Übertragung von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose

Nukleinsäuren, die mit Hilfe von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch die Gelelektrophorese der Länge nach getrennt wurden, können mit Hilfe eines Kapillarblots aus einem Gel auf einer Membran fixiert werden. Wenn es sich um DNA handelt, wird dieser Vorgang als Southernblot bezeichnet. Der gleiche Vorgang wird als Northern Blot bezeichnet, wenn es sich um RNA handelt und Western Blot, wenn es sich um Proteine handelt.

Die hauptsächlich verwendeten Membranen bestehen entweder aus Nitrocellulose oder Nylon. Die Wahl, welche Art der Membran verwendet werden soll, richtet sich nach dem Zweck des Versuches. Der Kapillarblot wird so aufgebaut, dass aus einer Wanne, die mit 20 x SSC-Puffer (siehe Kap. 3.2) gefüllt ist, der Puffer aufgrund der Kapillarkräfte durch das Gel und durch die

Membran in gestapelte Whatman-Papiere (Blotting-Papiere) und anschließend in einen Stapel Papiertücher gesogen werden. Die Nukleinsäuren werden aus dem Gel heraus mitgesogen. Die DNA bindet kovalent an die Nylonmembran, während sie an der Nitrocellulose nur fest haftet und daher bei jeder Hybridisierung (siehe Kap. 4.11) ein Teil verloren geht. Abschließend wird die DNA entweder durch Hitze (80°C) oder durch UV-Strahlung (30 Sekunden bei 120000 µJ) auf der Membran fixiert.

4.9.1 Transfer von DNA aus Agarosegelen – Southernblot (SOUTHERN 1975)

Die Proben werden auf ein Tris-Phosphat-Gel aufgetragen und bei einer Spannung von 50 V über Nacht aufgetrennt.

Nach der Gelelektrophorese wird das Agarose-Gel (siehe Kap. 4.5) unter UV-Licht passend zugeschnitten und die Längenstandards (siehe Kap. 3.8) werden markiert, indem an den Fragmentgrößen kleine Dreiecke aus dem Gel herausgeschnitten werden oder ein Lineal als Markierung an das Gel gelegt wird. Anschließend wird das Gel fotografiert.

Als nächster Schritt wird das Gel für ca. eine halbe Stunde in H2O gewaschen, um das Ethidiumbromid herauszuwaschen, bevor es für 20 Minuten in einem Säurebad aus 250 mM HCl depuriniert. Nach Ablauf der Zeit gibt man das Gel für 25 Minuten in eine Alkalisierungslösung, durch die die DNA denaturiert wird, und Einzelstränge entstehen. Damit die DNA-Denaturierung unterbrochen wird, gibt man das Gel abschließend für mindestens 30 Minuten in eine Neutralisierungslösung.

Mit dem so behandelten Gel wird nun der Southernblot (SOUTHERN 1975; SAMBROOK et al.

1989) aufgebaut. Dazu füllt man eine Plastikwanne mit 20 x SSC (siehe Kap. 3.2) und deckt diese mit einer Glasplatte ab. Eine aus Whatmanpapier zurechtgeschnittene Transferbrücke wird in die 20 x SSC-Lösung eingetaucht und so auf die Glasplatte gelegt, dass die Enden in der Lösung verbleiben. Mit Hilfe einer Glaspipette wird das Whatmanpapier geglättet, um zu vermeiden, dass Luftblasen den DNA-Fluss behindern. Auf die Transferbrücke plaziert man das Gel und entfernt erneut vorsichtig die Luftblasen. Zurechtgeschnittene, mit Wasser befeuchtete Nitrozellulose sowie drei Lagen Whatmanpapier (Gel-Blotting-Papier) und eine dicke Schicht Saugtücher werden direkt auf das Gel gelegt. Der Bereich der Glasplatte um das Gel wird mit Haushaltsfolie abgedeckt, so

dass keine Transferlösung seitlich am Gel vorbei gelangen kann. Die Dauer des Transfers beträgt mindestens 12 Stunden, weshalb dieser in der Regel über Nacht erfolgt.

Nach dem Blotten werden die Lage der Geltaschen sowie die Längenstandards auf der Membran eingezeichnet. Um eventuelle Agarosereste zu entfernen, spült man den Blot in 2 x SSC und trocknet ihn dann bei Raumtemperatur mindestens 30 Minuten. Die Fixierung der DNA auf der Membran erfolgt zwischen 2 Lagen Whatmanpapier (Gel-Blotting-Papier), entweder für 1 Stunde durch Hitze (80°C) oder für 30 Sekunden mit UV-Licht bei 120000 µJ.

Hybridisiert man anschließend den Southernblot, können die einzelnen DNA-Fragmente mit verschiedenen Sonden nachgewiesen werden (siehe Kap. 4.11).

4.9.2 Herstellung von DNA dot blots (KAFATOS et al. 1979)

Diese Technik ermöglicht eine Art „Vorscreening“, bevor aufwändigere Southernblots angefertigt werden.

Auf einer Nitrocellulosemembran werden kleine Felder, z. B. in Form von kleinen Kreisen, aufgezeichnet. 25 ng in Wasser gelöste DNA werden 5 Minuten bei 95 °C denaturiert, um sicherzustellen, dass die DNA in Einzelsträngen vorliegt. 1–3 µl DNA werden anschließend direkt auf die Membran aufgetragen. Nachdem die Probe auf der Membran getrocknet ist, wird sie für 30 Sekunden bei 120000 µJ mit UV-Licht fixiert und anschließend mit der entsprechenden Probe hybridisiert (siehe Kap. 4.11).

4.10 Markierung mittels "Random-priming" Reaktion (FEINBERG u.

VOGELSTEIN 1983)

Die Methode der radioaktiven Markierung mittels "random priming" basiert auf der Grundlage, dass eine doppelsträngige Template-DNA denaturiert und mit nach dem Zufallsprinzip gefertigten Nonanukleotiden hybridisiert wird. Die Oligonukleotide lagern sich an verschiedene Stellen der Template-DNA an und dienen der Klenow-DNA-Polymerase als Primer. Die Polymerase

synthetisiert, beginnend an den Primer-Template-Komplexen, den komplememtären DNA-Strang, wobei sie radioaktiv oder nicht radioaktiv markierte Nukleotide einbaut.

Aufgrund dieser Art der Markierung sind anschließend alle Bereiche des Templates in einem Fragment-Mix vorhanden. Gleichzeitig wird ein Teil amplifiziert, da die zuerst synthetisierten Stränge von der folgenden Polymerase wieder verdrängt und dadurch die DNA mehrfach abgelesen werden kann (FEINBERG u. VOGELSTEIN 1983).

Zur Herstellung der radioaktiven Sonde wird das "Megaprime DNA Labelling System"

Hybridisierungs-Kit der Firma Amersham verwendet.

Während dieser Arbeit wurden die Hybridisierungssonden nach zwei verschiedenen Protokollen hergestellt. Bei dem ersten Protokoll werden für einen 50 µl Reaktionsansatz 50-100 ng Template-DNA, 5 µl Primer-Lösung und ad 30 µl bidestilliertes Wasser in ein Eppendorfgefäß gegeben. Der Ansatz wird bei 100 °C 5 Minuten denaturiert, auf Eis abgekühlt und 10 µl Puffer-Lösung, 2 µl Klenow-DNA-Polymerase und 50 µCi [α³²P] dCTP (siehe Kap. 3.1) hinzupipettiert. Nach kurzem Anzentrifugieren inkubiert die Probe für die DNA-Synthese 20-30 Minuten bei 37 °C.

Anschließend wird der Ansatz ein weiteres Mal für 5 Minuten denaturiert und direkt der Hybridisierungs-Lösung hinzugegeben.

4.11 Hybridisierung membrangebundener Nukleinsäuren

Der eigentlichen Hybridisierung der BAC-Bank-Filter (siehe Kap. 3.10) sowie der Southernblots geht eine Prähybridisierung voraus, die dazu dient, Anlagerungen der Proben an unspezifische Bindungsstellen bei der Hybridisierung mit der radioaktiven Sonde zu vermeiden.

Die Membran wird zur Prähybridisierung mit 2 x SSC (siehe Kap. 3.2) benetzt und anschließend unter Verwendung einer Pipette, die Nukleinsäureseite nach innen gerichtet, luftblasenfrei in einen Hybridisierungsroller (siehe Kap. 3.15) gegeben. 600 µl denaturierte Heringsspermien-DNA (Endkonzentration 4 mg/ml) und 10 ml 60 °C warmer Hybridisierungspuffer müssen pro Roller hinzugegeben werden, bevor dieser ca. 2 Stunden bei 60 °C in einem Hybridisierungsofen prähybridisiert.

Der Membran wird die radioaktiv markierte Probe (siehe Kap. 4.10) nach 5 minütiger Denaturierung und kurzem Anzentrifugieren (30 Sekunden bei 21633 x g) hinzugefügt. Die

Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 60°C. Im Anschluss an die Hybridisierung wird die Membran aus dem Roller erntfernt und zweimal 30 Minuten in 2 x SSC mit 0,1 % SDS (siehe Kap.3.1) gewaschen, um unspezifisch gebundene radioaktiv markierte DNA zu entfernen.

Wenn die Restaktivität ausreichend abgewaschen wurde, werden die noch feuchten Membranen in Frischhaltefolie eingeschlagen und in eine mit Isopropanol gereinigte Autoradiographiekassette (siehe Kap. 3.15) gelegt.