Verhaltensbeobachtung nach Transplantation

Konform mit den Beobachtungen aus der Studie zur fokalen Substanzapplikation mit Viga-batrin zeigten die Tiere nach Zelltransplantation bzw. Medium-Injektion keine auffälligen Verhaltensweisen direkt nach Operation oder zu den Zeitpunkten der Schwellenmessungen.

5.5.5. Histologie

Vergleichend zur Mikroinjektionsstudie wurde die korrekte Position der Transplantate sowie der Kontroll-Injektionen von Neurobasalmedium in anhand von Thionin-gefärbten Gehirn-schnitten histologisch überprüft und nur bilateral korrekt platzierte Transplantate oder Medium-Injektionen in die Auswertung miteinbezogen.

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Die GABAergen Vorläuferzellen ließen sich nach kurzfristiger Inkubation mit Caspase-Inhi-bitor und FGF-2 und sukzessiver Transplantation (Protokoll nach HATTIANGADY et al.

(2008)) noch bis zu 3 Monate histologisch nachweisen (s. Abb. 46).

Abb. 46 Vorläuferzellen aus der LGE in der anterioren SNr drei Monate post Transplantation in der Thioninfärbung. A zeigt die Ansammlung stark angefärbter, transplantierter Zellen, B eine Vergrößerung des Transplantatbereiches. Maßstabsbalken: A = 200 µm, B = 100 µm.

Auch nach einwöchiger Kultur als Neurosphären (Protokoll nach WALDAU et al. (2010)) mit oder ohne Passagen, nach dem Einfrieren, erneutem Auftauen und anschließender Kultivie-rung gelang der histologische Nachweis 3 Monate nach Transplantation. Die Zellen zeigten sich im Thionin-gefärbten Schnitt stark angefärbt. In dieser Anfärbung konnte nicht evaluiert werden, ob es sich hier um die Transplantate selbst oder zusätzlich auch um wirtseigene Zel-len handelte. Aufgrund der geringen Größe des STN wurden auch Transplantate als getroffen gewertet, wenn der Hauptanteil der Zellen innerhalb der Zielstruktur lag (s. z.B. Abb. 55B).

In Medienkontrolltieren war der Nachweis teilweise schwieriger, da besonders nach Transplantation mittels Glaskapillare der Einstichkanal kaum noch im Gewebe zu dif-ferenzieren war (s. Abb. 48). Es wurde weder in Kontrolltieren noch in Tieren mit Trans-plantaten eine Abstoßungsreaktion oder eine Tumorbildung beobachtet.

Abb. 48 Einstichkanal eines Kontrolltieres 5 Wochen nach Medium-Injektion in die anteriore SNr. Maßstabsbalken = 200 µm.

Abb. 47 Einstichkanal eines Kontrolltieres 5 Wochen nach Medium-Injektion in die anteriore SNr. Maßstabsbalken = 200 µm.

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5.5.6. Immunhistologie

Eine genauere Klassifizierung der stark Thionin-gefärbten Zellen im Transplantatbereich er-möglichte die immunhistologische Differenzierung mittels verschiedener Antikörper (s. Abb.

49 und Abb. 49). Mit einer Anfärbung gegen den Marker BrdU konnten wir belegen, dass die transplantierten Zellen bis zu 3 Monate nach Transplantation überlebt hatten. Im Bereich des Transplantates gab es frequent Anhäufungen von Astrozyten, die mit einem spezifischen Marker (GFAP, s. Abschnitt 4.9.1) angefärbt wurden. Die qualitative Analyse der Gehirn-schnitte ergab keine auffallenden Unterschiede in der Morphologie und Differenzierung der transplantierten Zellen aus LGE oder MGE.

Abb. 49 Zelltransplantate aus der LGE fünf Wochen nach Transplantation in die anteriore SNr. A, C und E zeigen das Transplantat in der linken, B, D und F in der rechten Hirnhemisphäre. A und B Thioninfärbung, C und D immunhistologische DAB-Färbung gegen BrdU, E und F immunhistologische DAB-Färbung gegen GFAP. Maßstabsbalken = 100 µm.

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Abb. 50 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte drei Monate nach Transplantation von MGE-Vorläuferzellen in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläuferzellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die GFAP-positiven Zellen inner- und außerhalb des Trans-plantates; C Überlagerung. Maßstabsbalken = 100 µm.

Die BrdU-positiven Zellen selbst hatten sich zu einem Teil in Neurone (positiv für NeuN, s. Abb. 51 und Abb. 52) und zu einem Teil in Astrozyten (anti-GFAP markiert, s. Abb. 49) differenziert. Wir konnten außerdem zeigen, dass sich transplantierte Zellen in GAD67 -posi-tive Zellen differenziert hatten (s. Abb. 53 und Abb. 54). Anhand der 40 µm dicken Schnitte konnte allerdings keine quantitative Analyse der Zelldifferenzierung durchgeführt werden.

Abb. 51 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte 3 Monate nach Transplantation von Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläufer-zellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die NeuN-positiven Neurone innerhalb des STN (Cy3-markiert = rot); C Überlagerung, es wird deutlich, dass nur sehr wenige BrdU-positive Zellen auch positiv für den Neuronenmarker NeuN gefärbt sind (gelb). Maßstabsbalken = 100 µm.

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Abb. 53 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte drei Monate nach Transplantation von Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt BrdU-positive Zellen im STN (Cy2-markiert = grün);

B zeigt, dass nur wenige der Zellen positiv für GAD₆₇ sind (Cy3-markiert = rot); C Überlagerung.

Maßstabsbalken = 100 µm.

Abb. 52 Immunhistologisch-angefärbte Gehirn-schnitte desselben Tieres aus Abb. 51 in einem anderen Bereich. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläuferzellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die NeuN-positiven Neurone innerhalb des STN (Cy3-markiert = rot);

C Überlagerung; D Vergrößerung, es wird deutlich, dass nur sehr wenige transplantierte Zellen positiv für den Neuronenmarker NeuN gefärbt sind (gelb; Pfeile).

Maßstabsbalken = 100 µm.

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Abb. 54 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte 3 Monate nach Transplantation von Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläufer-zellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die GAD₆₇-positiven Neurone innerhalb des STN;

C Überlagerung, es wird deutlich, dass nur wenige transplantierte Zellen positiv für GAD67 gefärbt sind. Maß-stabsbalken = 100 µm.

Innerhalb der Transplantate und im Einstichkanal waren zudem sehr häufig Blutzellen vor-handen (s. Abb. 55A). Ferner konnten wir regelmäßig eine Migration der Zellen aus der Ziel-struktur beobachten (s. Abb. 55B). Besonders auffällig war dies nach Transplantationen in den dicht gepackten STN. Eine akzidentielle Platzierung der Zellen in andere Regionen konnte hier ausgeschlossen werden, da einerseits ein Teil des Transplantates innerhalb der Zielregion lag, andererseits die Zellen zumeist einer nicht linearen Route in die jeweilige Hirnregion folgten, die durch die Injektion mit einer starren Kanüle nicht beschreibbar gewe-sen wäre.

Abb. 55 Thioninfärbungen von Zelltransplantaten fünf Wochen nach Transplantation in den STN. A zeigt Erythrozyten innerhalb des Einstichkanals und des STN; in Aufnahme B ist die erwähnte Migration der trans-plantierten Zellen aus dem STN in den zerebralen Pedunkel zu sehen. Maßstabsbalken = 100 µm.

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