Genomische und evolutionäre Analyse von MHC-Klasse-I-Genen bei einem Halbaffen
(Microcebus murinus)
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Jennifer Neff
aus Berlin
Hannover 2005
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Gedruckt auf säurefreiem Papier
1. Aufl. - Göttingen : Cuvillier, 2005
CUVILLIER VERLAG, Göttingen 2005
1. Auflage, 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Franz-Josef Kaup
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Franz-Josef Kaup 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Leibold
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.2005 Zugl.: Hannover, Univ., Diss., 2005
ISBN 3-86537-467-0 ISBN 3-86537-467-0
Meiner Familie
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND GLOSSAR
1 EINLEITUNG ...13
1.1 Fragestellung der vorliegenden Arbeit...15
2 LITERATURÜBERSICHT ...16
2.1 Lemuren auf Madagaskar...16
2.2 Der Graue Mausmaki (Microcebus murinus) ...18
2.2.1 Taxonomische Einordnung ...18
2.2.2 Vorkommen und Lebensweise...21
2.3 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ...22
2.3.1 Struktur und Funktion des MHC...25
2.3.1.1 Struktur und Funktion der MHC-Klasse-I-Moleküle...26
2.3.1.2 Struktur und Funktion der MHC-Klasse-II-Moleküle ...28
2.3.2 Evolution des MHC ...30
2.3.3 Der MHC bei den Primaten ...33
2.4 MIC-Gene (MHC-class-I-chain related genes) ...34
2.5 Vergleich des MHC verschiedener Spezies; die Framework-Hypothese (AMADOU 1999) . ...36
3 MATERIAL ...37
3.1 Chemikalien ...37
3.2 Stammlösungen und Puffer...39
3.3 Zusammensetzung von Nährmedien...41
3.3.1 Nährmedien...41
3.3.2 Zusätze für die verschiedenen Nährmedien ...41
3.4 Verwendete Kits...42
3.5 Verwendete Enzyme ...42
3.6 Oligonukleotide...42
3.7 Verwendete Hybridisierungsproben ...43
3.10 Genbank ...47
3.11 Verwendete BAC-Klone ...49
3.12 Bakterienstämme und Bakterienkultur...49
3.12.1 Flüssignährmedien für Bakterien...49
3.12.2 Festnährmedien für Bakterien...50
3.13 Computerprogramme ...50
3.13.1 Phylogenetische Stammbaumrekonstruktion...51
3.14 Einwegartikel ...51
3.15 Geräte...52
3.16 Herstelleradressen ...54
4 METHODEN ...57
4.1 Allgemeine Richtlinien zur Arbeit mit Nukleinsäuren ...57
4.2 Isolierung von Nukleinsäuren ...57
4.2.1 Kleinansatz zur Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien ...57
4.2.2 Großansatz zur Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien ...58
4.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren...59
4.3.1 Konzentrationsbestimmung mittels Absorptionsspektrometrie...59
4.3.2 Konzentrationsbestimmung mittels Agarosegel ...60
4.4 Spaltung von DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen ...60
4.5 Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren in Agarose-Gelen ...61
4.6 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ...62
4.7 Fällung und Konzentration von Nukleinsäuren ...62
4.7.1 Ethanol- und Isopropanolfällung von Plasmid-DNA ...63
4.7.2 Ethanolfällung von Sequenzierungsreaktionsansätzen ...63
4.8 Reinigung von Nukleinsäuren...64
4.8.1 Phenol-Chloroform-Extraktion ...64
4.9 Übertragung von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose ...64
4.9.1 Transfer von DNA aus Agarosegelen – Southernblot (SOUTHERN 1975) ...65
4.9.2 Herstellung von DNA dot blots (KAFATOS et al. 1979)...66
4.12 Autoradiographie ...68
4.13 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)...68
4.13.1 Kolonie-PCR...70
4.14 Ligation von DNA ...70
4.14.1 Ligation eines PCR-Produktes...71
4.14.2 Ligation von DNA-Fragmenten ...72
4.15 Schrotschussklonierung ...72
4.16 Dephosphorylierung freier 5´-Enden ...73
4.17 Herstellung kompetenter Bakterienzellen...74
4.18 Transformation von E. coli-Zellen durch Elektroporation...74
4.19 Selektion transformierter E.coli-Zellen...75
4.20 Sequenzierung...76
4.21 Screening der BAC-Bank...77
5 ERGEBNISSE ...78
5.1 Etablierung von Hybridisierungsproben ...78
5.2 Herstellung einer MHC-Klasse-I-Hybridisierungssonde...78
5.3 Herstellung von Hybridisierungssonden aus verschiedenen Framework- Genen ...79
5.4 Isolierung von MHC-Gen-tragenden BAC-Klonen des Microcebus murinus...84
5.5 Physikalische Kartierung der verschiedenen MHC-Klasse-I-Regionen mittels Southernblot- Hybridisierung...85
5.5.1 Genomische Analyse des BAT1 – TCF19 - Intervalls (Contig 1)...86
5.5.2 Genomische Analyse des CAT56 – TRIM26 – Intervalls (Contig 2)...94
5.5.3 Genomische Analyse des PPP1R11 – MOG - Intervalls (Contig 3) ...104
5.5.4 Genomische Analyse der zusätzlichen TRIM26 - Region (Contig 4)...113
5.5.5 Überprüfung der erweiterten MHC-Klasse-II-Region des Microcebus murinus auf MHC-Klasse-I-Gene ...116
5.6 Subklonierung und Sequenzierung einzelner BAC-Klone ...121
5.7 Evolutionäre Analysen des Contig 1...122
murinus mit MHC-Klasse-I-Sequenzen anderer Spezies...125
6 DISKUSSION ...127
6.1 Physikalische Kartierung des BAT1 – TCF19 – Intervalls (Contig 1)...129
6.2 Physikalische Kartierung des CAT56 – TRIM26 – Intervalls (Contig 2)...131
6.3 Physikalische Kartierung des PPP1R11 – MOG – Intervalls (Contig 3) ...132
6.4 Physikalische Kartierung der zusätzlichen TRIM26 – Region (Contig 4) ...133
6.5 Vergleich der MHC-Klasse-I-Regionen des Microcebus murinus mit verschiedenen Spezies ...134
6.6 Ausblick ...135
7 ZUSAMMENFASSUNG ...136
8 SUMMARY ...138
9 LITERATURVERZEICHNIS ...140
10 ANHANG ...161
10.1 Zusammenstellung der insgesamt erhaltenen BAC-Klone aus dem mehrfachen Screening der Microcebus murinus BAC-Bank...161
10.1.1 Auflistung der MHC-Klasse-I-positiven Klone...161
10.1.2 Auflistung der positiven BAC-Klone aus den Framework-Gen- Screening-Runden..164
Verzeichnis der Abkürzungen und Glossar
A Adenin Abb Abbildung
Aliquot Teilprobe, aliquotierte Teile
ATP Adenosin-5-triphosphat
BAC Bacterial Artificial Chromosom
(künstliches Bakterienchromosom) BAT1 HLA-B associated transcript 1
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
β2m β2-Mikroglobulin
C Cytosin CAT56 Alternative Bezeichnung für das Gen PRR3
CHORI Children´s Hospital Oakland Research Institute
cDNA Complementary DNA
(komplementäre DNA)
Ci Curie cm Centimeter
Contig Ununterbrochene Folge überlappender DNA-
Sequenzen
dATP Desoxyadenosin-5´triphosphat dCTP Desoxycytidin-5´-triphosphat [α32P] dCTP radioaktiv markiertes Desoxycytidin-5´-
triphosphat,
ddNTP Didesoxyribonukleinsäure
Depurinieren Saure Hydrolyse der DNA
dGTP Desoxyguanosin-5´-triphosphat
DNA Desoxyribonucleic acid
(Desoxyribonukleinsäure)
dNTP Desoxynukleotid-5´-triphosphat dTTP Desoxythymidin-5´triphosphat
E. coli Escherichia coli
E-Cup Eppendorfreaktionsgefäß EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ER Endoplasmatisches Retikulum
EtBr Ethidiumbromid
g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
G Guanin GNL1 Guanine nucleotide-binding-protein-like1
h Stunde HCGV Hämochromatosis candidate gene V
HLA Human Leukocyte Antigen
(Humanes Leukozyten Antigen) IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
KAc Kaliumacetat kb Kilobase KCl Kaliumchlorid KOH Kaliumhydroxid kDa Kilodalton
LacZ-Gen β-Galactosidase Gen
LB Luria-Bertani M Molarität mA Milliampere Mb Megabase µCi Mikrocurie µJ Mikrojoule µl Mikroliter µm Mikrometer
MHC Major Histocompatibility Complex
(Haupthistokompatibilitäts Komplex)
MIC MHC-Class-I-Chain Related
min Minute
Mio Million mm Millimeter mM Millimolar
MOG Myelin-oligodendrocyte-glycoprotein
mRNA messenger RNA
(Boten RNA)
ms Millisekunde
Mya Million years
(Millionen Jahre)
NaAc Natriumacetat NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid nm Nanometer
OCT3 Octamer –binding transcription factor 3
OD Optische Dichte
PAC P1 Artificial Chromosome
(künstliches Phage 1 Chromosom)
PCR Polymerase Chain Reaction
(Polymerase-Ketten-Reaktion)
Pellet Sediment POU5F1 POU domain, class 5, transcription factor 1 PPP1R11 Protein phosphatase 1, regulatory subunit 11
PRR3 Proline-rich 3
RING1 Ring-finger-protein 1
RNA Ribonucleic acid
(Ribonukleinsäure)
RNAse Ribonuklease
RNF9 Ring finger protein 9
RNF23 Ring finger protein 23
RNF93 Ring finger protein 93
rpm Rounds per minute
(Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur s Sekunde SACM2L Supressor of actin mutations like 2
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
(Natriumdodecylsulfat)
SOB Hefe-Peptone-Salz-Medium
SOC Glukosehaltiges SOB-Medium
SSC Standard Sodium Citrate
(Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer)
Tab Tabelle Template Matrize
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TCF19 Transcription Factor 19
Tm Schmelztemperatur
TPE Tris-Phosphat-EDTA-Puffer TRIM10 Tripatite motife-containing 10
TRIM15 Tripatite motife-containing 15 TRIM26 Tripatite motife-containing 26 TRIM39 Tripatite motife-containing 39
Tris Tris (hydroxymethyl)aminomethan
U Enzymeinheit
ÜN Über Nacht
V Volt Vol Volumenteil X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid
ZNF173 Zinc-finger-protein 173
ZNFB7 Zinc-finger-binding-protein 7
1 Einleitung
Genetische und evolutionäre Studien über die Immunantwort werden häufig anhand des Haupthistokompatibilitätskomples (MHC) durchgeführt. Der MHC ist eine Region von ca. 4 Mb (bei Säugern), die die für den MHC charakteristischen MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II-Gene enthält. MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Moleküle präsentieren antigene Peptide an T- Lymphozyten und kontrollieren somit entscheidend die Immunantwort. Weiterhin ist der MHC signifikant mit Infektions- und Autoimmunkrankheiten assoziiert.
Primaten werden häufig als Tiermodelle für solche Erkrankungen, Organtransplantationen und bei der Entwicklung neuer Impfstoffe eingesetzt (BONTROP 2001). Dennoch ist bisher im Vergleich zum Menschen wenig über die genetische Vielfalt der Primaten bekannt. Dieses erscheint jedoch äußerst wichtig für die Übertragung der Forschungsergebnisse aus den Tiermodellen auf den Menschen, da der MHC eine sich sehr rasch entwickelnde genomische Region darstellt.
MHC-Klasse-I-Gene sind bisher in Altweltaffen (Catharrini) und Neuweltaffen (Plathyrrhini) beschrieben worden. Studien am Gorilla (LAWLOR et al. 1991), Schimpansen (ADAMS u.
PARHAM 2001; ANZAI et al. 2003), Orang-Utan (ADAMS et al. 1999), Rhesusaffen (DAZA- VAMENTA et al. 2004) und Pavian (SIDEBOTTOM et al. 2001) zeigten, dass im Vergleich zu den exprimierten humanen Klasse-I-Genen HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E und HLA-F die entsprechenden Klasse-I-Gene mit Ausnahme von HLA-C in Altweltaffen vorkommen, während bei den Neuweltaffen nur HLA-G, HLA-E und HLA-F-ähnliche Sequenzen gefunden wurden (VOGEL et al. 1999).
Über die Evolution von MHC-Klasse-I-Genen in Halbaffen (Strepsirrhini) ist bisher kaum etwas beschrieben worden, weshalb deren Beziehung zu den humanen Klasse-I-Genen weitestgehend ungeklärt ist. Bei Untersuchungen an der cDNA des Grauen Mausmaki (Microcebus murinus) konnten vier vollständige MHC-Klasse-I-Gensequenzen identifiziert werden, die sehr wahrscheinlich Klasse-Ia-Gene repräsentieren (FLÜGGE et al. 2002). Eine Stammbaumanalyse zeigte, dass keine der gefundenen Sequenzen hohe Ähnlichkeit zu den humanen Klasse-I-Genen aufweist. Auch partielle Klasse-I-Sequenzen eines madagassischen Lemur catta und eines asiatischen Nycticebus pygmaeus ließen keine besondere Ähnlichkeit zu den humanen Klasse-I- Genen erkennen, so dass eine orthologe Beziehung zu den Klasse-I-Genen der Catarrhini oder Platyrrhini bisher nicht festzustellen war (FLÜGGE et al. 2002). Es wird daher vermutet, dass die
Entwicklung der HLA-A, HLA-B, HLA-C und HLA-G-Charakteristika des Mausmakis erst nach der Trennung der Strepsirrhini von den Platyrrhini und den Catarrhini erfolgt sein muss.
Das Vorhandensein von MHC-Klasse-I-verwandten MIC-Genen des Menschen wurde ebenfalls erst in den letzten Jahren bei Primaten erforscht. Mittels PCR konnten drei homologe Sequenzen aus Rhesusaffen (Macacca mulatta) isoliert werden, die einen hohen Verwandtschaftsgrad zu den exprimierten MIC-Genen MICA bzw. MICB haben und MIC1, MIC2 und MIC3 bezeichnet wurden (SEO et al. 1999). Homologe Sequenzen zu den humanen Pseudogenen MICC, MICD, MICG und MICF wurden allerdings nicht gefunden. Die Auswertung weiterer Gensequenzen von Macaca mulatta ergab verschiedene MIC2- und MIC3-Allele sowie ein orthologes Gen zum humanen MICD (SEO et al. 2001). Allerdings sind nicht bei jedem Rhesusaffen alle drei MIC-Gene vorhanden. Die Anwesenheit der MIC-Gene variiert zwischen ein bis drei Genen, wobei bisher kein Rhesusaffe getestet wurde, der überhaupt kein MIC-Gen besaß (FLÜGGE 2003).
Abbildung 1: Microcebus murinus
1.1 Fragestellung der vorliegenden Arbeit
Der MHC ist mit zahlreichen Krankheiten assoziiert, deren genetische Ursachen meist nicht bekannt sind. Vor allem für die Analyse immunologischer Erkrankungen sowie für die Transplantationsforschung ist die Kenntnis der genomischen Struktur des MHC und der darin enthaltenen Gene von besonderer Bedeutung.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die strukturelle Analyse der MHC-Klasse-I-Gene bei Microcebus murinus (Abb. 1) erfolgen und die Evolution der MHC-Klasse-I-Gene näher untersucht werden.
Mit Hilfe einer Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Bank des Genoms von Microcebus murinus sollten die Klasse-I-Gene durch ein Screening mit einer MHC-Klasse-I-Genprobe identifiziert und physikalisch kartiert werden. Es sollte ferner herausgefunden werden, wie viele Klasse-I-Gene vorhanden sind.
Zur Erstellung einer physikalischen Karte der MHC-Region musste auch die Anordnung der sogenannten Framework-Gene (nicht Klasse-I-, nicht Klasse-II-Gene) bestimmt werden, um diese dann mit dem MHC von Mensch, Maus, Ratte und Rhesusaffe vergleichen zu können.
Ein weiteres Ziel war die Untersuchung der MIC-Gene. Es sollte herausgefunden werden, ob Microcebus murinus diese Gene besitzt und ob sie einem humanen MIC-Gen zugeordnet werden können.
Schließlich sollte die evolutionäre Beziehung der Klasse-I-Gene zu anderen Halbaffen sowie höheren Primaten analysiert werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Lemuren auf Madagaskar
Die Verbreitung der Lemuren beschränkt sich auf die Insel Madagaskar im Indischen Ozean. Vor ca. 165 Mio. Jahren war der nördliche Teil der Insel mit Tansania, Kenia und Somalia verbunden, bevor sie sich vom afrikanischen Festland trennte und vor ca. 125 Mio. Jahren ihre heutige geographische Lage, 400 km östlich von Afrika, erreichte (RABINOWITZ et al. 1983). Der indische Subkontinent brach vor 88 Mio. Jahren von der Insel ab (STOREY et al. 1995) und wanderte nord-ostwärts bis dieser vor 56-66 Mio. Jahren auf das asiatische Festland traf (BECK et al. 1995). Seit der Trennung von Afrika, entwickelte sich die insulare Flora und Fauna weitestgehend unabhängig, so dass die meisten Tier- und Pflanzenarten auf der Insel endemisch vorkommen (JENKINS 1990).
Es ist noch nicht vollständig geklärt, wann und wie die auf Madagaskar lebenden Lemuren die Insel besiedelten. Phylogenetische Untersuchungen haben ergeben, dass die madagassischen Lemuren vermutlich aus Afrika einwanderten (MARTIN 1995, YODER et al. 1996) und die Insel vor 47 - 80 Mio. Jahren besiedelt haben müssen (ROOS et al. 2004). Es existieren drei Hypothesen wie die Primaten und andere Säugetiere nach Madagaskar immigrierten: 1. über eine Landbrücke zwischen Afrika und Madagaskar während sich der Meeresspiegel absenkte (MC CALL 1997), 2. „Island hopping“ über den Mosambique Kanal (TATTERSALL 1982) und 3. „rafting“ auf dem Seeweg mit Hilfe treibender Vegetation (KAPPELER 2000). Die ersten beiden Hypothesen werden für sehr unwahrscheinlich gehalten, da es keine eindeutigen Hinweise für eine durchgängige Landbrücke oder Inselkette gibt. Außerdem würde man in diesem Zusammenhang eine größere Anzahl an terrestrischen Säugetieren auf der Insel erwarten. Die „Rafting-Hypothese“ erscheint für die Kolonisation der Primaten am wahrscheinlichsten. Es wird angenommen, dass Schlafgruppen Cheirogaleidae-ähnlicher Arten, die üblicherweise mehrere Wochen oder Monate schlafend in ihren Baumhöhlen verbringen, den Kanal überquerten. Dies ist möglich, da die Tiere während der Trockenzeit in einen Inaktivitätszustand mit assoziierter Hypothermie (Topor) fallen, in dem ihr Körpermetabolismus bis zu 90 % gesenkt wird (KAPPELER 2000). Anhand von phylogenetischen Untersuchungen, basierend auf repetitiven Elementen, erstellten ROOS et al. (2004) eine Phylogenie, die auf eine einmalige Besiedlung Madagaskars durch Halbaffen hinweist. Die
molekularen Analysen unterstützen die Annahme der Immigration über den Mozambique Kanal mittels „Rafting“ zwischen der späten Kreidezeit und dem mittleren Eozän.
Abbildung 2: Besiedlung Madagaskars nach der "Rafting-Hypothese" (nach YODER et al.
1996)
2.2 Der Graue Mausmaki (Microcebus murinus)
2.2.1 Taxonomische Einordnung
Klasse: Säugetiere ( Mammalia )
Ordnung: Primaten
Subordnung: Strepsirrhini
Infra-Ordnung: Lemuriformes
Familie: Cheirogaleidae
Gattung: Microcebus
Art: Microcebus murinus (nach TATTERSALL 1982; PURVIS 1995)
Der graue Mausmaki wird der Familie der Cheirogaleidae zugeordnet, die zu den ursprünglichsten und kleinsten rezenten Primatenarten gehören (DUTRILLAUX 1979). Die Gattung Microcebus beinhaltet derzeit acht verschiedene Arten (Tab. 1) (ZIMMERMANN et al. 1998; YODER et al.
2000).
Tabelle 1: Arten von Microcebus Microcebus-Art Körperlänge
[cm]
Gewicht [g] Färbung Lebensraum (Abb. 3)
Microcebus ravelobensis
12,0-13,4 55-87 rot-braun Ankarafantsika
Microcebus murinus
12,1-13,7 57-67 grau-braun Andranomena
Vohimena, Kirindy, Manamby
Microcebus Tavaratra
11,6-13,6 46-76 dunkelbraun Ankarana
Microcebus griseorufus
11,7-12,9 47-79 grau-rotbraun Beza Mahafaly
Microcebus berthae
8,9-9,5 30-31 rotbraun Kirindy
Microcebus sambiranensis
11,3-12,1 38-50 rotbraun Manongarivo
Microcebus myoxinus
11,9-12,8 43-55 rötlich-braun Aboalimena Bemaraha
Microcebus rufus
10,2-10,5 45-80 rötlich-braun Andasibe Ostküste
Südosten
Microcebus tavaratra Microcebus sambiranensis
Microcebus revelobensis
Microcebus myoxinus
Microcebus murinus
Microcebus griseorufus
Microcebus berthae
Abbildung 3: Lebensräume der verschiedenen Microcebus-Arten (nach YODER et al. 2000).
Der Lebensraum des im Osten lebenden Microcebus rufus ist nicht eingezeichnet.
2.2.2 Vorkommen und Lebensweise
Die Grauen Mausmaki leben entlang der Süd-Westküste Madagaskars, in der „fine-branche-niche“
der laubabwerfenden Trockenwälder, die aus Zweigen, Lianen und dichtem Blätterwerk besteht (MARTIN 1972; TATTERSALL et al. 1982). Sie sind einheitlich grau-braun gefärbt und wiegen mit einer mittleren Körperlänge von ca. 13 cm und einer Schwanzlänge von ebenfalls 13 cm im Durchschnitt 60 g (TATTERSALL et al. 1982; ZIMMERMANN et al. 1998) Ein Sexualdimorphismus zugunsten der männlichen Tiere, in Form von verlängerten Eckzähnen, einem höheren Körpergewicht oder einer längeren Körpergröße, sind bei dieser Gattung nicht festzustellen (KAPPELER 1991). In ihrem Lebensraum bewegen sich die Mausmaki hauptsächlich quadruped laufend, hüpfend, springend oder kletternd fort (MARTIN 1972).
Ihre akustischen sowie olfaktorischen Sinne sind besonders ausgeprägt. Sie ermöglichen es ihnen, Laute bis weit in den Ultraschallbereich hinein zu produzieren und wahrzunehmen (HAFEN et al.
1998; ZIMMERMANN 1995; ZIMMERMANN u. HAFEN 2001). Typische Verhaltensweisen wie z.B. Urinwaschen, Mundwinkelmarkieren, Astbeißen und Anogenitalmarkieren resultieren aus dem Vorhandensein eines gut ausgeprägten und funktionsfähigen Vomeronasalorgans, wobei hierfür Körpersekrete verwendet werden, da der Mausmaki keine speziell entwickelten Drüsen besitzt (GLATSTON 1979; SCHILLING u. PERRET 1987; SCHILLING 1987).
Da Mausmaki strikt nachtaktive Tiere sind, besitzen sie in Anpassung daran große, vorwärts gerichtete Augen, die mit einem Tapetum lucidum ausgekleidet sind (MARTIN 1973, 1995; ROWE 1996). Tagsüber schlafen sie in Baumhöhlen, Nestern, Totholz und vereinzelt auch in dichtem Gebüsch. Die Weibchen bilden dabei feste Schlafgruppen, während die Männchen hauptsächlich allein schlafen. Selten findet man auch Männchen und Weibchen zusammen. Die Bildung von festen Schlafgemeinschaften ist in Bezug auf die Thermoregulation und dem Schutz vor Raubfeinden wie z.B. Carnivore, Schlangen, Taggreifvögel und Eulen für die kleinen Lemuren sehr wichtig. Nachts dagegen trennen sich die Schlafgruppen und die Tiere gehen allein auf Nahrungssuche (MARTIN 1972; RADESPIEL et al. 1998; EHRESMANN 2000).
Hauptnahrungsbestandteile sind Blüten, Früchte, Nektar, Baumsäfte, Insekten, Spinnen und kleine Wirbeltiere, wobei das Angebot jahreszeitlich bedingt ist (MARTIN 1972, 1973; HLADIK 1979;
HLADIK et al. 1980). In der nahrungsarmen Trockenzeit (Juni bis September) wird die Körpertemperatur gesenkt und die Tiere fallen in den sogenannten Topor, einen Inaktivitätszustand mit assoziierter Hypothermie, um so die gesteigerte Konkurrenz um Nahrung zu umgehen. Der
Energiebedarf wird auf ein Minimum heruntergefahren und aus den Fettdepots der Unterhaut, die sich im Schwanz sowie in den Hinterbeinen ansammeln, gedeckt (SCHMID 1997). Wie auch bei vielen anderen Lemurenarten, sind die Weibchen das dominante Geschlecht. Die Aktionsräume der einzelnen Tiere überlappen sich und beide Geschlechter haben mehrere Sexualpartner (RADESPIEL et al. 1998; 2000; RADESPIEL u. ZIMMERMANN 2001). Die Paarungszeit ist photoperiodisch induziert und an die saisonalen Verhältnisse im Lebensraum der Mausmaki angepasst. Die Weibchen sind saisonal polyöstrisch. Der Östrusbeginn wird durch die ansteigende Tageslänge eingeleitet, wobei eine zeitlich eng begrenzte Östrussynchronität bei den Weibchen auftritt (GLATSTON 1979; EHRESMANN 2000; RADESPIEL u. ZIMMERMANN 2001). Die normalerweise verschlossene Vagina schwillt an und öffnet sich für einen sehr kurzen Zeitraum von wenigen Tagen, wobei die rezeptive Phase nur ca. 2-4 Stunden umfasst. Nach neueren Untersuchungen gibt es zwei Paarungszeiten innerhalb der Fortpflanzungssaison. Die erste beginnt Mitte September und die zweite folgt Ende November (GLATSTON 1979; RADESPIEL 2000).
Ein bis vier Jungtiere werden nach einer ca. 60 tägigen Tragezeit in den Laubnestern oder in den Baumhöhlen geboren (ANDRIANTSIFERANA et al. 1974; PERRET 1990). Die ersten drei Wochen verbringen sie ausschließlich in den Nestern, bevor sie diese verlassen und mit 10-12 Monaten geschlechtsreif werden (GLATSTON 1979).
2.3 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex, MHC) des Menschen ist eine ca. 3,8 Mb große Region, die auf dem kurzen Arm des Chromosom 6 (6p21.3) lokalisiert ist und auch als HLA (Human Leukocyte Antigen)-Komplex bezeichnet wird. Anhand der vollständigen Sequenz des menschlichen MHC wurden 224 Gene gefunden, von denen wahrscheinlich 128 exprimiert werden. Der MHC stellt somit die genreichste Region des humanen Genoms darstellt. Es wird geschätzt, dass von den exprimierten Genen des MHC ca. 40 % eine Funktion im Immunsystem haben (THE MHC SEQUENCING CONSORTIUM 1999;
TROWSDALE 2001). Ein weiteres Charakteristikum ist der hohe Grad an Polymorphismus, der sich insbesondere bei den Klasse-I-Genen zeigt. So sind für den HLA-B-Genlocus zur Zeit 617 Allele bekannt.
Die Transplantations- und Blutgruppenuntersuchungen von Peter Gorer zeigten, dass die Toleranz bzw. Abstoßung von transplantiertem Tumorgewebe zwischen verschiedenen Maus- Inzuchtstämmen von der An- und Abwesenheit bestimmter Antigene abhängt (GORER 1936). Gut 10 Jahre später entdeckte George Snell, dass sich akute bzw. chronische Abstoßungen von transplantiertem Gewebe je nach Einfluss der beteiligten Gene äußern. Diese Gene wurden je nach der Art des Einflusses als major (stark) oder minor (schwach) Histokompatibilitätsgene (H-Gene) bezeichnet (SNELL 1948). Als erkannt wurde, dass mehrere sehr eng gekoppelte Gene einen starken Einfluss ausüben, wurde der Begriff Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex) eingeführt.
Bis heute sind viele Erkrankungen entdeckt worden, die MHC-assoziiert sind. Gerade bei Autoimmunerkrankungen und allergischen Reaktionen spielen die verschiedenen Allele des MHC eine große Rolle. Bei vielen MHC-assoziierten Erkrankungen handelt es sich um multifaktorielle Erkrankungen, bei denen zusätzlich zu den MHC-Genen noch weitere Loci auf anderen Chromosomen sowie Umwelteinflüsse eine Rolle spielen. Die wohl bekanntesten Erkrankungen sind der Insulin-abhängige Diabetes mellitus (Typ-I-Diabetes mellitus) (DAVIES et al. 1994;
CONCANNON et al. 1998; MEIN et al. 1998), die Multiple Sklerose (THOMSON 1995, EBERS et al. 1996), der Systemische Lupus Erythematosus (RUPERT et al. 2002) und die Rheumatoide Arthritis (CORNELIS et al. 1998). Aber auch nicht-immunologische Erkrankungen wie z.B. die Hypotrichose (LEVY-NISSENBAUM et al. 2003) und das Adrenogenitale Syndrom (SPEISER u.
WHITE 2003) sind MHC-assoziiert.
Abbildung 4: Gen-Karte der HLA-Region (nach THE MHC SEQUENCING CONSORTIUM 1999)
2.3.1 Struktur und Funktion des MHC
Der MHC wird in verschiedene Regionen unterteilt (Abb. 4), die als Klasse-I-, Klasse-II- und Klasse-III-Region bezeichnet werden (KLEIN 1986; TROWSDALE 1995; GÜNTHER u.
WALTER 2001). Die Orientierung des MHC ist bei Mensch, Maus und Ratte identisch (HELOU et al. 1998). Zentromerwärts liegt die Klasse-II-Region, telomerwärts die Klasse-I-Region und dazwischen die Klasse-III-Region. Eine zusätzliche Klasse-I-Region konnten WALTER und GÜNTHER (2000) bei der Ratte im zentromeren Bereich zwischen den Genen Sacm2l und Ring1 identifizieren (RT1-A-Region), die auch bei der Maus vorhanden ist (H2-K-Region). Vermutlich handelt es sich hierbei um eine Region, die nur spezifisch bei den Nagern auftritt, da bei anderen Säugerspezies wie z.B. Mensch und Rhesusaffe keine entsprechende zentromerische Klasse-I- Region vorkommt (THE MHC SEQUENCING CONSORTIUM 1999; SUDBRAK et al. 2003).
Die Klasse-I-Region umfasst beim Menschen 1800 kb. Die MHC-Klasse-Ia-Gene (klassische Klasse-I-Gene) wie HLA-A, HLA-B und HLA-C werden in fast allen kernhaltigen Zellen exprimiert und sind sehr polymorph, während die Klasse-Ib-Gene (nicht klassische Klasse-I-Gene) wie z.B.
HLA-E, HLA-G und HLA-F nur eingeschränkt exprimiert werden und wenig polymorph sind. Die Aufgabe der Klasse-I-Moleküle ist die Präsentation von Peptiden auf der Zelloberfläche, welche von zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt und vernichtet werden. Weiterhin befinden sich in der Klasse-I-Region die Klasse-Ib-Gene MICA und MICB, zwei entfernt verwandte Mitglieder der Klasse-I-Genfamilie sowie eine Reihe von Klasse-I-Pseudogenen und Genfragmenten. Eine Peptidpräsentationsfunktion für humane Klasse-Ib-Moleküle ist bisher nur für HLA-E sicher beschrieben worden (BRAUD et al. 1997). Klasse-Ia-Moleküle und Klasse-Ib-Moleküle können darüber hinaus als Liganden für Rezeptoren von Natürlichen Killer (NK)-Zellen dienen (LANIER 2004).
Die MHC-Klasse-II-Region erstreckt sich beim Menschen über 670 kb (THE MHC SEQUENCING CONSORTIUM 1999). Die Klasse-II-Gene kodieren Proteine, die an der Antigenpräsentation (DP, DQ, DR) bzw. an der Peptidbeladung von Klasse-II-Molekülen beteiligt sind (DM, DO). Die Einteilung der MHC-Klasse-II-Moleküle erfolgt wie bei den Klasse-I-Molekülen in klassische- Klasse-II-Moleküle, HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR sowie in nichtklassische Klasse-II- Moleküle, HLA-DM und HLA-DO. Ihre Aufgabe ist die Präsentation von Peptiden aus extrazellulär aufgenommenen Proteinen, die den CD4+-T-Helferzelllen präsentiert werden.
In der Klasse-III-Region, deren Länge ca. 800 kb beträgt, sind Gene lokalisiert, die keiner dominierenden Klasse angehören. Viele der dort angesiedelten Gene kodieren ebenfalls Proteine mit immunologischen Funktionen wie z.B. Komplement-Faktoren (C2, C4, B-Faktor), Hitzeschockproteine (HSP70-Familie), Tumornekrosefaktor (TNF) und die Lymphotoxine alpha (LTA) und beta (LTB).
Zusätzlich kommen in der gesamten MHC-Region noch MHC-Gene vor, die weder der Klasse-I- noch der Klasse-II zugeordnet werden können. Diese Gene werden als Ankergene oder Framework- Gene (framework genes) bezeichnet (AMADOU 1999; GÜNTHER u. WALTER 2001).
2.3.1.1 Struktur und Funktion der MHC-Klasse-I-Moleküle
Die MHC-Klasse-I-Gene kodieren membrangebundene Glykoproteine, die auf der Zelloberfläche fast aller kernhaltigen Zellen vorkommen. Ihre Aufgabe ist die Präsentation von Peptiden, die von Proteinen aus dem Zytosol stammen. In der Regel handelt es sich hierbei um körpereigene Strukturen, aber auch um Proteine von Viren oder Bakterien, die sich im Zytosol der Zelle vermehren (JANEWAY u. TRAVERS 2002). Das kodierte Protein setzt sich aus zwei Polypeptidketten zusammen. Die ca. 45 kDa schwere α-Kette wird vom MHC kodiert und ist nicht kovalent mit dem β2-Mikroglobulin (β2m) gebunden, dessen Gen nicht im MHC, sondern beim Menschen auf dem Chromosom 15 lokalisiert ist (GOODFELLOW et al. 1975). Das Molekül besteht aus vier Domänen, von denen die α-Kette drei Domänen α1, α2 und α3 und das β2- Mikroglobulin die vierte Domäne bilden (Abb. 5). Die α-Kette besteht neben den drei extrazellulären Domänen α1, α2 und α3 noch aus einem transmembranösen und einem kurzen zytoplasmatischen Anteil. Mittels Röntgenstrukturanalyse konnte aufgeklärt werden, dass die Domänen α1 und α2 eine grubenähnliche Peptidbindungsregion bilden (BJORKMAN et al. 1987a;
1987b; SAPER et al. 1991; BROWN et al. 1993). Der Grubenboden besteht aus antiparallelen β- Faltblatt-Strukturen, während die Ränder aus α-Helices gebildet werden. Die α3-Domäne sowie das β2-Mikroglobulin haben eine immunglobulinähnliche Struktur und interagieren miteinander. In der α3-Domäne ist ebenfalls die Bindungsstelle für den CD8-Korezeptor auf den zytotoxischen T- Zellen angesiedelt (SALTER et al. 1990). Die MHC-Klasse-I-Moleküle binden Peptide mit einer Länge von 8-10 Aminosäuren, von denen ein Teil der Aminosäuren des gebundenen Peptids aus der
Bindungsgrube herausragt. Der auf der Zellmembran verankerte Komplex aus α-Kette, β2- Mikroglobulin und gebundenem Peptid wird den zytotoxischen T-Zellen präsentiert und über den T-Zellrezeptor erkannt (GARBOCZI et al. 1996). Die zytoplasmatischen Proteine werden im Proteasom, das auch die MHC-kodierten Untereinheiten LMP2 und LMP7 enthält, zu Peptidfragmenten abgebaut (TROWSDALE et al. 1990; NEEFJES et al. 1993). Der MHC-kodierte TAP-Transporter (TAP1 und TAP2) befördert die Peptide in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER), wo die MHC-Klasse-I-Moleküle mit Hilfe des ebenfalls MHC-kodierten Moleküls Tapasin beladen und dadurch stabilisiert werden (ORTMANN et al. 1997). Nach dem Verlassen des Endoplasmatischen Retikulums passieren die mit Peptid beladenen MHC-Klasse-I- Moleküle den Golgi-Apparat, erreichen in Vesikeln verpackt die Zelloberfläche und werden in der Zellmembran verankert. Im Falle einer Infektion werden neben den zelleigenen Proteinen die Peptide aus intrazellulären Bakterien und Viren abgebaut und an die Zelloberfläche transportiert.
CD8+-zytotoxische T-Zellen erkennen die Antigene und lysieren die antigenpräsentierenden Zellen (PAMER und CRESSWELL 1998; WILLIAMS et al. 2002).
Eine weitere wichtige Funktion der MHC-Klasse-I-Moleküle ist die Interaktion mit den Natürlichen Killer (NK)-Zellen, auf deren Oberfläche verschiedene Rezeptor-Typen exprimiert werden. Durch die Bindung von MHC-Klasse-I-Molekülen wird je nach Rezeptor-Typ und gebundenem Ligand ein aktivierendes oder ein inhibierendes Signal in die NK-Zelle geleitet. Anhand des Verhältnisses zwischen aktivierenden und inhibierenden Signalen resultiert die Regulation der NK-Zellaktivität.
Unter physiologischen Bedingungen überwiegen die inhibierenden Signale, wodurch die entsprechende Zielzelle nicht abgetötet wird (CERWENKA u. LANIER 2001). Einige Viren wie z.
b. das Herpes simplex-Virus (HSV) und das Cytomegalievirus (CMV) verfolgen Immunevasionstrategien, die eine Hemmung der Präsentation viraler Antigene an zytotoxische T- Zellen hervorrufen. In ihrem Genom besitzen sie gewisse Gene, deren Produkte einen Verlust der Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche der infizierten Zellen bewirken (ALCAMI u. KOSZINOWSKI 2000). Die inhibitorischen Signale entfallen in dieser Situation, wodurch die aktivierenden Signale überwiegen und die Abtötung der virusinfizierten Zelle durch die NK-Zellen erfolgt. Die NK-Zellrezeptor-Gene sind häufig dupliziert und liegen als Genkomplex vor. Diese Genkomplexe werden als NK-Zellrezeptorkomplex (NKC) und als Leukozytenrezeptorkomplex (LRC) bezeichnet, von denen der LRC eine komplexe Genetik mit
ausgeprägten An- und Abwesenheitspolymorphismen der entsprechenden Gene zeigt (UHRBERG et al. 1997; TROWSDALE 2001).
Abbildung 5: Struktur des MHC-Klasse-I-Moleküls (nach JANEWAY u. TRAVERS 2002).
2.3.1.2 Struktur und Funktion der MHC-Klasse-II-Moleküle
MHC-Klasse-II-Moleküle sind ebenfalls membrangebundene Glykoproteine, die durch die MHC- Klasse-II-Region kodiert werden und hauptsächlich auf Dendritischen Zellen, Makrophagen, Monozyten, B-Zellen und Thymusepithelzellen vorkommen. Der Komplex aus MHC-Klasse-II- Molekül und gebundenem Peptid wird von den CD4+-T-Helferzellen erkannt, die weitere Effektorzellen des Immunsystems aktivieren. Die MHC-Klasse-II-Moleküle bestehen aus zwei nicht-kovalent gebundenen Peptidketten, eine ca. 35 kDa schwere α-Kette und eine β-Kette von ca.
28 kDa. Beide Ketten besitzen zwei extrazelluläre Domänen, eine transmembrane- und eine zytoplasmatische Region. Die grubenähnliche Peptidbindungsregion der Klasse-II-Moleküle wird
von der α1- und der β1-Domäne gebildet, so dass in diesem Fall beide Ketten an der Grubenbildung beteiligt sind (BROWN et al. 1993; STERN et al. 1994). Ansonsten findet man einen ähnlichen Aufbau wie bei den MHC-Klasse-I-Molekülen vor: der Grubenboden wird aus β-Faltblatt- Strukturen und die Ränder von zwei α-Helices gebildet (Abb. 6). Die Grube des MHC-Klasse-II- Moleküls ist an den Enden weiter geöffnet als das Klasse-I-Molekül, so dass die gebundenen Peptide über die Peptidbindungsregion hinausragen können (BROWN et al. 1993).
Die zu präsentierenden Antigene stammen in der Regel aus dem endosomalen / lysosomalen Kompartiment und nicht, wie bei den MHC-Klasse-I-Genen, aus dem Zytosol der Zelle. Im Anschluß an die Synthese der α / β-Ketten, erfolgt die Translokation der MHC-Klasse-II-Moleküle in das Endoplasmatische Retikulum (ER). Die MHC-Klasse-II-Moleküle binden an die sogenannte invariante Kette, um eine Anlagerung an ER-resistente Proteine zu verhindern. Dabei kommt es zur Bildung eines Komplexes aus 3 α- und 3 β-Ketten sowie 3 invarianter Ketten (ROCHE et al. 1991).
Ein Teil der invarianten Kette legt sich in die Grube des MHC-Klasse-II-Moleküls, so dass diese blockiert ist (BIJLMAKERS et al. 1994). Eine weitere Funktion der invarianten Kette besteht darin, die notwendigen Aminosäuremotive für den intrazellulären Transport zum endosomalen Kompartiment zu tragen (BAKKE u. DOBBERSTEIN 1990; LOTTEAU et al. 1990; NORDENG et al. 2002). Die endosomalen / lysosomalen Kompartimente werden auch als MHC class II compartment (MIIC) bezeichnet. In ihnen erfolgt der proteolytische Abbau der invarianten Kette bis auf ein Fragment, das an das MHC-Klasse-II-Molekül gebunden bleibt, das sogenannte CLIP- Peptid (class-II-associated invariant-chain peptide) (GHOSH et al. 1995; NAKAGAWA et al.
1999; SHI et al. 1999). Um die Bindung von Peptiden zu ermöglichen, muß das CLIP mit Hilfe des nicht-klassischen Klasse-II-Moleküls HLA-DM (HLA-DO in B-Zellen) gegen Peptide aus dem MIIC ausgetauscht werden (DENZIN u. CRESSWELL 1995; KROPSHOFER et al. 1996, 1997).
HLA-DM besitzt hierbei zwei Funktionen. Zum einen bindet es an das zu beladende MHC-Klasse- II-Molekül, wodurch eine Stabilität erzielt wird (Chaperon-Funktion), zum anderen katalysiert es den Austausch von CLIP gegen Peptide, die durch Abbau im endosomalen / lysosomalen Kompartiment entstanden sind (KROPSHOFER et al. 1997). Die stabilisierten und mit Peptiden beladenen MHC-Klasse-II-Moleküle werden an die Zelloberfläche transportiert und präsentieren sich dort den T-Zellen.
Abbildung 6: Struktur des MHC-Klasse-II-Moleküls (nach JANEWAY u. TRAVERS 2002).
2.3.2 Evolution des MHC
Der MHC stellt eine Errungenschaft der Wirbeltiere dar, kommt allerdings nicht bei kieferlosen Wirbeltieren (Agnatha) vor, die zwar lymphozytenähnliche Zellen exprimieren (MAYER et al.
2002), aber keine Gene für einen T-Zellrezeptor oder Klasse-I-Gene bzw. Klasse-II-Gene (HASHIMOTO et al. 1992; KLEIN et al. 2000; FLAJNIK u. KASAHARA 2001). Zur Zeit existieren zwei Hypothesen über die Entstehung des MHC. Das „Blockduplikationsmodell“, nach dem die Entstehung von Klasse-I-Vorläufergenen nach der Trennung von kieferlosen Wirbeltieren und Kiefermündern (Gnasthostomata) durch chromosomale Duplikation erfolgt sein muß (KASAHARA et al. 1996; KASAHARA 1999; ABI-RACHED et al. 1999). Homologe Gene konnten im Lanzettfischchen (Brachiostoma lanceolatum) nachgewiesen werden, weshalb davon ausgegangen wird, dass die paralogen Regionen aufgrund einer Blockduplikation nach der Trennung der Agnatha aber vor der Aufspaltung der Gnasthostomata vor ca. 500 bis 750 Mio.
Jahren entstanden sind (ABI-RACHED et al. 2002). Die zweite Hypothese stützt sich auf individuelle Genduplikationen und Lokalisationen duplizierter Gene auf bestimmten chromosomalen Abschnitten der Chromosomen 1, 6 und 9, da die Duplikation verschiedener MHC- und MHC-paraloger Gene zu sehr unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgte (HUGHES 1998;
HUGHES u. PONTAROTTI 2000).
Mittlerweile wurde die MHC-Region zahlreicher Säuger und Nicht-Säuger untersucht und zum Teil komplett oder anteilig sequenziert. Große Unterschiede zwischen den Säugern und Nicht-Säugern zeigen sich bei den Knochenfischen (Teleostei) und bei den Vögeln (Aves). Der MHC des Huhnes ist mit seinen 19 Genen sehr kompakt und umfasst nur 92 kb (KAUFMANN et al. 1999). Im Gegensatz zu den meisten MHC der Säuger besitzen Hühner nur zwei Klasse-I-Gene, von denen wiederum nur eines als Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Zu fast allen der 19 Gene sind homologe Gene im Säuger-MHC zu finden, die Abfolge der einzelnen Gene weicht jedoch stark ab (KAUFMANN et al. 1999). Innerhalb der Knochenfische sind bis heute der MHC des Zebrafisches (Danio rerio), des Medaka (Oryzias latipes) und des Japanischen Pufferfisches (Fugu rubripes) analysiert worden. Ihre MHC-Gene sind nicht eng gekoppelt, sondern liegen in sogenannten Kopplungsgruppen vor, die wiederum auf unterschiedlichen Genen liegen können (MICHALOVA et al. 2000; MATSUO et al. 2002; SAMBROOK et al. 2002). Bei der Untersuchung des MHC verschiedener Ammenhaie fanden OHTA et al. (2000) heraus, dass, anders als bei den Knochenfischen, die Klasse-I-Gene, Klasse-II-Gene und Klasse-III-Gene der Knorpelfische eng aneinander gekoppelt sind. Es wird spekuliert, dass es sich hierbei um die ursprünglichste Form des MHC handelt, die in der Struktur bis zu den Säugetieren erhalten blieb, während in den phylogenetisch jüngeren Knochenfischen der MHC umstrukturiert wurde (FLAJNIK u. KASAHARA 2001).
Bei den Säugetieren findet man deutliche Unterschiede zwischen der Evolution der MHC-Klasse-I- und der MHC-Klasse-II-Gene. Die Evolution der MHC-Klasse-I-Gene lässt sich am besten anhand des „birth and death Modell“ erläutern (PIONTKIVSKA u. NEI 2003). Neue Klasse-I-Gene entstehen danach durch wiederholte Genduplikationen. Diese Gene können später als Pseudogene auftreten oder auch wieder aus dem Genom entfernt werden. Genduplikationen bzw. Gendeletionen sind auch dafür verantwortlich, dass es keine orthologen Beziehungen zwischen den verschiedenen Ordnungen der Säugetiere gibt (HUGHES u. NEI 1989), jedoch homologe Regionen in allen Spezies der Säugetiere zu finden sind (TROWSDALE 1995; FLAJNIK u. KASAHARA 2001;
KULSKI et al. 2002). Orthologe Gene sind homologe Gene in unterschiedlichen Spezies, welche aus demselben Gen des nächsten Vorfahren abstammen. Als paralog werden Gene bezeichnet, die durch Duplikation entstanden sind. In der Regel findet man bei verschiedenen Säugetierordnungen keine orthologen, sondern paraloge Beziehungen zwischen Klasse-I-Genen (FIGUEROA et al.
1988; HUGHES u. NEI 1989). Der humane MHC (THE MHC SEQUENCING CONSORTIUM 1999), der MHC der Ratte (HURT et al. 2004) sowie der MHC des Rhesusaffen (DAZA- VAMENTA 2004) sind bisher die einzigen Säugetiere, bei denen die komplette Sequenz des MHC bekannt ist. Bei weiteren Säugern konnte der MHC bisher anteilig sequenziert werden. So existieren z. B. Daten der Klasse-I-Region des Schimpansen (ADAMS u. PARHAM 2001; ANZAI et al.
2003), ein Teil der Klasse-I-Region des Schweins (VELTEN et al. 1998, 1999; CHARDON et al.
2000) und fast die komplette Sequenz der Maus (AMADOU et al. 1999; KUMANOVICS et al.
2003).
Abbildung 7: Evolutionsverlauf des MHC (nach KULSKI et al. 2002)
2.3.3 Der MHC bei den Primaten
Bisherige Studien der MHC-Klasse-I-Gene zeigten, dass HLA-A, HLA-B und HLA-C orthologe Gene bei allen untersuchten Menschenaffen (Schimpansen, Gorillas und Orang-Utan) sowie HLA-A und HLA-B-orthologe Gene bei kleinen Menschenaffen (Gibbon) vorkommen (BOYSON et al.
1996).
DAZA-VAMENTA et al. (2004) veröffentlichten erst kürzlich die komplette MHC-Sequenz des Rhesusaffen. Im Gegensatz zum Menschen ist der MHC bei Macaca mulatta mit 5,3 Mb wesentlich größer und enthält 22 potentiell funktionsfähige Klasse-I-Gene anstelle von sechs wie beim Menschen. Es wurden mehrere verschiedene orthologe Gene zu HLA-A und HLA-B gefunden (2 Mamu-A-Gene und 19 Mamu-B-Gene). Homologe Gene zu den Klasse-Ib-Genen HLA-E und HLA- F wurden ebenfalls gefunden. Interessanterweise ist das HLA-G-orthologe Klasse-I-Gen auch mehrfach dupliziert (DAZA-VAMENTA et al. 2004; KULSKI et al. 2004). Ein orthologes Gen zu HLA-C konnte beim Rhesusaffen nicht lokalisiert werden, was dafür spricht, dass der Ursprung dieses Genes erst nach der Abspaltung der Menschenaffen (Orang-Utan, Gorilla, Schimpansen) und Menschen zu finden ist (ADAMS et al. 1999). Mensch und Rhesusaffe zeigen partielle Übereinstimmungen der funktionellen Gene des MHC. Große Unterschiede treten aber bei der Größe des MHC sowie bei der Anzahl der Gene und Pseudogene auf (DAZA-VAMENTA et al.
2004; KULSKI et al. 2004).
Anders als bei den Altweltaffen und Menschenaffen stehen die klassischen MHC-Klasse-I-Gene der Neuweltaffen eher in Beziehung zum nichtklassischen HLA-G-Lokus als zu den HLA-A oder HLA–
B-Loci (VOGEL et al. 1999). Als mögliche Erklärung wird ein sehr schneller „turnover“ der MHC- Klasse-I-Gene durch Deletionen oder Insertionen der alten Gene angenommen („birth and death Modell“). Als Ausnahme gelten hierbei die orthologen Gene der nichtklassischen MHC-Klasse-I- Gene HLA-E und HLA–F, die auch bei den Neuweltaffen hoch konserviert sind (WATKINS et al.
1990; KNAPP et al. 1998).
Die evolutionär am weitesten vom Menschen entfernten Primaten sind die Halbaffen (Strepsirrhini).
Bis heute ist nur wenig über die Struktur und Vielfalt des MHC der Halbaffen erforscht.
Evolutionäre Studien sind hauptsächlich über die MHC-Klasse-II-Gene publiziert (KUPFERMANN et al. 1999; KRIENER et al. 2000; GO et al. 2002). Evolutionsanalytische Untersuchungen weisen darauf hin, dass sich die DRB-Gene der Catarrhini, Platyrrhini und
Strepsirrhini unabhänging voneinander entwickelt haben (KUPFERMANN et al. 1999; KRIENER et al. 2000).
Die MHC-Klasse-I-Gene der Halbaffen entwickelten sich anscheinend sehr Ordnungs-spezifisch, weshalb sie bis heute in keine orthologe Beziehung zu den humanen HLA-Genen gesetzt werden konnten (FLÜGGE et al. 2002). Die Ergebnisse der Untersuchungen sechs verschiedener Klasse-I- cDNA-Sequenzen (FLÜGGE et al. 2002) sowie 40 weiterer Gen-Loci des MHC bei verschiedenen Lemuren (GO et al. 2003) bestätigen die Vielfalt, den Polymorphismus und die nicht vorhandene orthologe Beziehung zu den humanen HLA-Genen. Als Erklärung für die fehlende Orthologie werden in diesem Zusammenhang sehr häufig vorkommende Duplikationen herangezogen. Die MHC-Klasse-I-Gen-Loci der Halbaffen unterlagen demnach zahlreichen Veränderungen („birth and death“). Daraus resultiert eine Ordnungs-spezifische Zusammenstellung der Klasse-I-Gene und Paralogie zu bekannten MHC-Klasse-I-Genen anderer Ordnungen.
2.4
MIC-Gene (MHC-class-I-chain related genes)Die MIC-Gene wurden parallel von zwei Arbeitsgruppen entdeckt und als MIC (BAHRAM et al 1994) bzw. PERB11 (LEELAYUWAT et al.1994) beschrieben. Der Mensch besitzt sieben verschiedene MIC-Gene, MICA, MICB, MICC, MICD, MICE, MICF, MICG, von denen allerdings nur MICA und MICB exprimiert werden. Bei den anderen MIC-Genen handelt es sich um Pseudogene (SHIINA et al. 1999; THE MHC SEQUENCING CONSORTIUM 1999). Die Lage sämtlicher MIC-Gene ist auf die HLA-Klasse-I-Region zwischen BAT1 und dem HLA-F-Gen beschränkt (BAHRAM et al. 1994; SHIINA et al. 1999). In Anlehnung an die Klasse-I-Gene weisen auch die MIC-Gene mit bisher 54 beschriebenen Allelen für MICA und 17 Allelen für MICB einen hohen Grad an Polymorphismus auf (AHMAD et al. 2002).
Im Aufbau ähneln die MIC- den MHC-Klasse-I-Molekülen. Sie setzen sich aus drei extrazellulären Domänen (α1, α2, α3), einer transmembran- und einer zytoplasmatischen Region zusammen.
Anders als bei den Klasse-I-Molekülen besteht jedoch keine Assoziation mit β2-Mikroglobulin (GROH et al. 1996) und die Übereinstimmung der Aminosäuresequenz mit den Klasse-I-Genen beträgt maximal 15-35 %.
Anders als bei den klassischen MHC-Klasse-I-Genen werden die MIC-Gene nicht ubiquitär, sondern nur in bestimmten Geweben wie Epithelzellen und epithelialen Tumoren exprimiert (GROH et al. 1998, ZWIRNER et al. 1998, GROH et al. 1999). Das Vorkommen von MIC-RNA wurde allerdings noch in weiteren Organen wie der Lunge, den Testes, der Leber und dem Thymus beschrieben (LEELAYUWAT et al. 1994). Anhand von Hitzeschockexperimenten konnte gezeigt werden, dass die MIC-Expression stessinduzierbar ist (GROH et al. 1996, 1998). Die MIC- Moleküle interagieren mit dem NKG2D (natural killer group protein 2)-Rezeptor, der auf NK- Zellen und T-Zellen exprimiert wird (BAUER et al. 1999) und wodurch MIC exprimierende Zellen abgetötet werden können.
Aufgrund der MIC-Expression in Epithelzellen und der Lage des MICA-Gens zum HLA-B-Locus im MHC wurde eine gewisse Assoziation von MICA zu bestimmten Krankheiten vermutet, die genetisch in die HLA-B/MIC-Region kartieren. Besonders Erkrankungen der Haut, des Darmes und die Entstehung von Karzinomen wurden eingehend untersucht. Bei Erkrankungen wie Morbus Crohn (GLAS et al. 2001), Rheumatoider Arthrits (MARTINEZ et al. 2001), Morbus Addison (GAMBELUNGHE et al. 1999), Psoriasis (TAY et al. 2000), Typ I Diabetes mellitus (SHTAUVERE-BRAMEUS et al. 2002) oder ulzerativer Colitis ist eine eindeutige Verbindung hergestellt worden. Des weiteren konnte die Expression von MIC in Karzinomen der Brust, Lunge, Niere, Ovar, Prostata und Kolon (GROH et al. 1999) sowie in Zusammenhang mit der Abstoßung von Transplantaten (ZWIRNER et al. 2000) nachgewiesen werden.
Untersuchungsergebnisse zu MIC-Genen existieren auch bei Primaten. Interessanterweise konnten drei funktionelle MIC-Gene im Rhesusaffen identifiziert und als Mamu-MIC1, Mamu-MIC2 und Mamu-MIC3 bezeichnet werden (STEINLE et al. 1998; SEO et al. 1999). Daneben findet man weitere MIC-Gene, Mamu-MICD sowie mehrere Kopien des MICG-Gens, bei denen es sich wie beim Menschen um Pseudogene handelt (SEO et al. 2001; KULSKI et al. 2004). Eine strikte orthologe Beziehung zwischen den funktionellen MIC-Genen des Menschen und denen des Rhesusaffen wird allerdings für sehr unwahrscheinlich gehalten (SEO et al. 1999, 2001).
Genomische Analysen mittels PCR zeigten weiterhin, dass Rhesusaffen Polymorphismen hinsichtlich der Anwesenheit bzw. der Abwesenheit der funktionellen MIC-Gene aufweisen (FLÜGGE 2003).
2.5 Vergleich des MHC verschiedener Spezies; die Framework-Hypothese (AMADOU 1999)
Der direkte Vergleich des MHC von Mensch und Maus ließ erkennen, dass beim Vergleich der MHC-Region zwischen verschiedenen Spezies sowohl starke Ähnlichkeiten wie auch Unterschiede auftreten. Die Gene der MHC-Klasse-II-Region stellen sich als orthologe Gene dar, während die Gene der MHC-Klasse-I-Regionen paralog sind. Die Klasse-I-Gene haben sich im Laufe der Zeit durch Expansion und Deletion aus einem oder mehreren Ursprungsgenen verändert (AMADOU 1999).
Daher ist der direkte Vergleich der MHC-Klasse-I-Region zwischen verschiedenen Spezies sehr schwierig, wenn man sich ausschließlich auf die Klasse-I-Gene bezieht. Die zusätzliche Betrachtung der konservierten Ankergene (Nicht-Klasse-I-/Klasse-II-Gene) ermöglicht die Bildung eines Rahmens (framework), in dem die verschiedenen Klasse-I-Subregionen weiterhin an orthologen Positionen liegen. Anhand der Framework-Gene ist es daher möglich, physikalische Karten zu erstellen und den Aufbau der verschiedenen MHC zu vergleichen (AMADOU 1999).
3 Material
3.1 Chemikalien
Chemikalie Hersteller (Herstelleradressen s. Kap. 3.16) Agar Roth Agarose Biozym, Albumin, Bovine (BSA) Sigma
Ampicillin Sigma
Bacto-Hefe-Extrakt GIBCO BRL GmbH
Bacto Pepton GIBCO BRL GmbH
Bidestilliertes Wasser Merck
Borsäure Roth Bromphenolblau Serva Chloramphenicol Sigma Chloroform Merck
Dextran T 250 Roth
Dextransulfat Amersham Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma
Entwickler LX 24 Kodak
Essigsäure (100%) Roth
Ethanol Roth Ethidiumbromidlösung (EtBr) (1%) Roth
Ficoll 400 Amersham
Fixierer AL 4 Kodak
Formaldehyd (37%) Roth
Formamid Fluka
Glucose Merck Glycerin Merck
Hefeextrakt Roth Heringsspermien-DNA Roth
H2O Membra Pure
Isoamylalkohol Merck Isopropanol Merck Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) Biomol
Kaliumacetat Merck Kaliumchlorid Merck Kohlendioxid Vesper
Lambda-DNA MBI Fermentas
Magnesiumchlorid Invitrogen Magnesiumsulfat Merck Natriumacetat-Trihydrat Roth
Natriumbicarbonat Sigma Natriumchlorid Roth Natriumhydrogencarbonat, Roth
Natriumhydroxid Roth Natriumjodid Roth Nucleotide,
radioaktiv markiert ([α32P]dCTP)
Amersham
Ortho- Phosphorsäure Merck
Phenol Biomol Polyvinylpyrrolidon Merck
2-Propanol Roth Salzsäure, rauchend (37%) Roth
Sodium dodecyl sulfate (SDS ) (Natriumdodecylsulfat (10 %))
Roth
Select Peptone 140 Gibco BRL
Spermidin Merck Stickstoff Vesper Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Roth
Tris (99,9%) Roth 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid
(X-Gal)
Roth
Xylencyanol Merck
3.2 Stammlösungen und Puffer
Lösung / Puffer Zusammensetzung
Auftrags-Puffer (DNA) 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylencyanol 15 % Ficoll 400 50 mM EDTA, pH 8,0 Denaturierungslösung 1,5 M NaCl
0,5 M NaOH 50 x Denhardts-Lösung 1 % Ficoll 400
1 % Polyvinylpyrrolidon 1 % BSA (Fraktion V)
DNA-Lyse-Puffer 50 mM Tris-HCl
100 mM EDTA 0,5 % SDS
Kaliumacetat 3 M KAc
mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt
Lysis-Lösung I 50 mM Glucose
25 mM Tris-HCl pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 100 µg RNAse A
Lysis-Lösung II 0,2 M NaOH
1% SDS
Lysis-Lösung III 3 M KAc
mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt
Natriumacetat 3M NaAc
mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt Neutralisierungslösung 3 M NaAc
mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt 20 x SSC (Sodiumchlord sodium citrat ) 3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat
mit HCl auf pH 7,0 eingestellt 10 x TBE (Tris Borat EDTA)-Puffer 0,5 M Tris-Borat, pH 8,0
10 mM EDTA, pH 8,0 20 x Tris-Phosphat-Puffer 1,75 M Tris
40 mM EDTA
mit Phosphorsäure auf pH 7,8 eingestellt
3.3 Zusammensetzung von Nährmedien
3.3.1 Nährmedien
Die Nährmedien wurden anhand der Rezepte selbst hergestellt.
LB (Luria Bertani)- Medium 1 % Select Peptone 140 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl
(zusätzlich 1,5 % Agar für Platten)
SOB-Medium 2% Select Peptone 140
0,5 % Yeast Extract 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
SOC-Medium SOB-Medium 20 mM Glucose
3.3.2 Zusätze für die verschiedenen Nährmedien
Ampicillin 50 mg sterilgefiltertes Ampicillin pro Liter Medium bzw. Agar.
Chloramphenicol 20 mg sterilgefiltertes Chloramphenicol pro Liter Medium bzw. Agar.
3.4 Verwendete Kits
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems
Jetstar Plasmid Kit Genomed
JetSorb Gel Extraction Kit Genomed
Megaprime DNA Labeling System Kit Amersham
PCR Cloning Kit Qiagen
QIAgen Plasmid Maxi Kit Qiagen
3.5 Verwendete Enzyme
Alkalische Phosphatase Promega
BamHI EcoRI HindIII PstI
New England Biolabs (NEB) New England Biolabs (NEB) New England Biolabs (NEB) New England Biolabs (NEB)
Ribonuklease A (RNase) Roth
T4-DNA-Ligase New England Biolabs (NEB)
Taq-DNA-Polymerase Genecraft
3.6 Oligonukleotide
Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Primer
Primer-Bezeichnung Primer-Sequenz
Annealling- Temperatur(°C)
BAT1-5´ GAT TAT GGC AGA GAA CGA TG 50
BAT1-3´ TTC CTC TAC CGT GTC TGT TC 50
M13-20 TTG TAA AAC GAC GGC CAG TG 50
M13 rev GGA AAC AGC TAT GAC CAT GA 50
MHCcons-5´ ACC CTG AG TGC TGG GCC CT 50
MHCcons-3´ CGC CCA CTT CTG GAA GGT TC 50
MHC-Primates-5´ GCT CCC ACT CC(AC) TGA GGT ATT 50
Maki ut2 AAA TTT ATT TTC AAT T 50
MIC-Bakt. 5´ TAT GGT ACC GAG C(CT)C CAC AGT CTT CGT TA
55 MIC-Bakt. 3´ TAT AAG CTT TCA AGA GGG CAC AGG
GTG AGT
55
TCF19-5´ CCC ATG CTG CCC TGC TTC CA 52
TCF19-3´ GCT CAG TCT CAT CAT CCA GT 52
Für den Primer MHC-Primates 5´ wurde der Primer MHC cons-3´als Reverse-Primer verwendet.
3.7 Verwendete Hybridisierungsproben
Für die Analyse der CHORI-BAC-Bank (siehe Kap. 3.10) sowie der Southernblots (siehe Kap.
4.9.1) wurden verschiedene Hybridisierungsproben aus Plasmid-DNA hergestellt.
Die Hybridisierungsproben FLJ13158, CAT56, GNL1, TRIM39, TRIM26, TRIM15, TRIM10, PPP1R11 und MOG wurden von Herrn Dr. L. Walter (Abt. Primatengenetik des Deutschen Primatenzentrums, Göttingen; Abt. Immungenetik der Universität Göttingen) zur Verfügung gestellt. Die Herstellung der Hybridisierungsproben BAT1, TCF19 und Mimu-Klasse-I erfolgte anhand eigener Herstellung mittels PCR (siehe Kap. 4.13), Gel-Elektrophorese (siehe Kap. 4.5) und DNA-Extraktion (siehe Kap. 4.6). Detaillierte Beschreibungen der verwendeten Gene befinden sich in den Kapiteln 5.1, 5.2 und 5.3.
Tabelle 3: Übersicht der verwendeten Hybridisierungsproben Bezeichnung
der Probe
Herstellung Länge des
Fragments
FLJ13158 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau (siehe Kap. 4.4) mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
1200 bp
CAT56 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau (siehe Kap. 4.4) mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII (siehe Kap. 3.5) . Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
1000 bp
GNL1 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau (siehe Kap. 4.4) mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
300 bp
TRIM39 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau (siehe Kap. 4.4) mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
750 bp
TRIM26 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau (siehe Kap. 4.4) mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
500 bp
TRIM15 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau (siehe Kap. 4.4)mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
300 bp
TRIM10 Minipräparation der Probe (siehe Kap. 4.2.1) und anschließender Verdau mit den Restriktionsenzymen BamH1 und HindIII (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
650 bp
PPP1R11 Minipräparation der Probe und anschließender Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
550 bp
MOG Minipräparation der Probe und anschließender Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Kap. 3.5). Das Insert wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
800 bp
Tabelle 4: Übersicht der selbst hergestellten Hybridisierungsproben Bezeichnung
der Probe
Herstellung Länge des
Fragments Mimu-
Klasse-I
PCR-Amplifikation (siehe Kap. 4.13) einer Microcebus murinus cDNA mit den Primern MHC-Primates-5´ und Maki ut2 (siehe Kap. 3.6). Das Produkt wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
1200 bp
MIC PCR-Amplifikation (siehe Kap. 4.13) einer humanen cDNA mit den Primern MIC-Bakt.-5´ und MIC-Bakt.-3´ (siehe Kap.
3.6). Das Produkt wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap.
4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
800 bp
BAT1 PCR-Amplifikation (siehe Kap. 4.13) einer Lemur catta cDNA unter Verwendung der Primer BAT1-5´ und BAT1-3´ (siehe Kap. 3.6). Das Produkt wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und im Anschluss extrahiert (siehe Kap. 4.6).
1300 bp
TCF19 PCR- Amplifikation (siehe Kap. 4.13) aus einer L. catta cDNA mit den Primern TCF19-5´ und TCF19-3´ (siehe Kap. 3.6). Das Amplifikat wurde elektrophoretisch getrennt (siehe Kap. 4.5) und extrahiert (siehe Kap. 4.6).
700 bp
3.8 DNA-Längenstandards
DNA-Längenstandard Hersteller
GeneRuler-DNA-Ladder-Mix (100 bp- 10 kb) Fermentas GeneRuler-100bp-Ladder-Plus (100 bp-3 kb) Fermentas Lambda-DNA, HindIII geschnitten
(100 bp – 30 kb)
Fermentas
Eigene Bearbeitung der Lambda-DNA (siehe Kap. 4.4)
3.9 Vektoren
Vektor Hersteller
pDrive Qiagen
pGem-T-Vektor Promega
pTARBAC2.1 BACPAC Resources Center
pUC19 Fermentas
3.10 Genbank
Die in dieser Arbeit verwendete Bacterial Artificial Cromosome (BAC)-Bank stammt vom Children´s Hospital Oakland Research Institute (CHORI), (http://.bacpac.chori.org). Hierbei handelt es sich um die genomische Bank eines weiblichen Microcebus murinus (Tier Nr. 8), deren DNA aus der Niere gewonnen wurde. Die mittels einer Kombination aus EcoRI-Restriktionsenzym und EcoRI-Methylase geschnittene DNA wurde anschließend in einer Pulsfeld-Elektrophoresekammer aufgetrennt. Die Fragmente mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 210 kbp wurden in den Vector pTARBAC2.1 kloniert und in elektrokompetente E.coli DH10B Zellen transformiert. Die Klone wurden abschließend auf zwölf 22x22 cm große Nylon-high-density-Filter aufgebracht. Auf jeder Membran befinden sich insgesamt 18000 unterschiedliche Mausmaki BAC-Klone, jeweils in doppelter Ausführung. Das Herstellungsverfahren des Children´s Hospital Oakland Research Institutes richtete sich nach den Methoden von OSOEGAWA et al. (2001).
Tabelle 5: Übersicht über die verwendeten BAC-Bank-Filter der CHORI-257 Microcebus murinus BAC-Bank. Auf den Filtern sind die Nummer des Filter-Sets, das Herstellungsdatum und die Beschreibung des vorliegenden Filter-Sets angegeben. Jeder einzelne Filter besitzt eine Filter Nr. sowie einen Buchstaben in alphabetischer Reihenfolge, der für die Anzahl der bisher hergestellten Filter steht. Weiterhin befindet sich auf den Filtern ein Barcode, die BAC-Bank- Bezeichnung, die Anzahl der Kopien der Klone zur Positivkontrolle und der Nummernbereich, der zugehörigen 384-Well-Platten.
Filter-Set Herstellungsdaten Beschreibung 007541 10/10/02 - 14/10/02 CHORI-257 Teil 1
Filter Nr. Barcode BAC-Bank Kopie Nummernbereich der 384-Well-Platten 01E 039001 CHORI-257 R3 0001 bis 0048 02E 039025 CHORI-257 R3 0049 bis 0096 03E 039049 CHORI-257 R3 0097 bis 0144 04E 039073 CHORI-257 R3 0145 bis 0192 05E 039097 CHORI-257 R3 0193 bis 0240 06E 039121 CHORI-257 R3 0241 bis 0288
Filter-Set Herstellungsdaten Beschreibung 007564 10/16/02 - 14/21/02 CHORI-257 Teil 2 Filter Nr. Barcode BAC-Bank Kopie Nr.-Bereich der
384-Well-Platten 07D 039144 CHORI-257 R3 0289 bis 0336 08D 039168 CHORI-257 R3 0337 bis 0384 09D 039192 CHORI-257 R3 0385 bis 0432 10D 039216 CHORI-257 R3 0433 bis 0480 11D 039240 CHORI-257 R3 0481 bis 0528 12D 039264 CHORI-257 R3 0529 bis 0576
3.11 Verwendete BAC-Klone
Zur näheren Charakterisierung wurden BAC-Klone der BAC-Bank „CHORI 257“ (siehe Kap. 3.10) verwendet. Die BAC-Klone wurden direkt bei Dr. Pieter deJong, Children´s Hospital Oakland- BACPAC Resources, 747-52nd Street, OaklandCA 94609 USA bestellt.
Tabelle 6: Auflistung der bestellten BAC-Klone
44P11 240H13 221B24 037I21 392K18 498E13 422G15 556H07 493E20 029O11 081L19 174C23 157G04 175C24 434E12 147K20 184B19 323J17 331A17 415P14 452J17 439D18 094B22 575D18 488K09 507G24 508F20 570P20 558H23 558H24 200K19 067L17 531O12 559A16 550D16 549H13 538A17 534I09 336G23 153G20 157M09 456N07 389P05 570O05 487C11 465D12 088H06 434E12
398I08 097J24
Die Auswahl der BAC-Klone erfolgte anhand der Hybridisierungsergebnisse (siehe Kap. 5.5) mit den verschiedenen Hybridisierungssonden (siehe Kap. 5.2 u. 5.3).
3.12 Bakterienstämme und Bakterienkultur
Für die Transformationen (siehe Kap.4.18) wurden die E.coli-Stämme DH10B und TOP10 der Firma Invitrogen (siehe Kap. 3.16) verwendet.
3.12.1 Flüssignährmedien für Bakterien
Die Vermehrung der E.coli-Bakterien erfolgte in verschiedenen Flüssignährmedien (siehe Kap.
3.3.1). Die allgemeine Aufzucht der Bakterien wird in LB-Medium (siehe Kap. 3.3.1) aufgeführt, während zur Anzucht kompetenter Bakterien SOB-Medium (siehe Kap. 3.3.1) und für Transformationen SOC-Medium (siehe Kap. 3.3.1) verwendet wird.
Die Flüssignährmedien wurden bei 1,1 bar und 121°C mit einem Dampfdruckautoklaven 20 Minuten autoklaviert.
3.12.2 Festnährmedien für Bakterien
Die Herstellung von LB-Agar-Platten erfolgte durch die Zugabe von 15 g/l Agar (siehe Kap. 3.1) in das LB-Medium (siehe Kap. 3.3.1) und anschließendes Autoklavieren (siehe Kap. 3.12.1) Nachdem der LB-Agar auf ca. 55 °C abgekühlt und ein Selektionsantibiotikum (siehe Kap. 3.3.2) mit einer Endkonzentration von 50 mg/l Ampicillin bzw. 20 mg/l Chloramphenicol hinzugegeben wurden, wurden die Platten möglichst luftblasenfrei gegossen.
Für die Selektion rekombinanter Bakterien, die eine Insertion im Vektor tragen, wurden zusätzlich X-Gal (Endkonzentration 0,04 %) und IPTG (Endkonzentration 1 mM), gelöst in bidestilliertem Wasser, das als Induktor des ß-Galaktosidase-Gens dient, dem LB-Agar hinzugefügt. Die Vektoren tragen zusätzlich zu ihrem Gen für die Antibiotikaresistenz das lacZ-Gen, welches für eine Untereinheit der ß-Galaktosidase kodiert. Das Genprodukt ist dafür verantwortlich, dass das farblose X-Gal in einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Da die Polyklonierungsstelle des Vektors innerhalb des lacZ-Gens liegt, wird das Z-Gen durch eine Insertion inaktiviert. Kolonien, die ein Insert tragen sind daher weiß, während Kolonien, die nur den Vektor enthalten und damit ein funktionelles X-Gal-Gen tragen, blau gefärbt sind.
3.13 Computerprogramme
Die DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe des im Internet verfügbaren Programms BLASTN analysiert (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Das Programm BLAST 2 SEQUENCES diente dem Vergleich zweier Nukleotidsequenzen (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html). DNA-Repeats wurden für spezifische Untersuchungen der DNA-Sequenz mit Hilfe des Programms RepeatMasker maskiert (www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker). Die Erstellung des Genbaums erfolgte mit den Programmen ClustalX (Version 1.83) und die statistische Berechnung der synonymen und nicht-synonymen Austauschraten erfolgte mit Hilfe des Programms MEGA (Version2.0).
Nähere Informationen über die verwendeten Ankergene (Framework-Gene) sind im Internet auf der NCBI-Homepage unter dem Programm LocusLink (www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink) erhältlich.
3.13.1 Phylogenetische Stammbaumrekonstruktion
Das Programm ClustalX dient dazu, ein multiples alignment von verschiedenen Sequenzen durchzuführen sowie darauf aufbauend Homologien zwischen diesen Sequenzen zu berechnen und darzustellen. Das Prinzip basiert darauf, dass Sequenzen, die sich untereinander anpassen lassen (alignment), als Genbaum dargestellt werden können (SANKOFF 1975). Das Ziel dabei ist es, einen Genbaum zu erstellen, dessen benachbarte Gene einen minimalen evolutionären Abstand haben (minimum-evolution tree). Die Berechnung der evolutionären Abstände erfolgt mit Hilfe der neighbor-joining-Methode (SAITOU u. NEI 1987). Die Sequenzen werden paarweise so angepasst, dass sie den Aufzweigungen eines genetischen Baumes folgen. Es werden erst die am engsten verwandten Sequenzen verglichen und danach die weiter entfernt verwandten Sequenzen hinzugefügt. Basierend auf dem multiplen alignment wird anschließend ein Genbaum anhand des Internal-Branch-Tests, der in dem Software-Programm MEGA enthalten ist, berechnet. Die Längen des entstandenen Genbaumes sind hierbei ein Maß für die genetische Distanz der benachbarten Gene. Gewöhnlich wird eine Signifikanz (ab 95 %) von p < 0,05 bei 500 Wiederholungen durch einen Stern angegeben.
3.14 Einwegartikel
Artikel Typ Firma
Combitips plus 5 ml, 10 ml Eppendorf
Cryo Tube Vials 1,8 ml Nunc
Eppendorfreaktionsgefäße (E-Cup)
1,5 ml, 2,0 ml Sarstedt
Elektroporationsküvetten 2 mm PeqLab
