5 ERGEBNISSE
5.3 Herstellung von Hybridisierungssonden aus verschiedenen Framework- Genen
Für die Untersuchung, ob die MHC-Klasse-I-Gene beim Microcebus murinus an orthologen Positionen im Vergleich zum Menschen und anderen bisher untersuchten Säugern vorkommen, wurde die BAC-Bank im Anschluß an die MHC-Klasse-I-Hybridisierung mit verschiedenen Sonden ausgewähler Framework-Gene gescreent.
Die Proben für die Sonden der Gene BAT1 und TCF19 wurden anhand von spezifischen Primern (siehe Kap. 4.5) mittels PCR (siehe Kap. 5.13) gewonnen. Sämtliche weiteren Proben wurden von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellt.
Nähere Informationen zu den einzelnen Framework-Genen sind auf der NCBI-Internetseite (www.ncbi.nlm.nih.gov) zu finden.
BAT1
Das BAT1 (HLA-B associated transcript 1)-Protein ist ein DEAD-Box-Familienmitglied ATP abhängiger RNA-Helikasen. Das Gene kartiert an die Gene der MHC-Klasse-III- / Klasse-I-Region.
Das BAT1-Protein ist in zahlreiche Zellfunktionen wie z.B. der Initiation der Translation, RNA-Spleißen und dem Zusammenbau der Ribosomen eingebunden. Auch bekannte Gene wie z.B. für die Tumor Nekrose Faktoren (TNFα und TNFβ) sowie für das Hitzeschock-Protein HSP70 liegen in dieser Region (SPIES et al. 1989). BAT1 ist ein hoch konserviertes Gen, erstreckt sich über 10 kb und besteht aus 10 Exons, die ein 428 Aminosäure langes Protein kodieren (PEELMAN et al.
1995). Man vermutet, dass das Protein als negativer Entzündungsregulator fungiert (ALLCOCK et al. 2001) und in Zusammenghang mit der Erkrankung der Rheumatoiden Arthritis steht.
Die in der Abteilung Immungenetik bereits vorhandenen BAT1-Primer wurden verwendet, um an der cDNA eines Lemur catta eine PCR durchzuführen. Das erhaltene PCR-Produkt umfasst 1300 bp und wurde zur Überprüfung ansequenziert und anschließend als Gen-Sonde eingesetzt.
POU5F1
POU5F1 (POU domain, class5, transcription factor 1), alternativ auch OCT3 (Octamer-binding transkription faktor 3), OTF3, OCT4 oder OTF4 bezeichnet, ist ein Gen, das einen Transkriptionsfaktor kodiert, der eine POU- sowie eine Homeodomäne besitzt (SCHÖLER et al.
1990). POU-Domänen-haltige Proteine sind wichtige Regulatoren bei der gewebespezifischen Genexpression von lymphoiden und undifferenzierten pluripotenten Zellen im frühen embryonalen Gewebe und in den Keimzellen (ROSNER et al. 1991). POU5F1 liegt in der MHC-Klasse-I-Region beim Menschen ca. 100 kb telomerwärts von HLA-C entfernt. Es besteht aus fünf Exons und umfasst eine Größe von 7 kb (TAKEDA et al. 1992).
Die Gensonde für das Banken-Screening wurde mittels PCR an der cDNA eines Lemur catta hergestellt (siehe Kap. 4.5 u. Kap. 4.6). Das erhaltene PCR-Produkt wies eine Länge von 350 bp auf.
TCF19
Der Transkriptionsfaktor 19 (TCF19) ist ein Gen, dessen Funktion nur teilweise bekannt ist. TCF19 ist beim Menschen ca. 130 kb telomerwärts von HLA-C lokalisiert und ca. 600 bp von POU5F1 entfernt (KRISHNAN et al. 1995). Aufgrund seiner Wachstumsregulation wird dieses Gen, wie
auch die Histone, als „spätes Gen“ bezeichnet und kodiert Proteine des DNA-Synthese-Apparates.
Es wird in Betracht gezogen, dass es einen neuen Transaktivierungs-Faktor kodiert, der eine wichtige Rolle in der Transkription von Genen spielt, die für die Weiterentwicklung späterer Stadien des Zell-Zyklus erforderlich sind (KU et al. 1991).
Die verwendete Probe wurde mittels PCR (siehe Kap. 4.6) gewonnen, wobei der 5´-Primer von der Ratte und der 3´-Primer vom Menschen stammt (siehe Kap.4.5). Das erhaltende Fragment umfasst auf cDNA-Ebene des L. catta eine Länge von 700 bp.
GNL1
Das Guanine nucleotide-binding-protein-like1 (GNL1)-Gen liegt beim Menschen in der MHC-Klasse-I-Region und besitzt einen hohen Grad an Homologie zum orthologen Gen der Maus und der Ratte. GNL1 liegt ca. 2 kb centromerwärts von E und telomerwärts von B und HLA-C entfernt. Wie auch andere Framework-Gene ist dieses Gen während der Evolution sehr konserviert (VERNET et al. 1994). Die alternative Bezeichnung dieses Genes ist HSR1. Die Ratten-Probe stammt aus der Abteilung Immungenetik und ist ca. 200 bp lang.
CAT56
CAT56 oder auch PRR3 (proline-rich 3) ist ein Gen mit einem Proteinprodukt, dessen Funktion bisher nicht bekannt ist. Die Ratten-Probe stammt aus der Abteilung Immungenetik und ist ca. 1 kb lang.
TRIM39
Das Tripartite motif-containing 39 oder auch TFP (testis abdundant finger protein) bzw. RNF23 (Ring finger protein 23) genannte Gen gehört zu den Ring-Finger-Proteinen, die eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung, Entwicklung, Onkogenese und Apoptose spielen. Die Ring-Finger Domänen sind bei der Protein-Protein-Interaktion beteiligt und binden typischerweise Zink. Sie unterscheiden sich von den Zink-Finger-Proteinen in der Sequenz und in der Struktur. Das kodierte Protein besteht aus 519 Aminosäuren, das eine RING finger Box, eine coiled-coil Domäne und eine C-terminale Domäne besitzt (ORIMO et al. 2000). Die Ratten-Probe stammt aus der Abteilung Immungenetik und ist 750 bp lang.
TRIM26
TRIM26 (Tripartite motif-containing 26) bzw. ZNF173 (Zinc finger protein 173) oder AFP (Acid finger protein) ist ein Mitglied der TRIM-Familie. Das Gen liegt in der MHC-Klasse-I- Region und besteht aus drei Zink-Bindungs-Domänen, einer RING-BOX-Domäne und einer coiled-coil-Domäne. Die zwei Cystein- und Histidin-reichen Domänen sind charakteristisch für metallabhängige, DNA bindende Proteine und lassen daher eine DNA-Bindungsaktivität annehmen.
Die coiled-coil-Domäne dagegen könnte eine Dimerisation fördern. Das Protein kommt, in Verbindung mit zytoplasmatischen Elementen, im Zell-Zytoplama vor. Die Funktion ist allerdings noch unbekannt. Desweiteren enthält das Protein vor dem Carboxy-Terminus eine Polyglutaminsäure-Region, woher auch der Name AFP stammt. Das Gen wird in vielen Geweben exprimiert und ist in den kodierenden Regionen hoch konserviert (CHU et al., 1995). Die Ratten-Probe stammt aus der Abteilung Immungenetik und umfaßt 500 bp.
TRIM10
Das Gen TRIM10 (Tripartite motif- containing 10) bzw. RNF9 (Ringfinger protein 9) gehört ebenfalls der TRIM-Familie an. Der Aufbau ähnelt dem von TRIM15 und es kommen zwei verschiedene Isoformen vor. Anhand von Studien, die an der Maus durchgeführt wurden, wird angenommen, dass das Protein eine Rolle in der Differenzierung der Erythrozyten spielt (HENRY et al. 1997, HARADA et al. 1999).
Das verwendete Produkt ist ein 650 bp großes Fragment und wurde von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellt.
TRIM15
Das Tripartite motif-containing 15-Gen, oder auch ZNFB7 (Zinc finger binding protein 7) bzw.
RNF93 (Ring finger protein 93) genannt, gehört auch zur TRIM-Familie. Das TRIM-Motiv beinhaltet drei Zink-Bindungs-Domänen, eine RING-A- oder eine RING-B-BOX-Domäne und eine coiled-coil-Region. Es ist bekannt, dass sich das Protein im Zytoplasma der Zelle befindet und dass es aufgrund alternativen Spleißens zwei Isoformen gibt, deren Funktion jedoch noch nicht geklärt werden konnte.
Die Ratten-Probe umfasst 300 bp und wurde von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellt.
PPP1R11
Das Gen PPP1R11 (Protein phosphatase 1, regulatory subunit 11) hat die alternativen Bezeichnungen TCTEX5 (t-complex-associated-testis-expressed 5) und HCGV (Hämochromatosis candidate Gene V).
Das Gen gehört zu den t-complex testis-expressed genes (EL KAHLOUN et al. 1993, AMADOU et al. 1995), liegt in der MHC-I-Region, beim Menschen 150 kb centromerwärts vom HLA-A-Gen und kodiert ein 126 Aminosäure-Polypeptid (GIFFON et al. 1996). Die Funktion ist weitestgehend unbekannt. Man weiß allerdings, dass das Gen einen spezifischen Inhibitor des Proteins
„Phosphatase-1“ (PP1) mit unterschiedlicher Sensitivität gegen die metallunabhängigen und metallabhängigen Formen von PP1 kodiert (ZHANG et al. 1998).
PPP1R11 scheint ein weit verbreitetes Gen innerhalb der Evolution zu sein, denn DNA-Fragmente findet man in den verschiedensten Tierarten wie z.B. in Primaten, Ratten, Hunden, Rindern und Hasen (GIFFON et al. 1996).
Das verwendete Gen stammt von einer Ratte, wurde von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellt und ist 550 bp lang.
MOG
Das Myelin-Oligodendrocyten-Glykoprotein (MOG) kommt in myelinhaltigen Oligodendrocyten und an der externalen Myelin-Scheide im zentralen Nervensystem vor. Das kodierte Myelin-Protein wird erst spät in der embryonalen Entwicklung gebildet, so dass anhand der Lokalisation und der späten Bildung davon ausgegangen wird, dass es eine wichtige Rolle in den letzten Stadien der Myelinisierung spielt. Das Gen liegt am distalen Ende der MHC-Klasse-I-Region, beim Menschen 60 kb teleomerwärts von HLA-F entfernt (PHAM-DINH et al. 1995) und ist aus 8 Exons sowie 7 Introns zusammengestzt (ROTH et al. 1995). Die Introngröße variiert zwischen 242 und 6.484 bp.
Ebenfalls enthält dieses Gen mehrere repetitive Elemente wie z.B. 14 Alu-Sequenzen und liegt aufgrund von alternativen Spleißens in 6 verschiedenen Transkripten vor. (PHAM-DINH et al., 1995). Im Bereich der Autoimmunerkrankungen des ZNS hat das MOG-Protein eine wichtige Antigen-Funktion bei Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose und der Eperimentellen Autoimmunen Encephalomyelitis (EAE). Die von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellte Ratten-Probe besitzt eine Länge von 800 bp.
SACM2L
WALTER und GÜNTHER (1998) entdeckten bei der Sequenzierung der centromeren MHC-Region ein neues Ratten-Gen, das ebenfalls beim Menschen und der Maus hochkonserviert ist. SACM2L (suppressor of actin mutations 2 like) hat eine 20 %ige Identität zu Sac2 (suppressor of actin mutation-2) von Saccharomyces cerevisiae. Ein 3 kb großes Transkript konnte mit Hilfe von Northern Blot- Analysen in mehreren Organen nachgewiesen werden.
Die Ratten-Probe umfasst 1,8 kb und wurde von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellt.
RING1
Bei RING1 (Ring-finger-protein 1) handelt es sich um ein Mitglied der Ring-Finger-Familie, das in der erweiterten MHC-Klasse-II-Region liegt. Das Polypeptid besitzt eine Ring-Domäne, eine Zink-Finger-Domäne, bindet DNA oder Zink und kann als transkriptionaler Repressor fungieren (LOVERING et al.1993; SATIJN et al. 1997 ).
Die Probe mit einer Länge von 1 kb wurde von der Abteilung Immungenetik zur Verfügung gestellt.