der Literatur ist beschrieben, dass Vigabatrin außerdem die GABA-Freisetzung fördern kann (BEN-MENACHEM 2002). Vigabatrin ist ein Antiepileptikum, das in über 50 Ländern als „Add-on“-Therapeutikum bei Patienten mit refraktären komplex-partiellen Anfällen als auch als Monotherapie bei Kindern mit infantilen Spasmen zugelassen ist (WILLMORE et al.
2009). Das Arzneimittel (Handelsname Sabril®) wird oral eingenommen und fast komplett resorbiert. Die Elimination erfolgt renal (BEN-MENACHEM 2002). Bei systemischer Einnahme treten vorrangig Nebenwirkungen wie sedative Effekte oder Gewichtszunahmen auf (SABERS u. GRAM 1992; BEN-MENACHEM 2007; WILLMORE et al. 2009).
Vigabatrin-spezifische Nebenwirkungen, die beim menschlichen Patienten auftreten, sind mit einer Prävalenz von unter 1 % Psychosen und mit einer Prävalenz von 25-50 % Gesichtsfeldeinschränkungen (SABERS u. GRAM 1992; THOMAS et al. 1996; WERTH u.
SCHADLER 2006; BEN-MENACHEM 2007; WILLMORE et al. 2009). Aus diesem Grund wurde Vigabatrin in den USA erst 2009 als Antiepileptikum unter der Prämisse zugelassen, dass ein sehr strenges Monitoring der Patienten auf Gesichtsfeldeinschränkungen vor,
Abb. 2 Strukturformeln von A GABA und B Vigabatrin
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während und nach Vigabatrin-Behandlung erfolgen muss (TOLMAN u. FAULKNER 2011).
Eine Möglichkeit, Nebenwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren ist die lokale Verabreichung eines Therapeutikums direkt in die Schlüsselregionen der Anfallsentstehung und –weiterleitung (FISHER u. HO 2002; NILSEN u. COCK 2004; ROGAWSKI 2009; AL- OTAIBI et al. 2011).
2.3.1.2. Botulinumtoxin
Im Gegensatz zu Vigabatrin ist der Wirkmechanismus von Botulinumtoxinen im Zentralner- vensystem weniger spezifisch. Botulinumtoxine sind Neurotoxine, die ihre Wirkung durch Hemmung der synaptischen Transmission erreichen. Sie gehören zu den giftigsten Proteinen überhaupt (JOHNSON 1999; ROSSETTO et al. 2006). Durch das Auftreten von Lähmungen (Paralyse) nach dem Verzehr von belastetem Fleisch wurden die ersten Intoxikationen durch Botulinumtoxine bereits im 18. Jahrhundert in Deutschland beschrieben (DICKSON 1918), und Anfang des 19. Jahrhunderts wurde ein Toxin als Ursache für die auftretenden Symptome von Botulismus identifiziert, die von Kopf- und Gliederschmerzen zu Beginn über Mund- trockenheit, Lähmungen der Augenmuskeln, Schlundmuskeln, Miktionsstörungen, Obstipa- tion bis zum Tod der Betroffenen reichten (KERNER 1817; KREYDEN et al. 2000). Es han- delt sich um bakterielle Toxine (Toxovaren A-G), die unter anaeroben Bedingungen von grampositiven Clostridien, vornehmlich Clostridium botulinum gebildet werden (VAN ERMENGEM 1897; SIMPSON 2004; SELBITZ 2011). Seit vielen Jahren ist bekannt, dass Botulinumtoxine die Vesikelfusion an der präsynaptischen Membran verhindert, indem es toxovarabhängig bestimmte Fusionsproteine (SNARE, engl. für soluble N-ethylmaleimide- sensitive-factor attachment receptor) spaltet (HUMEAU et al. 2000). Die peripheren Wirkun- gen von Botulinumtoxin sind sehr gut untersucht: Die Hemmung der Acetylcholin-Ausschüt- tung ist für die paralytische Wirkung von Botulinumtoxin verantwortlich. Die auf diesem Wege inhibierte Neurotransmission resultiert in einer klinisch manifesten, schlaffen Läh- mung, einer Paralyse. Diese Wirkung wird neben der Anwendung für kosmetische Zwecke auch klinisch bei verschiedenen Indikationen genutzt, bei denen eine pathologische, unkon- trollierte, periphere cholinerge Aktivität vorliegt (SIMPSON 2004), u.a. in der Ophthalmolo- gie, bei Bewegungsstörungen, Hypersekretionsstörungen und Schmerz (LIM u. SEET 2007).
Ziel einer Behandlung mit Botulinumtoxin in sehr geringen Dosen ist nicht die vollständige
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Hemmung der exzessiven neuronalen Aktivität, sondern die Reduktion auf ein normales Maß (JANKOVIC u. BRIN 1991; BELL et al. 2000).
In Deutschland gibt es 4 zugelassene Arzneimittel mit Wirkstoffen aus Botulinumtoxinen (DRESSLER 2012). Botulinumtoxin hemmt nicht nur die cholinerge Transmission, sondern u.a. auch die glutamaterge (MCMAHON et al. 1992). Somit war anzunehmen, dass durch die Hemmung zentraler, glutamaterger Neurone epileptische Anfallsaktivität inhibiert werden kann. Botulinumtoxin A und E erwirken in-vitro erwiesenermaßen eine selektive Hemmung der glutamatergen Transmission; es wird kein Effekt auf GABAerge Synapsen ausgeübt (CAPOGNA et al. 1997; VERDERIO et al. 2004). Botulinumtoxine sind Peptide und über- winden aufgrund ihrer Molekülgröße und Polarität nicht die Bluthirnschranke (SIMPSON 2004). Eine fokale Applikation von Botulinumtoxin in das Zentralnervensystem stellt die ein- zige Option dar, einen therapeutischen Nutzen bei Epilepsie zu überprüfen. Aus diesem Grund wurde Botulinumtoxin in der vorliegenden Arbeit in das glutamaterge Körnerzellband des Gyrus dentatus injiziert.
2.3.2. Fokale Substanzapplikation in Basalganglienregionen
Insgesamt gestaltet sich die lokale Verabreichung eines Therapeutikums, sei es eine Substanz oder ein Transplantat, als weit spezifischer als die systemische Gabe (BOISON 2007).
Bereits vor 30 Jahren konnte gezeigt werden, dass die Mikroinjektion von Vigabatrin lokal in das Mittelhirn in einem Ratten-Anfallsmodell antikonvulsiv wirksam ist (IADAROLA u.
GALE 1982). Für eine genauere Lokalisierung der Hirnregion, die für die beobachteten Wirkungen verantwortlich war, wurde der GABAA-Rezeptor-Agonist Muscimol verwendet und die SNr als Wirkort identifiziert (GALE 1985). Sie ist an epilepsie-induzierten, plastischen Netzwerkveränderungen beteiligt, die auch im experimentellen Tiermodell (Kind- ling als Modell für die Temporallappenepilepsie) hervorgerufen werden (GERNERT et al.
2004; TÖLLNER et al. 2011). Während und bereits vor einem generalisierten Anfall sind nigrale Nervenzellen vermehrt aktiv (ENGEL et al. 1978; NEHLIG et al. 1998; DUBÉ et al.
2000a). In unterschiedlichen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass eine vermehrte Hem- mung nigraler Neurone zu einer Reduktion bzw. Unterdrückung von experimentell ausgelös- ten Anfällen führt (GALE u. IADAROLA 1980; LE GAL LA SALLE et al. 1983a;
MCNAMARA et al. 1984; DEPAULIS et al. 1988; ZHANG et al. 1991; BLOMS-FUNKE u.
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LÖSCHER 1996; WINDELS u. KIYATKIN 2004; NOLTE et al. 2006). Neben Arbeiten im Kindling-Modell (LE GAL LA SALLE et al. 1983a; MCNAMARA et al. 1984; LÖSCHER et al. 1987) wurde eine antikonvulsive Wirkung GABA-potenzierender Substanzen auch in che- misch-induzierten, akuten Anfallsmodellen, in denen Anfälle z.B. mithilfe von Antagonisten des GABAA-Rezeptors ausgelöst werden, belegt. So konnte eine antikonvulsive Wirkung GABA-potenzierender Substanzen im systemischen Bicucullin-Modell (GARANT u. GALE 1986) bzw. im Flurothyl-Modell (XU et al. 1991; GARANT et al. 1995) gezeigt werden.
Auch nach systemischer und fokaler Auslösung eines Anfalls mit dem Parasympatho- mimetikum Pilokarpin konnte durch intranigrale Administration von Vigabatrin ein protekti- ver Effekt erzielt werden (TURSKI et al. 1986; SMOLDERS et al. 1997). Pilokarpin wird weltweit in der tierexperimentellen Epilepsieforschung genutzt, um sowohl akute Anfälle als auch einen selbst-erhaltenden Status epileptikus als primären Hirninsult und infolgedessen nach einer Latenzzeit von einigen Wochen eine chronische Epilepsie auszulösen (TURSKI et al. 1987; CAVALHEIRO 1995; LÖSCHER 2002; SCORZA et al. 2009). Auch bei genetisch veränderten Ratten, die spontan Absencen zeigen, konnten diese durch Injektion von GABAA- Agonisten in die SNr unterdrückt werden (DEPAULIS et al. 1988). Bisher gibt es jedoch kaum Untersuchungen, die direkt die Wirksamkeit fokaler und systemischer Applikation in einem Epilepsiemodell miteinander verglichen haben. Neuere Versuche haben zudem gezeigt, dass die SNr auf lokale Manipulationen nicht einheitlich in ihrer anfallsmodulierenden Eigen- schaft reagiert. Unterschiede zeigen sich bei der Ratte zwischen dem vorderen (anterioren) und hinteren (posterioren) Teil der SNr. Beispielsweise führte eine Mikroinjektion von Viga- batrin in der posterioren SNr (pSNr) zu prokonvulsiven Effekten im Flurothyl-Modell, in der anterioren SNr (aSNr) hingegen zu einer antikonvulsiven Wirkung (VELÍŠKOVÁ et al.
1996a). Ursächlich für diese widersprüchlichen Ergebnisse könnten unter anderem ein Unter- schied in der Rezeptorexpression (VELÍŠKOVÁ et al. 1998), subregionen-spezifische Efferenzen, das verwendete Tiermodell, das Alter sowie Geschlecht der verwendeten Tiere sein (SHEHAB et al. 1996; GERNERT u. LÖSCHER 2001). Wir führen daher sowohl die fokale Substanzapplikation als auch die später beschriebene Neurotransplantation an mehreren Loci der SNr durch.
Im Vergleich zur SNr ist der subthalamische Nukleus (STN) in seiner Bedeutung für die Weiterleitung epileptischer Anfallsaktivität weitaus weniger gut untersucht. Der STN liefert
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monosynaptischen, glutamatergen und damit exzitatorischen Input in die SNr. Folgerichtig senkte die Injektion des GABAA-Rezeptor-Agonisten Muscimol in den STN die metabolische und elektrophysiologische Aktivität der Zielstrukturen des STN, und somit u.a. in der SNr (FEGER u. ROBLEDO 1991). Analog zu den Untersuchungen in der SNr zeigte sich nach Mikroinjektion von Muscimol in den STN eine antikonvulsive Wirkung im Kindling-Modell (DERANSART et al. 1998), bei systemisch und fokal appliziertem Bicucullin (DYBDAL u.
GALE 2000), nach Flurothyl-Inhalation (VELÍŠKOVÁ et al. 1996b) und bei genetisch- bedingten Absencen (DERANSART et al. 1996). Dies belegt, dass sowohl die Hemmung des direkten striatonigralen als auch des indirekten Pfades bei der Ausbreitung epileptischer An- fallsaktivität eine Rolle spielen (DEPAULIS et al. 1994; GALE et al. 2008). Konträr zu Stu- dien an der SNr gibt es keine Untersuchungen zur Wirksamkeit von Vigabatrin nach Appli- kation in den STN.
Bisher ist die antikonvulsive Wirksamkeit einer Substanz auf die Hemmung des direkten und indirekten nigrostriatalen Weges nicht miteinander verglichen worden, so dass nicht doku- mentiert ist, welcher Weg den größten Nutzen für eine fokale, antikonvulsive Therapie haben könnte. Diese Arbeit soll helfen aufzuklären, welche Hirnregion der Basalganglien potenziell für die gerichtete, fokale Therapie am erfolgversprechendsten ist. Es gibt mehrere Gründe die Basalganglien und nicht direkt den Anfallsfokus als Zielregion für eine gerichtete, fokale Therapie auszuwählen. Einerseits könnte so auch Patienten geholfen werden, deren Anfalls- fokus operativ nicht zugänglich ist oder die mehrere Foci haben. Somit wird auch die Patien- tengruppe erreicht, für die eine Fokusresektion als therapeutische Intervention nicht in Frage kommt. Die Basalganglien, insbesondere der subthalamische Nukleus, werden klinisch für therapeutische Neurostimulation bei anderen neurologischen Erkrankungen wie beispiels- weise Morbus Parkinson oder Dystonie bereits genutzt (BENABID et al. 2001; BENABID 2007; AL-OTAIBI et al. 2011), so dass die chirurgische Zugänglichkeit dieser Region kli- nisch etabliert ist. Tatsächlich wurde auch bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten bereits erfolgreich im subthalamischen Nukleus stimuliert (CHABARDES et al. 2002). Zusätzlich spricht für die experimentelle Erforschung der Basalganglien als Zielregion für fokale Thera- pie, dass teilweise die Fokusdiagnostik ungenau bzw. beim Hund noch nicht etabliert ist, so dass die Manipulation von gemeinsamen „Endstrecken“ verschiedener Anfallstypen eine vielversprechende Option darstellt.
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2.3.3. Fokale Substanzapplikation in den Hippokampus
Der Gyrus dentatus wird analog zur SNr als „Tor zur hippokampalen Erregbarkeit“ bezeich- net (HEINEMANN et al. 1992). Elektrophysiologische Messungen belegen eine verminderte GABA-vermittelte Hemmung im Gyrus dentatus von humanen Epilepsiepatienten (WILLIAMSON et al. 1999). In akuten, experimentellen Anfallsmodellen kommt es analog nach Injektion von GABAA-Rezeptor-Antagonisten in die Region CA1 des Ammonshornes zu fokalen und sekundär generalisierenden Anfällen (ANSCHEL et al. 2004). Durch eine vorausgehende, prophylaktische Injektion von GABA-potenzierenden Substanzen wie Benzo- diazepinen oder GABA-Agonisten wie Muscimol lassen sich diese Anfälle unterdrücken (KOHANE et al. 2002; ANSCHEL et al. 2004). Ebenso lassen sich chronische Veränderun- gen im EEG, die durch systemische Pilokarpin-Injektion bzw. fokale Kobaltchlorid- Administration ausgelöst wurden, durch eine Diazepam-Injektion in die CA1 des Hippokam- pus reduzieren (EDER et al. 1997b). Die mögliche Einflussnahme auf die Anfallsaktivität durch eine Manipulation des GABAergen Systems, sowie die beschriebene pathologische Reduktion GABAerger Inhibition innerhalb des Hippokampus bei einer manifesten Epilepsie, lassen vermuten, dass im Umkehrschluss auch eine Reduktion der Glutamat-Freisetzung zu verminderter Suszeptibilität gegenüber prokonvulsiven Substanzen führt. In-vitro schützt eine herabgesetzte Glutamat-Freisetzung vor Übererregbarkeit der Neurone und übermäßiger Neu- rotransmitter-Sekretion (BANCILA et al. 2004). Absicht unserer Studie war es, durch die Mikroinjektion von Botulinumtoxin die glutamaterge Transmission im Gyrus dentatus in-vivo zu hemmen und auf diesem Weg antikonvulsive Effekte zu erzielen. Für die Toxovare A, B und E konnten im Kindling antikonvulsive Eigenschaften nachgewiesen werden (ROGAWSKI 2009; COSTANTIN et al. 2005). Auch nach fokaler oder systemischer, akuter Anfallsinduktion sowie nach chronischer Epilepsieinduktion durch Kainsäure kann durch Injektion von Botulinumtoxin E in die CA1 und CA3 des Hippokampus die Anfallsfrequenz reduziert werden (COSTANTIN et al. 2005; ANTONUCCI et al. 2009). Zudem ist für Botulinumtoxin E eine neuroprotektive Wirkung gegenüber Epilepsie-induzierter Neurode- generation nachgewiesen worden, die auf einer verminderten Aktivität proapoptischer Proteine beruht, die wiederum durch eine Herabregulation glutamaterger Neurotransmission bedingt sein könnte (MANNO et al. 2007; CALEO u. SCHIAVO 2009). Der Einsatz von Toxinen gegenüber herkömmlichen Antiepileptika könnte einen entscheidenden Vorteil
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haben: Antiepileptika sind kleinmolekülige Substanzen, die bei fokaler Applikation ins Hirn- gewebe vom Injektionsort in das umliegende Gewebe diffundieren. Botulinumtoxin hingegen diffundiert aufgrund seiner molekularen Eigenschaften kaum (GASIOR et al. 2007;
ROGAWSKI 2009), und wirkt bis die vom Toxin gespaltenen Vesikelproteine neu synthe- tisiert werden (RACIBORSKA u. CHARLTON 1999; MEUNIER et al. 2002). Die beobach- teten antikonvulsiven Effekte halten einige Wochen; im Vergleich liegt die Wirkung nach Mikroinjektion herkömmlicher Antiepileptika, die i.d.R. nach wenigen Tagen aufgehoben ist, deutlich darunter (EDER et al. 1997b; ROGAWSKI 2009; unveröffentlichte Daten aus der AG Rogawski). Fokale Therapieansätze würden für Epilepsiepatienten generell mindestens einen neurochirurgischen Eingriff bedeuten, der von der chronischen oder intermittierenden Applikation der antikonvulsiven Substanz gefolgt würde. Im Falle einer klinischen Anwen- dung der fokalen Therapie mit Botulinumtoxin könnte aufgrund der länger andauernden Wir- kung eventuell seltener behandelt werden als mit herkömmlichen Antiepileptika (ROGAWSKI 2009). Generell handelt es sich bei der fokalen Injektion von Substanzen um einen neurochirurgischen Eingriff mit folgender chronischer Behandlung, bei der das Thera- peutikum intermittierend oder kontinuierlich freigesetzt werden müsste.
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2.4. Studie II: Neurotransplantation
Eine weitere Strategie, langanhaltende, antikonvulsive Effekte zu erreichen, könnte die fokale Transplantation GABAerger Vorläuferzellen darstellen (LÖSCHER et al. 2008). Erste Trans- plantationsstudien wurden bereits in den 1980er Jahren bei rein neurodegenerativen Erkran- kungen mit selektivem Zellverlust wie der Parkinson’schen Erkrankung durchgeführt. In den ersten Studien wurden sowohl fetale Zellen aus der Ratte als auch Zellen, die aus humanen, abortierten Feten gewonnen wurden, in einem Rattenmodell für Morbus Parkinson transplan- tiert (BRUNDIN et al. 1985; BRUNDIN et al. 1986). In jenen und darauffolgenden Unter- suchungen konnte gezeigt werden, dass die transplantierten dopaminergen Vorläuferzellen zu einer Aufhebung der zuvor induzierten motorischen Asymmetrie führen und die dopaminer- gen Vorläufer ausdifferenzieren und funktionell in die Zielregion (Striatum) des Empfänger- tieres integriert werden (BRUNDIN et al. 1985; CLARKE et al. 1988; WICTORIN et al.
1992; OLSSON et al. 1997; BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Diese vielversprechenden Ergebnisse führten dazu, dass bereits klinische Studien an Parkinson-Patienten durchgeführt wurden, die diese Ergebnisse bestätigten (KORDOWER et al. 1995; SCHUMACHER et al.
2000). Allerdings waren diese weder verblindet noch Placebo-kontrolliert oder multizentrisch angelegt (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Diesbezüglich wurden Bedenken geäußert, jedoch aufgrund der langanhaltenden, positiven Effekte, die 5 bis 10 Jahre anhielten, wieder verworfen (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Neuere Placebo-kontrollierte Studien konnten diese Effekte nicht reproduzieren (OLANOW et al. 2009b).
2.4.1. Zelltransplantation bei Epilepsie
Der Ersatz von Nervenzellen wäre auch für das epileptische Gehirn eine vielversprechende Strategie (LÖSCHER et al. 2008). Auch die Neurotransplantation sollte direkt auf Hirn- regionen beschränkt werden, die bei der Entstehung bzw. Weiterleitung von Anfällen eine Rolle spielen. Nach TURNER und SHETTY (2003) sollte das perfekte Transplantat folgende Eigenschaften in sich vereinen: Es sollte 1. eine Überlebensrate der transplantierten Zellen von mindestens 20 %, 2. eine ausreichende, aber nicht übermäßige Ausbreitung und Migra- tion der Zellen, um die geschädigten Areale zu ersetzen, 3. eine physiologische Zellent- wicklung inklusive Regions-spezifischer Dendriten, Synapsen und intrinsischer Eigenschaften aufweisen, 4. lokale und Regions-übergreifende axonale Verbindungen zu den Wirtszellen
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bilden und 5. Afferenzen der Wirtszellen aufnehmen. In den letzten Jahren wurden diverse Transplantationsstudien in verschiedenen Epilepsiemodellen durchgeführt. In den Unter- suchungen wurden sowohl unterschiedliche Zelltypen als auch Zielregionen im Gehirn ver- wendet (für eine ausführliche Übersicht s. LÖSCHER et al. 2008); mehrheitlich wurde aller- dings der Hippokampus als Zielstruktur ausgewählt.
2.4.2. Neurotransplantation in den Hippokampus
Während der Epileptogenese und der manifesten Temporallappenepilepsie finden progressive Umstrukturierungen innerhalb des epileptischen Netzwerkes statt. Das epileptische Gehirn ist nicht in der Lage, die funktionellen Defizite, die u.a. durch Degeneration GABAerger Inter- neurone im Gyrus dentatus des Hippokampus entstehen, durch endogene Neubildung von Nervenzellen auszugleichen (SHETTY u. HATTIANGADY 2007a). Obwohl seit einigen Jahren bekannt ist, dass Neurogenese innerhalb des Gyrus dentatus auch im adulten Gehirn verschiedener Spezies, u.a. bei Mensch und Ratte, stattfindet (KUHN et al. 1996; ERIKSSON et al. 1998; RAO u. SHETTY 2004; CURTIS et al. 2012), ist die regenerative Kapazität bei Epilepsie stark eingeschränkt. Bei Vorliegen einer chronischen Epilepsie findet signifikant weniger Nervenzellentwicklung statt, dies konnte sowohl in Rattenmodellen für Temporal- lappenepilepsie als auch in humanen Patienten belegt werden (MATHERN et al. 2002;
HATTIANGADY et al. 2004; PIRTTILÄ et al. 2005; FAHRNER et al. 2007). Die Neurotransplantation kann hier im Sinne einer „cell replacement“-Strategie eingreifen und so die funktionelle Reparatur der geschädigten Areale ermöglichen (TURNER u. SHETTY 2003; RAEDT et al. 2007; LÖSCHER et al. 2008). Durch Transplantation fetaler, hippokam- paler Zellen in die CA3 des Hippokampus konnte in einem Rattenmodell für Temporal- lappenepilepsie (TLE) die pathologisch reduzierte Anzahl an Interneuronen wieder auf das Ausgangsniveau von Kontrolltieren ohne TLE erhöht werden, was durch den immunhistolo- gischen Nachweis typischer Marker für GABAerge Interneurone wie Glutaminsäure-Decar- boxylase 67 (GAD67) und Calbindin belegt wurde (SHETTY u. TURNER 2000; SHETTY u.
HATTIANGADY 2007b). Die Wiederherstellung des physiologischen Netzwerkes ist mit der fokalen Applikation von Antiepileptika nicht möglich und stellt daher einen entscheidenden Vorteil für die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen dar. Neben der reparierenden Funktion kann durch die transplantateigene Sekretion von GABA analog zur fokalen
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Vigabatrin-Applikation eine verstärkte Hemmung innerhalb der Zielregionen erreicht werden;
elektrophysiologische Untersuchungen konnten einen Anstieg der synaptischen Inhibition nach Transplantation belegen (ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009;
ZIPANCIC et al. 2010). Hippokampale Zellen, die aus 13 bzw. 14 Tage alten Rattenfeten isoliert wurden, konnten nach Transplantation in das Stratum oriens nahe der CA2 des Hippo- kampus im Kindling-Modell die Anfallsdauer reduzieren (MIYAMOTO et al. 1993). Des Weiteren kann eine Zelltransplantation mit zeitlicher Nähe zum Epilepsie-induzierenden Hirninsult auf die Epileptogenese Einfluss nehmen: Vier Tage nach einem durch Kainat aus- gelösten Status epileptikus wurden hippokampale Vorläuferzellen in den Hippokampus ver- pflanzt, die Tiere entwickelten eine zu 90 % geringere Anfallsfrequenz und um 75 % redu- zierte Anfallsdauer gegenüber den Kontrolltieren ohne Transplantate. Ein halbes Jahr nach der Operation waren noch 67 % der transplantierten Zellen vital, 16 % davon waren GABAerge Interneurone. Zusätzlich zeigten die Tiere Verbesserungen in räumlichem Lernen und Gedächtnistests (KURUBA et al. 2008; SHETTY 2011).
2.4.3. Neurotransplantation in Basalganglienregionen
Aufgrund massiver Umstrukturierungen im chronisch-epileptischen Hippokampus könnte sich eine Transplantation in diese stark geschädigte Region als problematisch erweisen. Hin- gegen erfahren die Basalganglien nicht derart erhebliche durch Epilepsie induzierte Um- strukturierungen, sind aber in der Lage, die Generierung von Anfällen im limbischen System zu modulieren. Daher sind sie möglicherweise als Zielregion für Transplantationen bei Temporallappenepilepsie besser geeignet als der Hippokampus. Die Verwendung intakter Hirnregionen als Zielregion wird kontrovers diskutiert, da experimentell im epileptischen Hippokampus, besonders kurz nach einem Hirninsult, eine höhere Anzahl an transplantierten Zellen überlebt als in den Hippokampi gesunder Versuchstiere (ZAMAN et al. 2001;
ZAMAN u. SHETTY 2002). Zudem kam es nach Transplantation neuraler Vorläuferzellen aus einer embryonalen Zelllinie in gesunde Tiere zu Tumorbildung, ein Prozess, der bei ge- schädigten Hippokampi nicht auftrat (CARPENTINO et al. 2008; SEBE u. BARABAN 2011). Entgegen dieser Beobachtungen konnte mit Hilfe von Transplantationen in die Substantia nigra pars reticulata (SNr) bereits eine antikonvulsive Wirkung bestätigt werden:
Die ersten Transplantationen GABAerger Zellen in die SNr fanden in den 1990er Jahren statt.
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Nach Transplantation fetaler GABAerger Zellen sank die Suszeptibilität gegenüber der pro- konvulsiven Substanz Pilokarpin (FINE et al. 1990). Diese Studie weist allerdings einige Schwachstellen auf, da Effekte auch nach Kontrolltransplantationen mit nicht GABAergen Zellen beobachtet wurden und keine quantitative Analyse der Überlebensrate der Transplantate oder der Dauer des antikonvulsiven Effektes durchgeführt wurden. LÖSCHER et al. konnten daher erstmals 1998 im Kindlingmodell zeigen, dass die Transplantation fetaler, striataler Zellen aus 14 Tage alten Rattenfeten in die SNr zu einer transienten, signifikanten Erhöhung der Nachentladungsschwelle und einer verminderten Anfallsschwere führt. Diese Effekte traten mit nicht-GABAergen Zellen bzw. Zellmedium nicht auf und waren somit spezifisch auf die Verwendung GABAerger Vorläuferzellen zurückzuführen (LÖSCHER et al. 1998). Durch spätere Untersuchungen mit zwei verschiedenen, immortalisierten und teil- weise zusätzlich genetisch veränderten GABAergen Zelllinien konnte bestätigt werden, dass die bilaterale Transplantation GABAerger Zellen in die SNr in verschiedenen Anfalls- modellen für einige Tage bis Wochen antikonvulsiv wirkt (THOMPSON u.
SUCHOMELOVA 2004; CASTILLO et al. 2006; CASTILLO et al. 2008; NOLTE et al.
2008). Bisher gibt es nur eine Studie zu Transplantationen in den subthalamischen Nukleus (STN) in einem akuten Anfallsmodell (HANDRECK et al. 2012). Im Zuge dieser Unter- suchung ist uns gelungen zu zeigen, dass nach Transplantation einer striatalen GABAergen Mutterzelllinie und eines GABA-überexprimierenden Klons in den STN deutliche antikon- vulsive Effekte im PTZ-Modell hervorgerufen werden können (HANDRECK et al. 2012).
Mit einer Effektdauer von lediglich maximal drei Wochen stellt dieser Ansatz jedoch keine zufriedenstellende Lösung für das Problem der transienten Wirkung dar. Bemerkenswert ist allerdings, dass sogar eine einseitige Transplantation in den STN die Anfallsschwelle signifi- kant erhöhen konnte (HANDRECK et al. 2012). Diese aussichtsreichen Ergebnisse lassen hoffen, dass auch die dauerhafte Suppression von Anfällen nach Auffinden der effektivsten Zielregion möglich sein könnte.
2.4.4. Zellen für die Neurotransplantation 2.4.4.1. GABAerge Vorläuferzellen
Aus den früheren Parkinson-Studien ist bekannt, dass die Verwendung von Vorläuferzellen gegenüber der Verwendung von adulten Neuronen bzw. Zelllinien aussichtsreicher sein
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könnte, da immature Precusorzellen nach Transplantation höhere Überlebensraten zeigen (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Es ist nicht abschließend geklärt, wie lange GABAerge Zelllinien in der Lage sind post transplantationem zu überleben und langfristig GABA freizu- setzen (SHETTY 2011). Eine mögliche Erklärung für die in einigen Untersuchungen beobachtete, transient antikonvulsive Wirkung könnte sein, dass die Zellen bald nach Trans- plantation apoptotisch werden oder aus bisher nicht geklärten Gründen die GABA-Produktion einstellen.
Bisher gibt es insgesamt wenige Studien zur Transplantation GABAerger Precursoren in die SNr bzw. keine zur Transplantation in den STN. Zumeist wurde der Hippokampus als Ziel- region ausgewählt. Neben den zuvor beschriebenen fetalen Zellen, die aus dem Hippokampus selbst isoliert wurden, haben in den letzten Jahren vermehrt Transplantationen mit striatalen Vorläuferzellen stattgefunden: Seit Ende der 90er ist bekannt, dass Zellen des ventralen Sub- palliums des Telencephalons während der Gehirnentwicklung u.a. in den Kortex, Basal- ganglienregionen, Hippokampus und Bulbus olfactorius wandern und dort GABAerge Projektions- und Interneurone bilden (DE CARLOS et al. 1996; TAMAMAKI et al. 1997;
ANDERSON et al. 1997). Diese Regionen werden als mediale und laterale ganglionische Eminenz (MGE bzw. LGE) bezeichnet (ANDERSON et al. 2001). Die Zellen der MGE gelten als Hauptquelle kortikaler GABAerger Interneurone (LAVDAS et al. 1999; SUSSEL et al. 1999; WICHTERLE et al. 2001). Besonders das hohe Potential zu Migration lässt vermuten, dass sich die Zellen in geschädigten Arealen integrieren bzw. sich dort ansiedeln, wo sie für eine Wiederherstellung des funktionellen Netzwerkes nützlich sein könnten (ANDERSON u. BARABAN 2012). Die Zellen migrieren nach Transplantation zwischen 1 und 5 mm im Nagergehirn (WICHTERLE et al. 1999; SEBE u. BARABAN 2011). Die Arbeitsgruppe um Scott BARABAN et al. (2009) transplantierte MGE-Vorläuferzellen in den Kortex sehr junger Mäuse (P2) und beobachtete, dass die Zellen 60 Tage nach Transplantation noch lebten, in dieser Zeit bis zu 3 mm migrierten und zu 69 % in GABAerge Interneurone differenziert waren. Sie wiesen alle Charakteristika nativer Interneurone auf (ähnliches Entladungsmuster), erhöhten die tonischen und phasischen GABA-Ströme im Gehirn und bildeten inhibitorische Synapsen. Eine Verpflanzung dieser Zellen in genetisch- epileptische Mäuse (Knockout eines Kalium-Kanals, Kv1.1-/-) führte zu einer An- fallsreduktion um 86 % (BARABAN et al. 2009). Es wurden weder eine Tumorbildung noch
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unerwünschte Verhaltensänderungen bei den Tieren beobachtet. In einem chemischen Modell für akute Anfälle durch Pilokarpin konnte belegt werden, dass die signifikant antikonvulsive Wirkung der transplantierten MGE-Zellen vergleichbar mit der Wirkung verschiedener Antiepileptika (Valproat, Phenobarbital, Carbamazepin) war (ANDERSON u. BARABAN 2012). ZIPANCIC et al. (2011) verursachten im Mausmodell durch Ablation einer GABAergen Subpopulation von Neuronen durch ein neurotoxisches Saporin eine verminderte synaptische Inhibition, die nach MGE-Zelltransplantation in den anterioren und posterioren Hippokampus wiederhergestellt werden konnte. Zudem wirkten die Zelltransplantate antikon- vulsiv nach intraperitonealer Applikation von PTZ. Ein Jahr nach Transplantation konnten noch 20 % vitale Zellen nachgewiesen werden (ZIPANCIC et al. 2010).
Auch in Rattenmodellen wurden MGE-Vorläuferzellen erfolgreich transplantiert und zeigten eine funktionelle Integration und erhöhte Inhibition (HATTIANGADY et al. 2011). Die Gruppe um Ashok Shetty hat in einem chronischen Epilepsiemodell verschiedene neuronale Precursorzellen aus Rattenfeten in die CA3 des Hippokampus adulter Ratten transplantiert.
Zunächst verwendete die Gruppe LGE-Vorläuferzellen. Diese werden hauptsächlich zu Projektionsneuronen u.a. des Striatums und Bulbus olfactorius (WICHTERLE et al. 2001).
Aus LGE-Vorläuferzellen differenzierten sich nach Transplantation in die hippkampale CA3 zu einem hohen Prozentsatz GABAerge Neurone (69 %), was sie neben den MGE-generierten Zellen ebenfalls interessant für unsere Transplantationsversuche macht (HATTIANGADY et al. 2008). Durch den Zusatz eines Wachstumsfaktors („Fibroblast-Growth-Factor 2“, FGF-2) und eines Apoptosehemmers (Caspase-1-Inhibitor) in-vitro konnte ein langanhaltender antikonvulsiver Effekt nach Transplantation der LGE-Zellen erzielt werden (HATTIANGADY et al. 2008). So vorbehandelte Zellen wurden 4 Tage nach einem Status epileptikus in die CA3 des Hippokampus transplantiert. In einer Gruppe von Tieren konnte noch 9 bzw. 12 Monate nach Operation eine Anfallsreduktion von 67 % bzw. 89 % im Vergleich zu Kontrolltieren, die ebenfalls einen Status epileptikus, aber keine Zelltransplantation erfahren hatten, nachgewiesen werden. 33 % der Zellen hatten langfristig im Gehirn überlebt (HATTIANGADY et al. 2008).
Des Weiteren verwendete auch die Arbeitsgruppe Shetty die zuvor genannten MGE- Vorläuferzellen. Anstelle der Verwendung frisch gewonnener MGE-Vorläufer wurden diese zunächst in-vitro als neurale Stammzellen („neural stem cells“, NSC) unter Zusatz bestimmter
