Genomische Analyse des BAT1 – TCF19 - Intervalls (Contig 1)

Zunächst konzentrierte sich die Arbeit auf die MHC-Klasse-I-Region, die beim Menschen, dem Rhesusaffen sowie bei der Ratte zwischen den Framework-Genen BAT1 und POU5F1 liegt. Im humanen MHC liegen in diesem Bereich die MHC-Klasse-I-Gene HLA-B und HLA-C sowie die MIC-Gene. Ist der MHC des Microcebus murinus ähnlich dem des Menschen aufgebaut, müssten zwischen den beiden Framework-Genen ebenfalls Klasse-I-Gene sowie MIC-Gene lokalisiert sein.

Es sollte herausgefunden werden, wie viele MHC-Klasse-I-Gene in dieser Region vorkommen und ob es sich um funktionsfähige Klasse-I-Gene oder Pseudogene handelt.

Im ersten Schritt wurde die BAC-Bank mit der BAT1-Probe, einem Gen, das am telomeren Ende der Klasse-III-Region lokalisiert ist, durchsucht. Im zweiten Schritt erfolgte das Screening mit der TCF19-Probe, einem Gen, dass beim Menschen ca. 500 kb von BAT1 und 600 bp von POU5F1 entfernt liegt (KRISHNAN et al. 1995 ).

Die Ergebnisse des BAC-Bank-Screenings mit den Proben MHC-Klasse-I, BAT1 sowie TCF19 wurden miteinander verglichen. Insgesamt hybridisierten 73 Klone mit der MHC-Klasse-I-Sonde (Anhang, Tab. 15), 24 Klone mit der BAT1-Sonde (Anhang, Tab. 16) und 15 Klone mit der TCF19-Sonde (Anhang, Tab. 17). Von den 73 MHC-Klasse-I-Klonen, hybridisierten 10 Klone mit der Sonde BAT1 und 8 Klone mit der Sonde TCF19. Des weiteren kamen 5 BAC-Klone vor, die mit allen drei Sonden hybridisierten, so dass man davon ausgehen konnte, dass diese BAC-Klone die komplette Klasse-I-Region zwischen den Framework-Genen BAT1 und TCF19 tragen. Es folgte

eine nähere Untersuchung der 5 dreifach positiven Klone (456N07, 570O05, 487C11, 556H07, 575D18) sowie 5 weiterer Klone, die entweder nur MHC-Klasse-I-positiv (465D12, 147K20, 398I08) oder MHC-Klasse-I- und BAT1-positiv (398P05) bzw. MHC-Klasse-I- und TCF19-positiv (97J24) waren (Anhang, Tab. 17-19).

Die Hybridisierungen (siehe Kap. 4.11) der angefertigten Southernblots bestätigen bis auf die Klone 389P05 und 97J24 die Ergebnisse des BAC-Banken-Screenings. Der BAC-Klon 97J24 zeigt bei den Hybridisierungen mit den Sonden MHC-Klasse-I-, BAT1 und TCF19 ein negatives Ergebnis.

Der Klon 389P05 zeigt zwar mit der MHC-Klasse-I-Sonde ein positives Ergebnis, jedoch nicht mit der BAT1-Sonde. Es wird angenommen, dass hier ein Fehler bei der Bestimmung der Klon-Koordinaten für die Bestellung vorliegt. Beide Klone wurden daher nicht weiter bearbeitet und sind nicht in der Abbildung 15 sowie in der Anlage aufgeführt.

In der Southernblot-Analyse hybridisieren die BAC-Klone 456N07, 570O05, 487C11, 556H07 und 575D18 mit der BAT1-Sonde. Es sind vier positive Genbanden mit den Längen von 10,0 kb, 8,0 kb, 5,9 kb und 1,8 kb erkennbar (Abb. 10). Bei der Southernblot-Hybridisierung mit der TCF19-Sonde stellen sich Genbanden bei 700 bp und 400 bp dar (Abb. 11). Mit der TCF19-Sonde reagieren die BAC-Klone 456N07, 570O05, 487C11, 556H07 und 575D18. Die fünf BAC-Klone, die anhand der positiven Hybridisierungsergebnisse mit den Sonden BAT1 und TCF19, dem ersten Contig zugewiesen werden können, zeigen im Southernblot jeweils eine MHC-Klasse-I-Bande, die in zwei verschiedenen Längen auftritt (Abb. 12). Bei dem Klon 556H07 liegt die positive Genbande bei 6,4 kb, während sie bei den anderen vier Klonen (456N07, 570O05, 487C11, 575D18) bei 7,2 kb vorkommt. Anhand des Ergebnisses wird geschlossen, dass es sich um einen Polymorphismus handeln muss und dass das für die Herstellung der BAC-Bank verwendete Tier an diesem Genort heterozygot ist.

Die BAC-Klone 456D12, 147K20 und 398I08 waren im Banken-Screening nur MHC-Klasse-I-positiv. Die Hybridisierungsmuster im Southernblot weichen erheblich von den Klonen ab, die in das Contig 1 eingeordnet wurden. Im Gegensatz zu den BAC-Klonen des ersten Contigs, zeigen sich vier, fünf oder sieben positive MHC-Klasse-I-Genbanden (Abb. 12 u. 30). Diese BAC-Klone können durch Southernblot-Hybridisierungen mit weiteren Framework-Genen in das Contig 4 eingeordnet (siehe Kap. 5.5.4) werden.

Neben der Untersuchung der MHC-Klasse-I-Gene von Microcebus murinus war ein weiterer Aspekt, herauszufinden, ob sich ebenfalls MIC-Gene in den Klasse-I-Regionen befinden. Diese

Untersuchung wurde ebenfalls mit Hilfe des Screenings der BAC-Bank „CHORI-257“ und der Southernblot-Analyse durchgeführt. Eine gesonderte Bestellung beim BACPAC Resourcen Center erfolgte nicht, da acht MIC-positive BAC-Klone aus den bisherigen Bestellungen vorlagen (487C11, 570O05, 575D18, 456N07, 556H07, 498E13, 174C23, 175C24). Es erfolgte eine Überprüfung im Southernblot und die BAC-Klone 487C11, 570O05, 575D18, 456N07, 556H07 und 498E13 bestätigen das Ergebnis des Banken-Screenings, während die Klone 174C23 und 175C24 negativ sind. Im Southernblot kann bei den Klonen, die dem ersten Contig zugeordnet werden (456N07, 570O05, 556H07, 487C11, 575D18), eine positive Genbande bei einer Länge von mehr als 23 kb identifiziert werden (Abb. 13). Das Hybridisieren der BAC-Bank sowie der Southernblots zeigt, dass bei Microcebus murinus mindestens ein MIC-Gen in der Nähe der MHC-Klasse-I-Gene lokalisiert sein muss. Detaillierte Informationen über das vorhandene MIC-Gen sollte die Sequenzierung des BAC-Klones 487C11 erbringen, die von Herrn Dr. Takashi Shiina (Tokai Universität School of Medicine Isehara, Japan) durchgeführt wurde. Der Vergleich der erhaltenen Sequenz mit bekannten Sequenzen aus der NCBI-Datenbank zeigt, dass es sich bei dem MIC-Gen um ein Pseudogen handelt. Eine detaillierte Darstellung der genomischen Struktur des BAT1-TCF19-Intervalls wurde auf der Basis der genomischen Sequenz dieses Intervalls vorgenommen und ist in Abb. 35 dargestellt.

Abbildung 10: Southernblot-Hybridisierung von BAC-Klonen der BAC-Bank „CHORI-257“

(M. murinus). MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten (siehe Kap. 4.4). Der aus diesen BAC-Klonen hergestellte Southernblot (siehe Kap.

4.9.1) wurde anschließend mit der BAT1-Probe (siehe Kap. 3.7 u. 5.3) hybridisiert (siehe Kap.

4.11). Links ist der Längenstandard angegeben. Rechts ist die Länge der hybridisierenden Restriktionsfragmente angegeben.

Abbildung 11: Southernblot-Hybridisierung von BAC-Klonen der BAC-Bank „CHORI-257“

(M. murinus). MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten (siehe Kap. 4.4). Der aus diesen BAC-Klonen hergestellte Southernblot (siehe Kap.

4.9.1) wurde anschließend mit der TCF19-Probe (siehe Kap. 3.7 u. 5.3) hybridisiert (siehe Kap.

4.11). Links ist der Längenstandard angegeben. Rechts ist die Länge der hybridisierenden Restriktionsfragmente angegeben.

Abbildung 12: Southernblot-Hybridisierung von BAC-Klonen der BAC-Bank „CHORI-257“

(M. murinus). Die BAC-Klone wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten (siehe Kap.

4.4). Der aus diesen BAC-Klonen hergestellte Southernblot (siehe Kap. 4.9.1) wurde anschließend mit der spezifischen MHC-Klasse-I-Probe (siehe Kap. 3.7 u. 5.2) hybridisiert (siehe Kap. 4.11).

Links ist der Längenstandard angegeben. Rechts sind die Längen der hybridisierenden Restriktionsfragmente des Contigs 1 angegeben. Die Klone 456D12, 147K20 und 398I08 wurden anhand weiterer Hybridisierungen dem Contig 4 (siehe Kap. 5.5.4) zugeordnet.

Abbildung 13: Southernblot-Hybridisierung von BAC-Klonen der BAC-Bank „CHORI-257“

(M. murinus). MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten (siehe Kap. 4.4). Der aus diesen BAC-Klonen hergestellte Southernblot (siehe Kap.

4.9.1) wurde anschließend mit der MIC-Probe (siehe Kap. 3.7 ) hybridisiert (siehe Kap. 4.11). Links ist der Längenstandard angegeben. Rechts ist die Länge der hybridisierenden Restriktionsfragmente angegeben.

Tabelle 9: Zusammenfassung der BAC-Klone, die dem Contig 1 zugeordnet werden konnten.

Die Tabelle beinhaltet die BAC-Bezeichnung, die Filter-Nr. der BAC-Bank „CHORI-257“ sowie die positiven Hybridisierungsergebnisse der BAC-Klone mit verschiedenen Proben im Southernblot.

Abbildung 14: Schematische Darstellung des Contigs 1 mit den sich überlappenden BAC-Klonen. Die Abfolge der Gene konnte aus dieser Analyse nicht geschlossen werden, erfolgte aber anhand der in Abb. 35 dargestellten Sequenzierungsergebnisse. Die Länge [kb] des hybridisierenden Klasse-I-positiven EcoRI-Fragmentes ist angegeben.