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„Mineralstoff-, Spurenelement- und Vitamingehalte im Blutserum bei erstlaktierenden Kühen (Deutsche
Holstein) in Abhängigkeit von deren Versorgungsniveau“
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Silke Öhlschläger aus Neustadt am Rbg.
Hannover 2006
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H. Scholz 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. R. Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2006
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhangsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht... 3
2.1 Definition Referenzwert...3
2.2 Voraussetzungen zur Ermittlung von Referenzwerten ...4
2.3 Berechnung von Referenzwerten ...5
2.4 Verschiedene Referenzwerte...9
2.5 Nutzung von Referenzwerten...12
2.6 Metabolische Profiltests...13
2.7 Einflussfaktoren auf Blutkonzentrationen ...14
2.7.1 Klima, Jahreszeit und Haltungsform...15
2.7.2 Tageszeit ...16
2.7.3 Probenbehandlung...18
2.7.4 Rasse ...18
2.7.5 Alter ...19
2.7.6 Laktationsstadium ...20
2.7.7 Blutentnahmeort...21
2.8 Bedeutung von ausgewählten Blutparametern im Stoffwechsel und deren Abhängigkeit von der Versorgung ...21
2.8.1 Bedarfs- und Versorgungsempfehlungen der Mengen- und Spurenelemente ...21
2.8.2 Bedeutung von ausgewählten Mengenelementen im Stoffwechsel und deren Abhängigkeit von der Versorgung ...23
2.8.2.1 Calcium ... 23
2.8.2.2 Magnesium ... 25
2.8.2.3 Phosphor ... 27
2.8.3 Bedeutung von ausgewählten Spurenelementen im Stoffwechsel und deren Abhängigkeit von der Versorgung ...30
2.8.3.1 Kupfer ... 30
2.8.3.2 Zink ... 32
2.8.4 Bedeutung von ausgewählten Vitaminen im Stoffwechsel und deren Abhängigkeit von der Versorgung ...36
2.8.4.1 ß-Carotin und Vitamin A... 36
2.8.4.2 Vitamin E...38
2.8.5 Parameter der Protein- und Energieversorgung...41
2.8.6.1 Gesamtbilirubin ... 43
2.8.6.2 Leberenzyme... 43
2.9 Aussagekraft von Blut als Untersuchungsmaterial ...44
3 Material und Methoden... 48
3.1 Versuchsübersicht ...48
3.2 Versuchstiere...49
3.3 Haltung...49
3.4 Verwendete Futtermittel ...50
3.4.1 Grundfutter...50
3.4.2 Kraftfutter ...50
3.4.3 Verdaulichkeitsbestimmung ...52
3.4.4 Wasser...53
3.5 Probenentnahme und chemische Analysen...53
3.5.1 Futterproben...54
3.5.1.1 Probengewinnung ... 54
3.5.1.2 Probenanalytik ... 55
3.5.1.3 Rohnährstoffgehalte ... 55
3.5.1.4 Energiegehalte ... 56
3.5.1.5 Mengen- und Spurenelementgehalte... 57
3.5.2 Milchproben...58
3.5.3 Pansensaftproben ...59
3.5.4 Blutproben...60
3.5.4.1 Probengewinnung ... 60
3.5.4.2 Probenanalytik ... 61
3.6 Mathematische und statistische Auswertung ...64
4 Ergebnisse... 67
4.1 Versuchsverlauf ...67
4.1.1 Versuchsdauer...67
4.1.2 Versuchstiere...67
4.2 Futter- und Nährstoffaufnahme...68
4.2.1 Grundfutter (GF)...68
4.2.2 Kraftfutter (KF)...69
4.2.3 Mittlere Energie- und Proteinaufnahmen...71
4.2.4 Mineralstoffaufnahmen...72
4.2.5 Lebendmasseentwicklung ...73
4.3 Ergebnisse der Milchuntersuchungen ...75
4.3.1 Milchmenge ...75
4.3.2 Milchfett...76
4.3.3 Fett-korrigierte-Milchmenge (FCM) ...77
4.3.4 Protein, Laktose, Harnstoff und Zellzahl...77
4.3.5 Fettsäurenmuster der Milch ...78
4.4 Ergebnisse der Pansensaftuntersuchungen...79
4.4.1 Unfistulierte Tiere...79
4.4.2 Fistulierte Tiere...80
4.5.2.1 Mengenelemente... 86
4.5.2.2 Spurenelemente ... 87
4.5.2.3 Vitamine ... 89
4.5.2.4 Parameter der Protein- und Energieversorgung ... 90
4.5.2.5 Leberparameter... 92
4.5.3 Berechnung von Referenzwerten aus dem Datenmaterial der eigenen Untersuchung ...95
5 Diskussion ... 99
5.1 Anmerkungen zur Versuchsmethodik...99
5.2 Beurteilung des Einsatzes von Mineralfuttermitteln...99
5.3 Einfluss der Fütterung auf die Laktationsleistung ...100
5.4 Tageszeitliche Schwankungen der Blutparameter bei ad libitum Fütterung ...103
5.5 Einfluss der Fütterung auf die gemessenen Blutparameter...104
5.5.1 Calcium ...104
5.5.2 Magnesium...105
5.5.3 Phosphor ...107
5.5.4 Kupfer ...108
5.5.5 Zink ...110
5.5.6 ß-Carotin und Vitamin A ...111
5.5.7 Vitamin E ...113
5.5.8 Gesamteiweiß und Harnstoff ...114
5.5.9 ß-HBS ...115
5.5.10 Parameter des Leberstoffwechsels...116
5.6 Beurteilung der errechneten Referenzwerte...118
6 Schlussfolgerungen ... 123
7 Zusammenfassung... 125
8 Summary... 128
9 Literaturverzeichnis... 131
10 Anhang ... 160
Abbildung 2: Grafische Darstellung der Vertrauensbereiche (Konfidenzintervalle) in
Abhängigkeit von der Stichprobenanzahl (nach IFCC 1983) ...8 Abbildung 3: Trockensubstanzaufnahme (T-Aufnahme, x ± s von jeweils 10 Tagen) aus
dem Grundfutter (GF) beider Gruppen in kg/Tag ...69 Abbildung 4: Trockensubstanzaufnahme (T-Aufnahme, x± s von jeweils 10 Tagen) aus
dem Kraftfutter (KF) beider Gruppen in kg/Tag...70 Abbildung 5: Trockensubstanzaufnahme (T-Aufnahme, x ± s von jeweils zehn Tagen) aus
Grund- und Kraftfutter (T-Aufnahme gesamt) beider Gruppen in kg/Tag ...71 Abbildung 6: Lebendmassen (x± s von jeweils zehn Tagen) beider Gruppen im Verlauf der
Laktation in kg...74 Abbildung 7: Milchmenge (x± s von jeweils zehn Tagen) beider Gruppen im Verlauf der
Laktation in kg/Tag ...75 Abbildung 8: Milchfettgehalte (x± s von jeweils zehn Tagen) beider Gruppen im Verlauf
der Laktation in % ...76 Abbildung 9: Fett-korrigierte-Milchmenge (x± s von jeweils zehn Tagen) beider Gruppen
im Verlauf der Laktation in kg/Tag...77 Abbildung 10: Phosphorkonzentrationen im Tagesverlauf von vier Tieren in der 8. Woche
post partum ...85 Abbildung 11: Kupferkonzentrationen (x± s) im Serum der Gruppen im Verlauf der Laktation...
...87 Abbildung 12: Zinkkonzentrationen (x± s) im Serum der Gruppen im Verlauf der Laktation ...88
Abbildung 13: ß-Carotin-Konzentrationen (x± s) im Serum der Gruppen im Verlauf der
Laktation...89
bedarfsdeckende Versorgung, b = bedarfsdeckende Versorgung mit Magnesium, 1 = Hypomagnesämie, 2 = Normomagnesämie, 3 = Hypermagnesämie)...106
Tabelle 2: Darstellung einiger Referenzwerte im Blutserum des Rindes aus verschiedenen
Quellen ...12 Tabelle 3: Mittlere Konzentrationen von Calcium, Magnesium und Phosphor im Blut (mmol/l)
von 126 Milchkühen in Abhängigkeit von der Jahreszeit (CLAYPOOL 1976)...16 Tabelle 4: Zeitpunkte der minimalen und maximalen Blutkonzentrationen von Calcium,
Magnesium und Phosphor im Rinderblut während des Tages (UNSELM und
RAPPEN 1968) ...17 Tabelle 5: Mittlere Magnesium- und Phosphorkonzentrationen (mmol/l) im Rinderblut
(n = 393) in Abhängigkeit von der Milchleistung (kg/Tag) (KANTER 1986)...20 Tabelle 6: Unterschiedliche Versorgungsempfehlungen wissenschaftlicher Gesellschaften für
Milchkühe mit ausgewählten Mengen- und Spurenelementen (in g bzw. mg/kg T) ...22 Tabelle 7: Regulation des Calciumhaushalts (nach BLUM 1982)...24
Tabelle 8: Mittlere Calciumkonzentration im Blutserum von Kühen in Beziehung zur Calciumversorgung unter Berücksichtigung des Bedarfs (BUHM und
GRÜNDER 1985) ...25 Tabelle 9: Verlauf der Magnesiumkonzentration im Blut von Schafen (n = 6) über 6 Tage
(in % der Ausgangskonzentration und mmol/l) nach Fütterung einer
magnesiumfreien Diät (CHICCO et al. 1973) ...27 Tabelle 10: Einfluss verschiedener Phosphorgehalte im Futter (g/kg T) von Kühen auf die
Konzentration im Blut (mmol/l)...29 Tabelle 11: Einfluss verschiedener Kupferzulagen (mg/kg T) im Futter von Kühen auf die
Kupferkonzentration im Blut (µmol/l)...32 Tabelle 12: Zink im Futter (mg/kg T) und im Blut (µmol/l) von 48 Kälbern in Abhängigkeit
von der Zinkquelle (WRIGHT und SPEARS 2004)...34
Tabelle 14: Einfluss verschiedener ß-Carotin- und Vitamin A-Gehalte (mg/Tag und IE/Tag) im Futter von Kühen auf die Konzentration im Blut (µg/dl und mg/l)...38 Tabelle 15: Einfluss zusätzlicher Vitamin E-Gaben während der Trockenstehzeit auf den
Vitamin E-Gehalt im Blutserum und in der Milch von Kühen
(LATTEMANN et al. 2001) ...40 Tabelle 16: Einfluss verschiedener Vitamin E-Gehalte (IE/Tag) im Futter von Kühen auf die
Konzentration im Blut (mg/l)...41 Tabelle 17: Zusammensetzung der gefütterten Kraftfuttermittel in % ...51
Tabelle 18: Kalkulierte Konzentrationen an Mengen- und Spurenelementen sowie Vitaminen der Kraftfuttermittel pro kg T...52 Tabelle 19: Scheinbare Verdaulichkeiten (%) der Rohnährstoffe der einzelnen Futtermittel ...53
Tabelle 20: Untersuchte Probenmaterialien mit dazugehörigen Probeentnahmeterminen ...54
Tabelle 21: Trockensubstanz- (%) und Rohnährstoffgehalte (g/kg T) der eingesetzten
Grundfuttermittel (x± s, n = 21)...55 Tabelle 22: Trockensubstanz- (%) und Rohnährstoffgehalte (g/kg T) der eingesetzten
Kraftfuttermittel (x± s, n = 9) ...56
Tabelle 23: Energiegehalte (x± s) der eingesetzten Futtermittel in MJ/kg T ...57
Tabelle 24: Analysenwerte der Mengen- und Spurenelementgehalte (x± s) der eingesetzten
Futtermittel in g bzw. mg/kg T...58 Tabelle 25: Analysenmethoden und -geräte zur Messung der Milchinhaltsstoffe mit den
Variationskoeffizienten (VK in %) zur Präzision in der Serie des MKU Uelzen...59 Tabelle 26: Kalbedaten der Tiere (n = 4) der 24-Stunden-Versuche und zeitliche Abstände
der Entnahmetermine (1 Wo. a. p., 1, 4 und 8 Wo. p. p.) zur Kalbung ...61
Variationskoeffizienten der jeweilgen Hersteller (VK in %) zur Präzision in der Serie...63 Tabelle 29: Referenzwerte für Blutinhaltsstoffe der Klinik für Rinder der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover...64 Tabelle 30: Zwischenkalbezeiten, Rastzeiten und Güstzeiten der Gruppen im Vergleich ...68
Tabelle 31: Aufgenommene Trockensubstanz, Energie- und Proteinmengen (x± s) der
Gruppen in Laktationsdritteln ...72
Tabelle 32: Mengen- und Spurenelementaufnahme (x± s) beider Gruppen pro Tag in
Laktationsdritteln ...73
Tabelle 33: Milchinhaltsstoffe (x± s) der Gruppen in Laktationsdritteln...78
Tabelle 34: Fettsäurenzusammensetzung (x± s) der Milch beider Gruppen im 2. und 3.
Laktationsdrittel ...79
Tabelle 35: pH-Werte und Fettsäuremuster (x± s) der Pansensäfte der unfistulierten Tiere ...80
Tabelle 36: pH-Werte und Fettsäuremuster (x± s) der Pansensäfte der fistulierten Tiere (n = 2)...81
Tabelle 37: Mineralstoffkonzentrationen (x± s) im Serum über 24 Stunden bei vier Kühen an vier Terminen in der Laktation...83 Tabelle 38: Variationskoeffizienten (VK in %) der Mineralstoffkonzentrationen im Serum
über 24 Stunden bei vier Kühen an vier Terminen in der Laktation...84
Tabelle 39: Mittlere Konzentrationen der untersuchten Mengenelemente (x± s) im Serum der Gruppen...86
Tabelle 41: Parameter der Protein- und Energieversorgung (x± s) im Serum der Gruppen im Messzeitraum ...91
Tabelle 42: Konzentrationen der Leberparameter (x± s) im Blut der Gruppen im
Messzeitraum ...92 Tabelle 43: Anzahl der Über- und Unterschreitungen (der jeweiligen Tierzahl) der
Referenzbereiche der Klinik für Rinder der TiHo beider Gruppen in % ...
...94
Tabelle 44: Berechnung von Referenzwerten für Rinderblut nach parametrischen (x ± 2s) und nicht-parametrischen Verfahren (2,5- und 97,5 %-Perzentilintervalle) mit Angabe von Mittelwert (x), Median und den 90 %-Konfidenzintervallen um die Perzentilintervalle (n = 196, Stoffwechsel- und Leberparameter mit n = 136)...
...97 Tabelle 45: Konzentrationen der Leberparameter bei Deutschen Holstein Rindern im Alter
von 24 Monaten (BERRY 2005) im Vergleich zu den ermittelten
Konzentrationen der eigenen Untersuchung 1 Woche a. p. ...116 Tabelle 46: Berechnung von Referenzwerten für Kupfer und Zink im Blutserum
erstlaktierender Tiere nach parametrischen und nicht-parametrischen
Verfahren getrennt nach Gruppen...119 Tabelle 47: Referenzwerte der Klinik für Rinder der Stiftung Tieerärztliche Hochschule
Hannover und berechnete Referenzwerten aus dem Datenmaterial der eigenen
Untersuchung ...124
Anhang 1: Inhaltsstoffe laut Herstellerangabe der beiden Mineralfuttermittel ...160
Anhang 2: Gruppengrößen über 305 Tage...160
Anhang 3: Diagnosen (von Arzneimittelabgabebelegen) und Anzahl der daran
erkrankten Tiere je Gruppe (n = 17) im Versuchszeitraum ...161
Anhang 4: Ermittelte Signifikanzen der 24-Stunden-Versuche von 4 Tieren an vier
Terminen für die einzelnen Parameter ...162
Anhang 5: Ermittelte Signifikanzen der 12 Messwerte pro 24-Stunden-Versuch und Tier an den vier Terminen...163
ADF acid detergent fiber / Säure-Detergentien-Faser
AP Alkalische Phosphatase
a. p. ante partum
AST Aspartat-Amino-Transferase
β-HBS Beta-Hydroxy-Buttersäure
C2 Essigsäure
C3 Propionsäure
C4 Buttersäure
C5 Valeriansäure
CK Kreatininkinase
CLA Conjugated Linoleic Acid/ Konjugierte
Linolsäure
CT Calcitonin
DLG Deutsche Landwirtschaftsgesellschaft e. V.
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft
FCM fat corrected milk / Fett-korrigierte-Milch
g Gramm
g1 Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
GE Gesamtenergie
GF Grundfutter
GfE Gesellschaft für Ernährungsphysiologie
γ-GT Gamma(γ)-Glutamyl-Transferase
GLDH Glutamat-Dehydrogenase
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IFCC International Federation of Clinical Chemistry
and Laboratory Medicine
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KF Kraftfutter
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
ME metabolizable energy / umsetzbare Energie
mg Milligramm
µmol MicroMol (10-6)
MKU Milchwirtschaftlicher Kontroll- und
Untersuchungsverband Uelzen e.V.
mmol MilliMol (10-3)
n Stichprobenumfang
NDF neutral detergent fiber / Neutral-Detergentien-
Faser
NEL Netto Energie Laktation
NfE Stickstoff-freie-Extraktstoffe
NRC National Research Council
oS organische Substanz
p. p. post partum
ppm parts per million
r Korrelationskoeffizient
RNB ruminale Stickstoffbilanz
PTH Parathormon
s Standardabweichung
SAS Statistical Analysis System
SI-Einheit Système International d’Unités (Internationales Maß- und Einheitensystem für Naturwissenschaften)
sV scheinbare Verdaulichkeit
T Trockensubstanz
TiHo Stiftung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Tsd Tausend (1000)
U/l Units per litre / Einheiten pro Liter
UV UltraViolett
VDLUFA Verband Deutscher Landwirtschaftlicher
Untersuchungs- und Forschungsanstalten
VK Variationskoeffizient (%)
Wo. Woche
x Mittelwert
XA Rohasche
XF Rohfaser
XL Rohfett
XP Rohprotein
1
1 Einleitung
Zu der täglichen Routine vieler Tierärzte gehört es, Tieren Blut zu entnehmen, um auf deren Gesundheits- und Ernährungsstatus rückschließen zu können. Dabei werden die ermittelten Blutparameter mit von Laboratorien angegebenen Referenzwerten verglichen und das Tier gegebenenfalls als gesund oder krank bzw. im Falle des Ernährungsstatus als gut oder schlecht versorgt beurteilt. Dabei hängt es aber vom Ermessen des jeweiligen Tierarztes ab, außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte zu beurteilen und gegebenenfalls Maßnahmen zur Abhilfe einzuleiten. Hierbei muss er das jeweilige Individuum und Faktoren wie Rasse, Alter, Laktationsstadium und den sonstigen Gesundheitsstatus des Tieres berücksichtigen. Außerdem haben der Zeitpunkt der Blutentnahme bzw. der Fütterungszeitpunkt Einfluss auf bestimmte Parameter. Es sollte auch immer die Referenz des jeweiligen Labors geprüft werden, da die Messmethode Einfluss auf die ermittelten Konzentrationen hat. In der Fachliteratur gibt es unterschiedliche Angaben zu Referenzwerten und auch den dazugehörigen Einheiten, was die Einschätzung von grenzwertigen Ergebnissen erschwert. Außerdem liegen nur sehr selten Quellenangaben bei den jeweiligen Referenzwerten vor, weshalb der Ursprung dieser Angaben schwer nachzuvollziehen ist.
In den zurückliegenden Jahren traten in der Praxis gehäuft Unterschreitungen der Referenzbereiche besonders im Bereich der Mengen- und Spurenelement- sowie der Vitaminversorgung von Kühen und Färsen auf, ohne dass die Tiere klinische Symptome zeigten und obwohl sie entsprechend den Versorgungsempfehlungen gefüttert wurden. Dies macht deutlich, dass die angewandten Referenzwerte und die Versorgungsempfehlungen, die regelmäßig den wechselnden Leistungen und Bedürfnissen der Tiere angepasst werden, nicht übereinstimmen. Außerdem sind trotz häufiger Referenzwertunterschreitungen kaum klinische Symptome oder andere Mangelerscheinungen beobachtet worden, was zu Zweifeln an gewissen Referenzbereichen geführt hat.
In dieser Untersuchung sollte daher der Einfluss der Fütterung von erstlaktierenden Kühen mit unterschiedlich hoher Versorgung an Mengen- und Spurenelementen sowie ausgewählter Vitamine auf ausgesuchte Blutparameter überprüft werden.
2
Da Herkunft und Alter der gängigen Referenzwerte nicht ersichtlich sind, auch die Berechnungs- und Ermittlungsmethoden nicht nachvollzogen werden können und noch dazu extrem variierende Referenzwerte existieren (Tabelle 1 und Tabelle 2), ist eine Einschätzung von gemessenen Blutparametern schwierig. GELFERT und STAUFENBIEL (1998) fassten zusammen, dass Abweichungen von den Referenzwerten bei den Spurenelementen verbreitet sind, ohne dass man die Bedeutung für die Zustandsbestimmung des Tieres richtig abschätzen kann. Es stellt sich somit die Frage nach den Ursachen, der tiergesundheitlichen Relevanz der Befunde und den notwendigen Maßnahmen, die es zu ergreifen gilt. Erfahrungen aus der praktischen Bestandsbetreuung zeigen, dass bei den Spurenelementen häufig Normabweichungen gefunden werden, deren Bedeutung nur unsicher eingeschätzt werden können (GELFERT und STAUFENBIEL 1998).
Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen,
• ob ausgewählte Blutkonzentrationen bei Fütterung nach Versorgungsempfehlungen (GFE 2001) in den Referenzbereichen liegen.
• ob ein unterschiedliches Angebot von Mineralstoffen Einfluss auf die Blutkonzentrationen ausgewählter Blutparameter hat.
• wie die Aussagekraft des Blutes für bestimmte Parameter ist.
• ob die bestehenden Referenzwerte bei allen Tieren und zu jedem Laktationszeitpunkt gleichermaßen anzuwenden sind.
Zu diesem Zweck wurde eine Probandengruppe aufgestellt, die sich hinsichtlich der Faktoren Rasse, Geschlecht, Alter, Haltung, Gesundheits- und Ernährungsstandard nicht unterschieden, um die Wirkung einer unterschiedlichen Fütterung auf bestimmte Blutinhaltsstoffe untersuchen zu können. Die Proben wurden nach einem standardisierten Verfahren entnommen und behandelt, um auch die äußeren Einflüsse auf die ermittelten Konzentrationen konstant zu halten.
3
2 Literaturübersicht
2.1 Definition Referenzwert
Eine Referenz ist laut dem DUDEN (2003) eine „von einer Vertrauensperson gegebene Auskunft, die man als Empfehlung vorweisen kann“. Das zusammengesetzte Wort Referenzwert ist hier nicht zu finden. Im PSCHYREMBEL (1997) wird das Wort Referenzbereich definiert als
„Meßwertbereich für labormedizinisch bestimmte Parameter biologischer Proben, die durch Untersuchungen an einer gesunden Referenzpopulation gewonnen werden (Mittelwert ± zwei Standardabweichungen); ein Über- oder Unterschreiten der Grenzwerte deutet in der Regel auf einen pathologischen Befund hin“. In der Fachliteratur werden neben geringgradig abweichenden Definitionen auch unterschiedliche Begriffe verwendet. Hier tauchen je nach Alter der Literatur abwechselnd die Begriffe Referenzwert/-bereich/-intervall, Normalwert/-bereich und Normwert/- bereich auf, wobei der Normalwert die noch ältere Form des Normwerts abgelöst hat. KRAFT (1991) hält die Bezeichnung Normalwert/-bereich für fehlerhaft und veraltet, da der Begriff des Normalen definitionsgemäß eine absolut gesunde Probandengruppe voraussetzt, es aber keine absolute Gesundheit gibt. Auch die International Federation of clinical chemistry (IFCC, 1987a) stellte fest, dass keine Definition von Gesundheit vollständig befriedigend ist bzw. dies ein relativer und kein absoluter Zustand ist. Definitionen der Begriffe Referenzwert, -intervall und -limit lieferte die IFCC (1987a). Demnach ist ein Referenzwert ein Wert, der durch eine bestimmte Art und Menge von Messungen oder Beobachtungen von einem Individuum erhalten wird, welches zu einer Referenzpopulation gehört. Die Kommission Human-Biomonitoring des Umweltbundesamtes hat sich 1996 nach erneuter Diskussion entschlossen, den Begriff des Referenzwertes beizubehalten. In der neuzeitigen Literatur wird daher meist vom Referenzwert gesprochen, aber teilweise sind auch noch die älteren Begriffe im Gebrauch. KRAFT und DÜRR (1999) widmen den Beginn ihres Buches diesem Thema. Hier wird auf den ersten Seiten versucht, ausschließlich den Begriff des Referenzwertes zu erläutern. Der Grund liegt darin, dass “die Diskussion über die »Normalwerte«
in der Labordiagnostik so alt ist wie die Labordiagnostik selbst“. Zweifel an den Definitionen und Referenzwerten sind also nicht neu. Die Begriffsdefinition lautet hier: „Quantitativer Wert eines bestimmten Untersuchungsmerkmals oder -parameters (besser: Messgröße), der unter exakt
4
definierten Bedingungen von einer ausreichend beschriebenen Gruppe von Probanden gewonnen und mit einer bestimmten mathematisch-statistischen Methode ermittelt wurde“ (KRAFT 1999).
2.2 Voraussetzungen zur Ermittlung von Referenzwerten
Für die Ermittlung von Referenzwerten müssen bestimmte Grundvoraussetzungen erfüllt sein.
Solche Ein- und Ausschlusskriterien für Probandenpopulationen sind nach KRAFT (1991):
- genaue Beschreibung der Probanden mit Rasse, Geschlecht, Alter, Haltung und Fütterung, - möglichst große Probenanzahl,
- möglichst einheitlicher Gesundheits- und Ernährungsstatus,
- einheitliche Technik und Zeit der Probengewinnung, der Präparation, des Transports und der Lagerung,
- standardisierte Analyse der Proben mit Qualitätskontrollen,
- Anwendung einer geeigneten statistischen Methode zur Berechnung und - genaue Aufzeichnung aller angewandten Methoden und Vorgänge.
Ähnliche Kriterien stellte auch die IFCC (1987a) auf, wobei hier für die Ermittlung von humanen Referenzwerten noch zusätzliche Merkmale, wie z. B. Raucher/Nichtraucher aufgeführt wurden.
Die Referenzbereiche sollten von einer definierten Probandengruppe abgeleitet werden, für die auch definierte Bedingungen gelten und die Ermittlungsmethode sollte statistisch gesichert sein. Es wird so nicht der Anspruch erhoben, für alle Individuen einer Rasse zu gelten, sondern die Referenzwerte sollten laut KRAFT (1991) nur eine Vergleichsgröße darstellen. Es wird deutlich, wie aufwendig es ist, Referenzwerte zu erstellen. Dabei ist nicht nur der Arbeits- und Zeitaufwand ausschlaggebend, sondern in erster Hinsicht der finanzielle. So hielt LUMBSDEN (1998) es sogar für unrealistisch, Referenzbereiche für alle Individuen zu erstellen, da die Referenzwerte von zu vielen Faktoren abhängen.
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2.3 Berechnung von Referenzwerten
KRAFT (1999) erläuterte verschiedene Möglichkeiten zur Berechnung von Referenzwerten:
- Die Spannweite („Range“): hier werden alle gemessenen Werte mit in den Referenzbereich einbezogen. Das kann zu einem sehr großen Messbereich führen, wenn Extremwerte darunter sind, wodurch die spätere Nutzung zur Beurteilung anderer Tiere entfällt.
- Der klassische oder parametrische Referenzbereich: dieser beschreibt den Bereich zwischen dem mathematischen Mittelwert minus bis plus der doppelten Standardabweichung, also x ± 1,96s.
Bei dieser Berechnung sollte aber eine Normalverteilung der Werte vorliegen, was bei biologischen Daten meist nicht der Fall ist. Diese Kurven sind meist linkssteil, also rechtsschief verteilt. Durch Transformationen (bei Linkssteilheit logarithmieren, bei der selteneren Rechtssteilheit Nutzung der e-Funktion) kann eine annähernde Normalverteilung der Werte erzwungen werden. Im Falle der Linkssteilheit kann dies aber dazu führen, dass auf der linken Seite, im Bereich der niedrigen Werte zu viele Daten berücksichtigt und dafür auf der rechten Seite zu viele eliminiert werden (Abbildung 1). Zur Erstellung von Referenzwerten ist diese Methode daher nur bei normalverteilten Werten geeignet.
- Der nicht-parametrische Referenzbereich: dieser ist unabhängig von der Verteilung der Daten, es muss daher keine Normalverteilung zu Grunde liegen. Hierbei nutzt man nur Datenbereiche, in diesem Fall das 95 %-Perzentil-Intervall. Dazu werden die gemessenen Daten aufsteigend rangiert sowie 2,5 % der höchsten und niedrigsten Werte eliminiert, wodurch die zentralen 95 % der Werte genutzt werden. Bei normalverteilten Werten entsprechen die 95 % der Werte den gleichen Werten, die sich innerhalb der doppelten Standardabweichung befinden (Abbildung 1).
Die Rechenformel dafür lautet: (n+1) x 0,025 für die unteren und (n+1) x 0,975 für die oberen 2,5
% der Werte. Das Ergebnis gibt die Beobachtung wieder, die als 2,5 %- oder 97,5 %-Perzentil (untere und obere Grenze des Referenzbereiches) gilt. Ist das Ergebnis keine ganze Zahl, müssen die Beobachtungen davor und danach interpoliert werden. Beim einseitigen Referenzbereich, also wenn nur eine Obergrenze festgelegt wird, wie es z. B. bei den meisten Enzymen der Fall ist, werden nur die oberen 2,5 % der Werte ausgeschlossen und als Referenzwert gilt dann das 97,5
%-Perzentil.
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Abbildung 1: Grafische Darstellung von normalverteilten und linkssteil verteilten Werten
Die Streuung bei nicht-normalverteilten Daten wird in Form von Quantilen angegeben, da diese bestimmte Anteile der Messwerte enthalten und somit wiederum unabhängig von der Verteilung der Werte sind. Bestimmte Quantile sind Quartile und Perzentile, wobei z. B. Quartile den Häufigkeitsbereich in 4 Teile teilen, in denen dann 25 % der Werte liegen und Perzentile unterteilen den Bereich in 100 Teile zu je 1 % (RICHTER 2004).
Zur Erstellung von Referenzbereichen lieferten LUMBSDEN und MULLEN (1978) eine genaue Anleitung, die bei ausreichend großer Stichprobenzahl und nicht-normalverteilten Werten auch die Ermittlung durch das nicht-parametrische Verfahren favorisierte. Durch die IFCC (1983) wurde die Berechnung von Referenzwerten zu einem standardisierten Verfahren und somit international anerkannt. Hier wurden sowohl das Vorgehen mittels parametrischer als auch mittels nicht- parametrischer Berechnung vorgestellt, das nicht-parametrische aber aufgrund seiner Einfachheit und Unabhängigkeit von der Verteilungsform empfohlen. Der nicht-parametrische Referenzbereich wird auch in der Humanmedizin zur Ermittlung von Referenzbereichen genutzt (Kommission Human-Biomonitoring des Umweltbundesamtes 1996). Auch FARVER (1997) erklärte dieses Verfahren für attraktiv, da es sowohl bei normalverteilten, als auch bei nicht-normalverteilten Werten gleichermaßen genutzt werden kann.
Das nicht-parametrische Verfahren erfordert eine ausreichend große Stichprobenanzahl, um eine statistische Sicherheit gewährleisten zu können. Die kleinstmögliche Stichprobenanzahl n lässt sich
-2s +2s
x
95%
-2s +2s
x
95%
-2s +2s
x
-2s +2s
x
7
nach der IFCC (1987a) aus der Formel 1/n < 0,025 (0,025 = 2,5 % Abzug) berechnen und beträgt demnach n = 40 (1/40 = 0,025). Allerdings werden weit mehr Stichproben empfohlen und erst ab n
= 120 ist laut HENRY und REED (1974) eine statistisch sichere Berechnung des 95 %- Perzentilintervalls möglich. Auch LUMBSDEN und MULLEN (1978) legten besonderes Augenmerk auf eine möglichst große Anzahl von Stichproben, um eine größtmögliche statistische Sicherheit zu erhalten. Auch sie gaben die minimale Stichprobenanzahl beim nicht-parametrischen Verfahren mit n = 120 an und zeigten für kleinere Stichprobengrößen andere Berechnungsmethoden auf.
Während die IFCC (1983) und andere namhafte Autoren der Referenzwertberechnung (HENRY und REED 1974, LUMBSDEN und MULLEN 1978) bei n von Probengröße und Anzahl der Beobachtungen sprechen, definiert FARVER (1997) n ausdrücklich als Anzahl der Tiere. Nach dieser Definition müsste jeder Messwert von einem anderen Individuum stammen und Mehrfachmessungen wären nicht möglich.
Eine weitere Möglichkeit zur Angabe der statistischen Sicherheit ist die Angabe von 90 % Konfidenzintervallen um die Perzentile. In diesem auch Vertrauensbereich oder Fehlergrenze genannten Bereich, liegt der gesuchte Wert dann mit 90 %-iger Wahrscheinlichkeit (LUMBSDEN 2000a). Die Größe der Vertrauensbereiche ist dabei von der jeweilgen Stichprobenzahl n abhängig (Abbildung 2). Je größer n, desto kleiner sind die Vertrauensbereiche und desto größer ist damit die statistische Sicherheit. Eine vorgefertigte Liste zur Anzahl der Werte im Vertrauensbereich in Abhängigkeit vom jeweiligen n lieferte die IFCC (1987a).
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Abbildung 2: Grafische Darstellung der Vertrauensbereiche (Konfidenzintervalle) in Abhängigkeit von der Stichprobenanzahl (nach IFCC 1983)
Strittig sind die Verfahren zur Elimination von extremen Werten, so genannten Ausreißern.
Während die IFCC (1987a) mehrere Möglichkeiten der Detektion und Elimination angibt, sprechen sich andere Autoren (PLONAIT 1980, STÄMPFLI und ITTIG 1982) gegen eine Elimination von ohne ersichtlichen Grund stark abweichenden Messwerten aus, da ohne klinische Symptome eine Krankheit nicht immer bewiesen werden kann und der Wert dann ungerechtfertigter Weise ausgeschlossen würde. Einigkeit besteht darüber, dass Werte von Ausreißern wenn möglich erneut gemessen werden sollten, um technische Fehler auszuschließen (IFCC 1987a). Auch sollte das entsprechende Referenzindividuum noch einmal auf eventuelle subklinische Erkrankungen untersucht werden. Bleibt der extreme Wert trotz allem bestehen, wird von der IFCC (1987a) empfohlen, Ein- oder Ausschluss nach bestem Wissen und Urteilskraft vorzunehmen und das Verfahren aufzuzeichnen.
Um Referenzwerte zu erstellen, muss zunächst die Verteilung der Messwerte betrachtet werden.
Dies geschieht optisch am besten mithilfe von Histogrammen. Hier werden Ausreißer und auch eine n=50
n=500 n=50 n=500
2,5 97,5
n=50 n=500 n=50 n=500
2,5 97,5
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eventuelle Normalverteilung sichtbar. Ausreißerwerte müssen überprüft, wenn möglich wiederholt und dann eventuell aus- oder eingeschlossen werden. Die Normalverteilung sollte zusätzlich mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test statistisch geprüft werden und bei Vorliegen einer solchen Verteilung kann eine Berechnung nach dem parametrischen Verfahren genutzt werden. Liegt keine Normalverteilung vor, was bei den meisten biologischen Daten der Fall ist, sollte eine Berechnung durch nicht-parametrische Verfahren genutzt werden (IFCC 1987a).
2.4 Verschiedene Referenzwerte
Trotz jahrzehntelanger Bemühungen existieren für Rinder noch immer uneinheitliche Referenzwerte (PLONAIT 1980, STANGASSINGER 2003, Tabelle 1 und Tabelle 2) und das, obwohl anerkannte Methoden international standardisiert wurden. Es werden immer noch Referenzwerte präsentiert, deren Methode der Ermittlung nicht detailliert beschrieben wird und wo eine Anwendung der empfohlenen Methode nicht nachvollzogen werden kann bzw. fraglich erscheint (IFCC 2000). So wurden z. B. die meisten Referenzwerte für landwirtschaftliche Nutztiere nach der parametrischen Methode berechnet und mit x ± 2s angegeben, obwohl diese Methode aufgrund der Verteilungsform biologischer Daten nicht empfohlen wird (KRAFT 1999, BIEBLER et al. 1984). Als möglichen Grund dafür gab die IFCC (2000) an, dass die Erarbeitung von Referenzwerten evt. zu theoretisch und zu arbeitsaufwendig ist, wenn man sie konsequent verfolge.
Bei vielen im Gebrauch befindlichen Referenzwerten kann weder die Quelle, noch das Alter oder die Art der Berechnung ermittelt werden, was eine Anwendung schwierig macht. Denn eigentlich sollten die Referenzwerte unter vergleichbaren Bedingungen wie die einzuordnenden Messwerte ermittelt worden sein. Auch müsste theoretisch jedes Labor seine eigenen Referenzwerte erarbeiten, was natürlich allein schon aus ökonomischer Sicht nicht realisierbar und auch nicht realistisch ist (KRAFT 1999). So sind die Referenzwerte für Rinderblut in der gängigen Fachliteratur sehr unterschiedlich (Tabelle 1 und Tabelle 2). Beim Serum-Phosphor z. B. schwankt die untere der angegebenen Grenzen zwischen 0,7 und 2,5 mmol/l, während die obere aber zwischen 1,9 und 4 mmol/l liegt. Werte zwischen 2,0 und 2,4 mmol/l könnten demnach je nach Quelle eine Unter- und/oder auch eine Überschreitung des Referenzbereiches bedeuten. Bei den Leberenzymen, bei denen eigentlich nur eine obere Grenze angegeben wird, treten bei einigen Angaben auch untere
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Grenzen auf, deren Aussage fraglich erscheint. Bei den Spurenelementen und den Vitaminen fehlen die Angaben der Referenzwerte häufig ganz oder es werden nur untere Grenzen angegeben.
Überversorgungen und/oder Intoxikationen werden demnach nicht berücksichtigt.
Trotz standardisierter Methoden zur Ermittlung von Referenzwerten bestehen also noch erhebliche Differenzen zwischen den einzelnen Institutionen. Schon 1976 wurde in einem Symposium der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) in Gießen versucht, eine Vereinheitlichung der Referenzwerte zu erzielen (PLONAIT 1980). Das Ergebnis zeigt Spalte 3 in Tabelle 2. Nach LUMSDEN (1998) sollten in Zukunft wenigstens die Quellen mit der genutzten Methodik angegeben werden, um einen Vergleich mit den eigenen Werten zu ermöglichen. Die IFCC (2000) geht noch weiter und sagt abschließend, dass eine Vereinheitlichung aller Referenzwerte weltweit angestrebt werden sollte.
Die Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen die unterschiedlichen Referenzwerte aus der Fachliteratur im Vergleich zu denen der Stiftung der Tierärztlichen Hochschule (Tabelle 1, Spalte 1), wobei hier zum besseren Vergleich alle Referenzwerte in die gängigen Angaben des Système International d’Unités (SI-Einheiten) umgerechnet wurden.
Parameter Einheiten Vergleichswerte Gängige Quellen
TiHo BICK- DIRKSEN EIKMEIER JAKSCH KANEKO KRAFT LABO- VET MED
Kl. für Rinder HARDT et al.
und GLA- WISCHNIG
und DÜRR
KLIN LABOR
(2004) (1992) (2002) (1995) (1990) (1997) (1999) (2005) (2005) Ca mmol/l 2,1-3,0 2,0-3,0 2,5 4,0-6,0 2,3-3,0 2,43-3,1 2,3-2,8 2,3-2,8 2,4-3,0 Mg mmol/l 0,7-1,2 0,6-1,3 1,0 0,53-0,82 0,7-1,3 0,74-0,95 0,8-1,3 0,8-1,3 0,8-1,3 P mmol/l 1,1-2,4 0,7-2,6 1,35-1,9 2,5-4,0 1,6-2,3 1,81-2,10 1,6-2,3 1,6-2,3 1,8-2,4
Cu µmol/l 12-24 16-32 12-20 - - 5,16-5,54 - 16-32 14-19
Zn µmol/l 12-24 - >7,7 - - - -
10,7-
19,9 14,5-20
ß-Carotin µg/dl >200 - 200-1500 - - 25-950 - - >700
Vit. A mg/l >0,3 - 0,25-0,8 - - 0,47-17,7 - - 0,2-0,7
Vit. E mg/l >3,0 - 3-10 - - - - - >3
Eiweiß, ges. g/l 60-80 60-80 60-80 60-80 60-80 67,4-74,6 60-80 60-80 60-85 Harnstoff mmol/l <8 2-8 - 1,7-7,5 3,5-5,0 7,14-10,7 3,3-5,0 3,3-5 2,2-8 ß-HBS mmol/l <1 0,2-1,6 <1,2 - - 0,38-0,41 - - <0,9 Bilirubin, ges. mmol/l <7 <10 <8,5 <8,5 <6 0,17-8,55 <5,0 <5 <17 AST U/l <50 10-50 <40-50 <100 <30 78-132 <80 <80 15-105
γ-GT U/l <20 10-27 <20 - <15 6,1-17,4 <50 <50 7-27
GLDH U/l <8 <7 <10 - <9 <31 <30 <30 <10,5
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Tabelle 2: Darstellung einiger Referenzwerte im Blutserum des Rindes aus verschiedenen Quellen
Parameter Einheiten Quellen
Quellen: GELFERT und KNICKEL PLONAIT SANO Uni
STAUFENBIEL et al. Gießen*
(2004) (2002) (1980) (2004) (2004)
Ca mmol/l 2-3 4-6 2,0-2,9 2,0-2,54 2-3
Mg mmol/l 0,7-1,3 1,3-2 0,65-1,0 0,9-1,32 0,7-1,4 P mmol/l 1,6-2,6 2,5-4 1,2-2,0 1,26-2,29 1,5-2,1
Cu µmol/l >12,6 - - 12,5-32,8 8-39
Zn µmol/l >12,6 - - 12-46 10-20
Eiweiß, ges. g/l 60-80 60-80 60-80 68-82 60-80 Harnstoff mmol/l 3,3-5 1,7-7,5 1,6-7,5 <6,8 <5,5
ß-HBS mmol/l <1,5 - - <0,62 <1
Bilirubin, ges. mmol/l <6,8 <8,5 0,8-8,6 <5,3 <8,5 AST U/l <105 <100 10-50 <78 <40
γ-GT U/l <27 - 10-22 <50 <20
GLDH U/l <10 - - <50 <10
2.5 Nutzung von Referenzwerten
Die praktische Anwendung von Referenzwerten bringt erhebliche Schwierigkeiten mit sich (PLONAIT 1980). Wichtig dabei ist, auf jeden Fall die Referenzwerte des Labors zu nutzen, in dem die Parameter gemessen wurden, um deren Messmethode einzubeziehen und so eine Vergleichsmöglichkeit herzustellen (DUBREUIL und LAPIERRE 1997). Außerdem ist es wichtig zu bedenken, dass bei Abweichungen zwischen gemessenen Werten und Referenzwerten ein statistisch signifikanter Unterschied trotzdem keine medizinische Signifikanz darstellen muss, da statistische Unterschiede nur eine beschreibende Funktion haben (IFCC 1987a). Die Interpretation von Unterschieden sollte nach der IFCC (1987a) auf biochemischen, physiologischen oder klinischen Überlegungen basieren. Daher ist auch die Beurteilung als gesund oder krank schwierig.
Die IFCC (1987b) nahm daher eine Klassifizierung der gemessenen Konzentrationen in
* = laut persönlicher Mitteilung von Herrn Prof. Dr. K. Doll, Gießen am 08.08.05
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„ungewöhnlich niedrig“ (wenn unterhalb des Referenzbereiches), „gewöhnlich“ (wenn innerhalb des Referenzbereiches) und „ungewöhnlich hoch“ (wenn oberhalb des Referenzbereiches) vor. Die Begriffe normal/abnormal oder pathologisch wurden hier ausdrücklich nicht empfohlen. KRAFT (1999) sagt sogar, es sei falsch, einen über oder unter der Referenzgrenze liegenden Wert eo ipso als krankhaft zu bezeichnen. Er empfahl die Ausdrücke erhöht bzw. erniedrigt. Referenzwerte sind daher theoretisch nur zur Orientierung brauchbar und können nicht bei jedem Individuum gleich beurteilt werden. Die Bewertung muss immer das jeweilige Individuum einbeziehen. KRAFT (1991) bezeichnete Referenzwerte als Vergleichsgröße und LUMBSDEN (1998) als „Glied in der Informationskette“, das zur klinischen Entscheidungsfindung erforderlich ist. STAUFENBIEL et al.
(2004) wiesen darauf hin, dass Referenzgrenzen lediglich als Orientierungshilfen dienen und Laborbefunde einer fachlich fundierten Interpretation bedürfen, die über den einfachen Vergleich mit den Referenzwerten weit hinaus geht. Ihrer Ansicht nach müssten Weiterbildungsmaßnahmen zur Vermeidung von Fehlinterpretationen dringend verstärkt werden.
2.6 Metabolische Profiltests
In der Literatur werden häufig Referenzwertberechnungen im Rahmen von so genannten metabolischen Profiltests (MPT) vorgenommen, weshalb diese hier erwähnt werden sollen. Es handelt sich dabei um stichprobenartige Blutuntersuchungen in ganzen Herden, mit dem Ziel, anhand der Messergebnisse auf Ernährungssituation oder gar Stoffwechselgesundheit dieser Herde rückschliessen zu können. Etabliert wurde dieses Verfahren durch PAYNE et al. (1970). Dabei wurden die Tiere einer Herde abhängig von deren Laktationsstand in Gruppen, wie z. B.
trockenstehende, früh-, hoch- und spätlaktierende Tiere eingeteilt. Aus jeder dieser Gruppen wurden mindestens 7 klinisch unauffällige Tiere auf relativ viele Parameter (10-15) untersucht, um möglichst breitflächig, aber mit möglichst geringem finanziellem Aufwand, ein Herdenmonitoring zu betreiben. Aus den Stichproben wurden die Referenzwerte der jeweiligen Herde berechnet. Eine Anleitung zum statistischen Vorgehen dabei lieferten WILLER et al. (1976). Sie empfahlen allerdings, die Stichprobengröße abhängig vom Fehler 1. und 2. Art zu wählen und demnach mindestens 9 Proben pro Gruppe zu gewinnen. Auch STAUFENBIEL et al. (2004) sprachen im Rahmen der Bestandsbetreuung von metabolischen Profiltests, nannten sie aber prophylaktische
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Stoffwechselprofile. Sie wandten sie einerseits bei scheinbar ungestörten Herden an, um ein eventuelles Erkrankungs-Risiko abschätzen zu können und andererseits in Herden, in denen bestandsweise ungeklärte Probleme auftraten und ein Fütterungseinfluss angenommen wurde. Sie empfahlen regelmäßige prophylaktische Stoffwechselkontrollen ab Herdengrößen von über 300 Milchkühen zwei Mal pro Jahr und in Herden mit 100-300 Tieren ein Mal pro Jahr. Bei dieser Methode wurden fünf Laktationsgruppen pro Herde gebildet und mindestens 7 bis 10 Tiere jeder Gruppe beprobt. Die Blutproben der einzelnen Gruppen wurden zu einer Sammelprobe vereint, um Laborkosten zu sparen bzw. weil hinterher ohnehin nur die Mittelwerte von Interesse waren. Ein Vorteil wurde darin gesehen, dass durch die eingesparten Kosten zusätzliche Parameter untersucht werden konnten, wodurch nach Aussage der Autoren ein höherer Informationsgewinn entstand.
Diese Untersuchungsmethode der Ernährungs- und Stoffwechsellage ganzer Herden ist immer wieder kritisiert worden, da keine standardisierte Untersuchungsmethode bestand. So war man sich z. B. nicht einig darüber, aus welcher Vene das Blut entnommen werden musste (Jugular- oder Coccygealvene) und nach welchen Labormethoden untersucht werden sollte (ADAMS et al. 1978).
Außerdem war auch hier wieder die Haltung, die Jahreszeit, die Fütterung und die Rasse der Herde, sowie Alter und Laktationsstatus der Tiere mit zu berücksichtigen, weshalb diese Referenzbereiche immer nur für die jeweilige Herde in der Region und zu der entsprechenden Jahreszeit zu nutzen waren (STANGASSINGER 2003). Außerdem konnten durch das Probenpooling keine Einzeltierdiagnosen gestellt werden (LEE et al. 1978). ADAMS et al. (1978) berichteten, dass der Nutzen von Blutprofiltests nicht überbewertet werden darf, da er in maximal 20 % der Fälle Informationen einbrächte, die ohne diese Blutentnahme nicht entdeckt worden wären.
STANGASSINGER (2003) fasste zusammen, dass ein derartig aufwendiger aber relativ unselektiver Test bei problemanfälligen Herden nur dann gerechtfertigt erscheint, wenn herdennahe Beobachtungen der Fütterungspraxis, Rationsbeurteilungen, Registrierung von Einzeltierschicksalen und spezifische Krankheitstests kein konkretes Ergebnis liefern.
2.7 Einflussfaktoren auf Blutkonzentrationen
Verschiedene Einflüsse wirken auf bestimmte Blutinhaltsstoffe und müssen deshalb bei der Referenzwertbestimmung berücksichtigt werden. Dieses können innere und äußere Einflussfaktoren
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sein. Äußere Faktoren sind unabhängig vom Tier wie z. B. das Klima, die Jahreszeit, die Haltungsform, die Tageszeit und die Probenbehandlung, während innere Faktoren durch das Tier bedingt sind (z. B. Rasse, Alter und der Blutentnahmeort). Natürlich existieren aber auch nicht zu vernachlässigende tierindividuelle Einflüsse (HAGEMEISTER und UNSELM 1968, UNSELM und RAPPEN 1968). Der besondere äußere Einfluss der Fütterung, wird in Kapitel 2.8 für die verschiedenen Parameter ausführlich beschrieben.
2.7.1 Klima, Jahreszeit und Haltungsform
SUTTNER (1980) hatte den Einfluss des Klimas auf einige Blutparameter von Jungrindern untersucht und ermittelte dabei signifikante Unterschiede zwischen Tieren mit und ohne Almaufenthalt bei Bilirubin und Phosphor. Die Phosphorkonzentrationen waren bei den Tieren während des Almaufenthaltes niedriger und konnten auf geringere Gehalte im Almgras zurückgeführt werden, während die Bilirubinkonzentrationen höher waren und auf den Streß beim Auf- und Abtrieb zurückgeführt wurden.
Außerdem sind jahreszeitliche Schwankungen einiger Blutinhaltsstoffe bekannt, die von der Zusammensetzung der eingesetzten Futtermittel abhängen, wie zum Beispiel das Absinken der Vitaminkonzentrationen im Winter (KOLB et al. 1991). MILLER et al. (1995) hatten 50 Herden über 1 Jahr beprobt und signifikant niedrigere Vitamin E-Konzentrationen im Winter und Frühling gegenüber denen in Sommer und Herbst festgestellt. LEE et al. (1978) zeigten signifikante Unterschiede in den Konzentrationen von Gesamtprotein, Harnstoff, Phosphor und Magnesium in Abhängigkeit von der Jahreszeit. Dabei waren die Gesamtprotein- und Harnstoffkonzentrationen im Sommer höher als im Winter. Die Richtung der Veränderung der Mengenelemente wurde nicht beschrieben. SHAFFER et al. (1981) fanden signifikante Unterschiede beim Gesamtprotein und zusätzlich bei der Aspartat-Amino-Transferase (AST) und Harnstoff in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur. CLAYPOOL (1976) ermittelte die Blutkonzentrationen von Calcium, Magnesium und Phosphor bei 126 Milchkühen im Oktober und April und konnte signifikante Unterschiede aufzeigen, die in Tabelle 3 dargestellt sind.
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Tabelle 3: Mittlere Konzentrationen von Calcium, Magnesium und Phosphor im Blut (mmol/l) von 126 Milchkühen in Abhängigkeit von der Jahreszeit (CLAYPOOL 1976)
Oktober April
Calcium (mmol/l) 2,52 2,25
Magnesium (mmol/l) 0,81 0,76
Phosphor (mmol/l) 1,92 1,43
Statistisch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Haltungsformen bzw. Betrieben in den Konzentrationen von Gesamtprotein und den Mengenelementen Calcium, Magnesium und Phosphor beschrieben LEE et al. (1978). Sie untersuchten im Rahmen von metabolischen Profiltests 5 Betriebe ohne Probleme und 4 Betriebe mit Problemen in den Beständen und entdeckten in den Problembetrieben höhere Konzentrationen an Gesamtprotein und Magnesium und niedrigere Calcium- und Phosphorkonzentrationen gegenüber den Kontrollbetrieben.
2.7.2 Tageszeit
Nach HAGEMEISTER und UNSELM (1968) ist die Tageszeit bei bestimmten Blutparametern von Bedeutung. Sie ermittelten signifikante Schwankungen der Aktivitäten der AST und der Glutamat- Dehydrogenase (GLDH), wobei diese morgens um 8 Uhr am niedrigsten und nachmittags um 16 Uhr am höchsten waren. UNSELM und RAPPEN (1968) zeigten für Calcium, Magnesium und Phosphor eine Abhängigkeit vom Tageszeitpunkt. Hierbei traten die in Tabelle 4 dargestellten Konzentrationsminima und -maxima auf. Bei diesen beiden Versuchen muss erwähnt werden, dass die Tiere keine ad libitum Fütterung erhielten, sondern gegen 7 und 15 Uhr mit Grundfutter und gegen 4 und 14 Uhr mit Kraftfutter gefüttert wurden.
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Tabelle 4: Zeitpunkte der minimalen und maximalen Blutkonzentrationen von Calcium, Magnesium und Phosphor im Rinderblut während des Tages (UNSELM und RAPPEN 1968)
Konzentrationsminimum Konzentrationsmaximum
Calcium 18 Uhr 10-12 Uhr
Magnesium 8 Uhr 12 Uhr
Phosphor 18 Uhr 8 Uhr
PERGE (1982) konnte für Phosphor ein Konzentrationsminimum vor der Fütterung und ein Maximum nach der Fütterung erkennen. FORAR et al. (1982) hatten 3 Kühen über 48 Stunden in 90 minütigem Rhythmus Blut entnommen. Die Fütterung der Tiere erfolgte zwischen 6 und 10 Uhr morgens und zwischen 17 und 21 Uhr abends. Es konnten signifikante Schwankungen im Tagesverlauf gezeigt werden, wobei die Phosphorkonzentrationen im Blut 2 Stunden nach der Fütterung um bis zu 0,42 mmol/l anstiegen. Außerdem lag die Phosphorkonzentration in Proben, die tagsüber zwischen 6 und 18 Uhr gesammelt wurden, um 8 % signifikant höher gegenüber nachts gewonnenen Proben. Einen Anstieg der Blutphosphorkonzentration von 1,9 auf 2,3 mmol/l 2 Stunden nach der Fütterung beschrieben SCHOLZ und THOMSEN (1990) nach oraler Verabreichung einer Phosphorlösung. BUHM und GRÜNDER (1985) nahmen 96 Milchkühen zwei Mal pro Tag Blut ab und beobachteten, dass die zu dem späteren Zeitpunkt entnommenen Blutproben höhere Calciumkonzentrationen aufwiesen. Diese Unterschiede waren aber nicht Gegenstand der Untersuchung, nicht statistisch abgesichert und als Ursache wurden äußere Einflüsse, wie der Zeitpunkt des Melkens und der Fütterung angesehen. Ähnliches konnte KANTER (1986) berichten. Er nahm Kühen zu unterschiedlichen Tageszeitpunkten Blut ab und beobachtete, dass die Blutproben, die am späten Vormittag entnommen wurden, signifikant höhere Calciumkonzentrationen aufwiesen als am frühen Vormittag und am Nachmittag entnommene.
STEMME (2002) konnte bei ad libitum Fütterung keine Schwankungen im Tagesverlauf bei den Parametern Harnstoff, Beta-Hydroxy-Buttersäure (ß-HBS), Gesamtbilirubin, AST, Gamma- Glutamyl-Transferase (γ-GT) und GLDH finden. ROWLANDS (1980) fasst zusammen, dass Schwankungen im Tagesverlauf abhängig von dem Fütterungszeitpunkt sind, aber andere Einflussfaktoren wie die Probenentnahme oder die Probenanalytik eine größere Bedeutung als die Fütterung für die gemessene Konzentration einer Probe haben.
18 2.7.3 Probenbehandlung
Den Einfluss von Probenentnahme, -transport und -lagerung untersuchte GUDER (1976) beim Menschen und beschrieb eine Zerstörung des Bilirubins durch Licht. Die Proben sollten daher möglichst kurz dem Licht und gar nicht direkter UV-Strahlung ausgesetzt werden. Außerdem sollten sie möglichst schnell nach der Gewinnung zentrifugiert werden, um eine Hämolyse zu vermeiden. Der Zusatz von Natrium-Zitrat statt Heparin zum Plasma senkt die Gehalte von Cholesterin, Glukose und Bilirubin im Rinderblut signifikant (VON BENTEN 1972). PLONAIT (1980) beschrieb, dass die mehrmalige Untersuchung einer Probe unmittelbar hintereinander niemals den gleichen Wert ergab und die Abweichungen an verschiedenen Tagen in der Regel noch größer waren. Auch bestanden große Unterschiede in den Konzentrationen bei verschiedenen untersuchenden Personen und wiederum größere zwischen verschiedenen Laboren. Dabei kam es nach LUMBSDEN (1998, 2000b) der Tiermedizin nicht zugute, dass die Methoden und Geräte meist aus der Humanmedizin stammen und modifiziert werden müssen. Er spricht sich ausdrücklich dafür aus, dass die Methoden standardisiert und von den Benutzern auch genau zu beschreiben sind.
Außerdem sollte die analytische Präzision in Form von Variationskoeffizienten der Messungen mit angegeben werden. Nur dann ist es dem Nutzer möglich, die Konzentrationen selbst einschätzen zu können. Auch KITCHEN (1979) erkennt beträchtliche Unterschiede zwischen vier Laboren und empfiehlt, sich auf ein Labor zu beschränken, um Vergleichswerte für Probanden zu erhalten.
2.7.4 Rasse
Rasseunterschiede entdeckten STÄMPFLI und ITTIG (1982) bei einem Versuch mit Stieren der Rassen Braunvieh, Simmentaler Fleckvieh und Schwarzfleckvieh im Alter von 3-13 Monaten.
Neben Parametern des roten Blutbildes wurden signifikante Unterschiede zwischen den Rassen für Gesamtprotein, γ-GT, AST, GLDH, Calcium, Magnesium, Phosphor und Kupfer gefunden. Das Schwarzfleckvieh wies in dem Versuch höhere Blutkonzentrationen an Gesamtprotein, Calcium und Magnesium und niedrigere Konzentrationen an Phosphor, Harnstoff und AST im Vergleich zu Braun- und Simmentaler Fleckvieh auf. Bei den Leberenzymen GLDH und γ-GT zeigten die Tiere der Rasse Simmentaler Fleckvieh die höchsten Konzentrationen im Blut und die höchste Kupferkonzentration im Serum hatte das Braunvieh. BAUMGARTNER (1977) zufolge bestand bei gesunden Rindern ein signifikanter Rasseeffekt für γ-GT. Dabei war die Aktivität bei den
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Braunviehrindern höher als beim Fleckvieh. Statistisch gesicherte Rasseunterschiede bei Bilirubin und Phosphor fand auch SUTTNER (1980). Er hatte beim Höhenvieh niedrigere Konzentrationen an Bilirubin und höhere Konzentrationen beim Phosphor gegenüber dem Niederungsvieh gefunden.
BERRY (2005) zeigte signifikante Rasseunterschiede zwischen Deutschen Holsteins und Deutschem Braunvieh für Gesamteiweiß, AST, Harnstoff, Calcium, Phosphor, Kupfer und Vitamin A. Hierbei hatten die Deutschen Holsteins höhere Gesamteiweiß- und Calciumkonzentrationen als das Deutsche Braunvieh bzw. die übrigen Parameter waren bei den Kühen der Rasse Deutsche Holstein niedriger. SHAFFER et al. (1981) fanden dagegen keine signifikanten Rasseunterschiede beim Phosphor, sondern bei AST, Gesamtprotein, Harnstoff und Calcium. Sie hatten 224 Kühe der Rassen Deutsche Holstein, Guernsey, Jersey und Schweizer Braunvieh untersucht. Die Deutschen Holstein Kühe zeigten hierbei die höchsten Konzentrationen an Gesamtprotein und die niedrigsten an Harnstoff. AST und Calcium wurden bei Jerseykühen in höchsten Konzentrationen entdeckt. DU et al. (1996) fanden eine höhere Caeruloplasminaktivität bei Jerseykühen gegenüber Holstein Kühen.
2.7.5 Alter
LUMBSDEN et al. (1980) fanden signifikante Unterschiede bei Bilirubin, AST, Calcium, Magnesium und Phosphor in Abhängigkeit vom Alter, wobei Bilirubin, Calcium und Phosphor mit dem Alter abnahmen, die übrigen Parameter aber anstiegen. Sie hatten 172 weibliche Rinder im Alter von 1-2 Wochen, 2-6 Monaten, 6 Monaten bis 2 Jahre und Kühe älter als 2 Jahre untersucht.
Auch SUTTNER (1980) ermittelte mit zunehmendem Alter der Tiere signifikant verringerte Phosphorkonzentrationen im Blut. LARSON und TOUCHBERRY (1959) fanden steigende Gesamtproteinkonzentrationen im Alter und führten dies auf mit dem Alter steigende Antikörperfraktionen zurück. SHAFFER et al. (1981) zeigten mit zunehmendem Alter höhere Gesamtprotein- und Harnstoffkonzentrationen und sinkende Phosphor- und Calciumkonzentrationen. BERRY (2005) untersuchte den Verlauf von Blutkonzentrationen Deutscher Holstein Rinder im Alter von 3-24 Monaten. Sie konnte mit zunehmendem Alter höhere Gesamteiweiß-, Harnstoff-, Magnesium-, Vitamin A- und -E-Konzentrationen ermitteln und niedrigere Gesamtbilirubin-, AST-, GLDH-, Calcium- und Phosphor-, Kupfer- sowie Zinkkonzentrationen.
20 2.7.6 Laktationsstadium
Das Laktationsstadium hat laut LEE et al. (1978) einen signifikanten Einfluss auf die Blutkonzentrationen von Gesamtprotein und Calcium. Dabei zeigen laktierende Tiere höhere Gesamtprotein- und niedrigere Calciumkonzentrationen als nicht-laktierende Tiere, was auf die laktogene Calciumdrainage zurückgeführt wurde. KIDA (2003) errechnete im Rahmen von metabolischen Profiltests bei laktierenden und nicht-laktierenden Tieren sehr geringe positive Korrelationen (r = 0,12 bei n = 4679) vom Futtercalcium zum Serumcalcium. Auch KANTER (1986, Tabelle 5) konnte zeigen, dass mit steigender Milchmenge die Blutkonzentrationen von Phosphor sanken, während die vom Magnesium stiegen.
Tabelle 5: Mittlere Magnesium- und Phosphorkonzentrationen (mmol/l) im Rinderblut (n = 393) in Abhängigkeit von der Milchleistung (kg/Tag) (KANTER 1986) Milchleistung
(kg/Tag)
Magnesiumkonzentration (mmol/l)
Phosphorkonzentration (mmol/l)
10 1,2 1,75
20 1,8 1,55
30 1,9 1,50
40 2,3 1,30
CLAYPOOL (1976) konnte einen signifikanten Unterschied zwischen den Calciumkonzentrationen in den ersten 100 Tagen der Laktation (2,34 mmol/l) und dem Rest der Laktation absichern (2,43 mmol/l). KRONFELD et al. (1982) fanden einen signifikanten Unterschied für die AST zwischen hoch- und mittlaktierenden sowie trockenstehenden Kühen. Die Tiere, die sich in der Mitte der Laktation befanden, zeigten die höchsten Aktivitäten.
Darüber hinaus wurde ein Einfluss der Laktationszahl entdeckt. Nach FORAR et al. (1982) weisen Erstlaktierende signifikant höhere Phosphorkonzentrationen im Blut auf als multipare Tiere.
21 2.7.7 Blutentnahmeort
REDETZKY et al. (2003) ermittelten bei 12 Milchkühen höhere Werte von AST, ß-HBS und Calcium sowie niedrigere von Bilirubin, GLDH, Harnstoff, Magnesium und Phosphor im Blut der Vena jugularis gegenüber dem der Vena coccygea. Sie führten das auf den Fixationsstress bei der Entnahme aus der Halsvene zurück. Auch GOHARY und BICKHARDT (1979) haben Untersuchungen zum Blutentnahmestreß an 4 Schafen mithilfe von Dauerkathetern untersucht. Sie fanden signifikante Konzentrationserhöhungen für Magnesium, Gesamtprotein, Harnstoff und der AST durch Punktion der Jugularvene im Vergleich zur Blutentnahme aus den Verweilkathetern.
Signifikante Erniedrigungen fielen dagegen beim ß-HBS auf, wofür sie einen gesteigerten Energieumsatz vor allem im Herzmuskel verantwortlich machten. PARKER und BLOWEY (1974) fanden im Rinderblut signifikant höhere Konzentrationen an Calcium und Magnesium und signifikant niedrigere Konzentrationen an Phosphor im Blut der Jugularvene gegenüber der V.
coccygea. Die Blutzusammensetzung der Coccygealvene und -arterie unterschied sich dagegen nicht signifikant.
2.8 Bedeutung von ausgewählten Blutparametern im Stoffwechsel und deren Abhängigkeit von der Versorgung
Im Folgenden soll die Bedeutung ausgewählter Blutparameter im Stoffwechsel des Rindes näher erläutert werden. Außerdem soll deren Abhängigkeit von der Fütterung bzw. der Versorgung dargelegt werden.
2.8.1 Bedarfs- und Versorgungsempfehlungen der Mengen- und Spurenelemente
Um eine ausreichende Versorgung mit Mengen- und Spurenelementen zu gewährleisten, wurden Richtlinien für die Fütterung erstellt. Weltweit existieren mehrere dieser Versorgungsempfehlungen. Sie unterscheiden sich nur geringfügig voneinander. Die Empfehlungen
22
von ausgewählten Mengen- und Spurenelementen der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (2001) wurden der eigenen Untersuchung zugrunde gelegt. Sie sind den Empfehlungen des NRC (National Research Council, Nutrient Requirements of domestic animals) und des INRA (Institut National de la Recherche Agronomique) gegenübergestellt (Tabelle 6). Um eine einheitliche Darstellung zu gewährleisten, wurden die Werte von % und g/Tag in die Einheit g bzw. mg/kg Trockensubstanz (T) umgerechnet. Dabei wurde eine Tages-Milchmenge von 30 Litern bei einer Trockensubstanzaufnahme von 19,5 kg vorausgesetzt.
Tabelle 6: Unterschiedliche Versorgungsempfehlungen wissenschaftlicher Gesellschaften für Milchkühe mit ausgewählten Mengen- und Spurenelementen (in g bzw.
mg/kg T)
pro kg T GFE (2001) NRC (2001) INRA (1989)
Calcium (g)* 5,8 6,1 6,9
Magnesium (g)* 1,6 1,9 1,8
Phosphor (g)* 3,6 3,5 3,9
Kupfer (mg) 10 11 10
Zink (mg) 50 48 50
*beispielhaft für 30 l Milch/d und T-Aufnahme von 19,5 kg pro Tag
Die Erstellung von Versorgungsempfehlungen für landwirtschaftliche Nutztiere erfolgt vor allem unter Berücksichtigung von Dosis-Wirkungs-Studien bzw. faktoriellen Methoden (KIRCHGESSNER 1987). Letzteres gilt für die Mengenelemente (GFE 2001), wobei sich die unvermeidlichen Verluste neuerdings auf die aufgenommene Trockenmasse und nicht mehr auf die Lebendmasse der Tiere beziehen. Die Ableitung der Spurenelemente entstand mithilfe von Dosis- Wirkungs-Studien. Um dabei Unterschreitungen des Bedarfs in jedem Fall zu verhindern, wurden bei diesen Berechnungen Sicherheitszuschläge auf die errechneten Werte gegeben, so dass auch die Versorgung von hochleistenden Tieren zu jedem Zeitpunkt gewährleistet ist.
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2.8.2 Bedeutung von ausgewählten Mengenelementen im Stoffwechsel und deren Abhängigkeit von der Versorgung
2.8.2.1 Calcium
Viel Calcium (Ca) ist in Luzerne, Rotklee und Futterrübenblatt enthalten, wenig in Getreide, Extraktionsschroten, Hackfrüchten, Silomais und Stroh (GROPPEL 1995, 1996). Der Calciumgehalt des Grundfutters ist wesentlichen regionalen und jahreszeitlichen Schwankungen unterworfen (BUHMANN und GRÜNDER 1985). Eine Zufütterung ist daher bei hochleistenden Tieren grundsätzlich sinnvoll, um deren erhöhten Bedarf zu decken. Die GFE (2001) empfiehlt bei einer Milchleistung von 30 kg 5,8 g Ca/kg T (Tabelle 6). Im Tierkörper sind 9-13 g Calcium pro kg Körpergewicht (KGW) enthalten (PFEFFER 2000). Dieses liegt zu 99 % in Knochen und Zähnen vor und nur 1 % befindet sich in Weichgeweben und Blut. Das Calcium kann aus den Knochen mobilisiert werden, allerdings sind nur 0,5 % des Calciums rasch, der Rest ist eher langsam austauschbar (KAUNE 2000). Die Blutcalciumkonzentration ist stark homöostatisch geregelt und schwankt zwischen 2-3 mmol/l. Ein starkes Absinken nach der Kalbung charakterisiert den Zustand der Gebärparese (BLUM 1982). HOVE (1986) zeigte an 28 multiparen Kühen 24 Stunden nach der Kalbung ein Absinken der Calciumkonzentration von im Mittel etwa 2,5 auf 2,0 mmol/l. FÜRLL et al. (1994) konnten dasselbe Verhalten an 5 multiparen Kühen demonstrieren. In beiden Untersuchungen erreichte die Konzentration ihr Ausgangsniveau nach etwa 5 Tagen post partum.
Die Regulation der Blutcalciumkonzentration (Tabelle 7) übernehmen Parathormon (PTH) aus der Nebenschilddrüse, Calcitonin (CT) aus den C-Zellen der Schilddrüse und Calcitriol, der aktive Metabolit des Vitamins D3 aus der Niere (KAUNE 2000).
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Tabelle 7: Regulation des Calciumhaushalts (nach BLUM 1982)
Ca-Resorption Ca-Resorption
Ca-
Rückresorption Blutplasma
Darm Knochen Niere
PTH (↑) ↑ ↑ ↑
Calcitriol ↑ ↑ ↑ ↑
Calcitonin (↓) ↓ (↓) ↓
(↓↑) = keine direkten Effekte bekannt
Die Calciumresorption liegt bei etwa 50 % der aufgenommenen Calciummenge und vollzieht sich zum größten Teil im Dünndarm (GFE 2001). Sie hängt vom Angebot, dem Alter und der Vitamin D Versorgung ab (BUHM und GRÜNDER 1985). Die Aufgaben des Calciums im Organismus sind die Mineralisation des Skeletts, die Übertragung von Reizen und Erregung sowie die Beteiligung an der Blutgerinnung (WEISS 1993). Eine Mangelversorgung an Calcium führt zu verminderter Festigkeit der Knochen und Zähne (Rachitis, Osteoporose) und beim Wiederkäuer zur Muskelschwäche und zu schlafähnlichen bis komatösen Zuständen (PFEFFER 2000). Eine Überversorgung mit Calcium aber auch mit Vitamin D (z. B. in Goldhafer) kann zur verstärkten Ablagerung in Geweben (Calcinosen) und bei therapeutischem Einsatz zu Störungen der Herz- Kreislauf-Funktion führen (SCHWEIGERT 2000). Durch die starke homöostatische Regulation sind Schwankungen der Blutkonzentration kaum nachzuweisen. Lediglich nach der Kalbung kann die Calciumkonzentration im Blut absinken, da die enterale Resorption und die Mobilisierung aus dem Skelett die erhöhte Calciumausscheidung über die Milch unzureichend kompensieren bzw. die gegenregulatorischen Maßnahmen zwar einsetzen, die Wirkung aber zeitlich verzögert erst nach 12- 36 Stunden erfolgt (BLUM 1982). BUHM und GRÜNDER (1985) fanden keinerlei Zusammenhänge zwischen der Fütterung und der Blutcalciumkonzentration. Sie hatten 124 Milchkühe aller Laktationsstadien mit verschiedenen Calciumversorgungen von -30 bis +100 g Calcium im Vergleich zu den damaligen Versorgungsempfehlungen beprobt und keine Unterschiede in den Blutkonzentrationen finden können (Tabelle 8).
