3.5 Probenentnahme und chemische Analysen
3.5.4 Blutproben
3.5.4.1 Probengewinnung
Die Blutentnahmen erfolgten über die gesamte Laktation verteilt und zwar eine Woche vor dem errechneten Geburtstermin und 1, 4, 8, 16 und 36 Wochen post partum. Das Blut wurde morgens nach dem Füttern gegen 10 Uhr aus der Vena jugularis externa der Tiere entnommen. Die Blutentnahme erfolgte nach Fangen und Fixation der Tiere mit einem Halfterstrick im Boxenlaufstall. Mithilfe einer Staukette nach WITTE wurde die Vene kurzzeitig mäßig gestaut und zur Blutentnahme eine großlumige Kanüle (BD Microlance™ 3, 18G x 1½, 1,2 mm x 40 mm) benutzt. Das herausfließende Blut wurde mit Kunststoffröhrchen der Firma Sarstedt (10 ml, 95 x 16,8 mm) aufgefangen, wobei in den Plasmaröhrchen Lithium-Heparin als Gerinnungshemmer und in den Serumröhrchen Plastikkügelchen als Gerinnungsaktivatoren zugesetzt waren. Pro Blutentnahme wurden jeweils zwei Serum- und Plasmaröhrchen gefüllt, also ungefähr 40 ml Blut entnommen.
Zusätzlich wurde ein Versuch durchgeführt, in dem eventuelle tagesrhythmische Schwankungen und der Einfluss der Uhrzeit bei ad libitum Fütterung auf die Blutinhaltsstoffe überprüft werden sollten. Diese 24-Stunden-Versuche wurden vier Mal durchgeführt und zwar ebenfalls etwa eine Woche vor der Kalbung und 1, 4 und 8 Wochen nach der Kalbung. Hierzu wurden vier Tiere ausgewählt, die ungefähr den gleichen errechneten Kalbezeitpunkt hatten. Diesen Tieren wurde in zweistündigen Abständen über 24 Stunden pro Entnahme etwa 20 ml Blut (10 ml Serum/10 ml Plasma) entnommen, so dass über den gesamten Tag insgesamt 240 ml Blut pro Tier gewonnen wurden. Die Venen wurden abwechselnd auf beiden Halsseiten punktiert. Es wurde absichtlich kein
g1 = Erdbeschleunigung
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Verweilkatheter in die Venen verbracht, da sich die Tiere frei in ihrem Boxenlaufstall bewegen und nicht fixiert werden sollten, um weiterhin Futter ad libitum aufnehmen zu können.
Die Proben aller vier Tiere wurden zur Arbeitserleichterung an einem Tag genommen, obwohl letztendlich nicht alle vier am gleichen Tag kalbten.
Tabelle 26 zeigt daher die Kalbedaten und die Termine der 24-Stunden-Versuche zur Veranschaulichung der zeitlichen Abstände.
Tabelle 26: Kalbedaten der Tiere (n = 4) der 24-Stunden-Versuche und zeitliche Abstände der Entnahmetermine (1 Wo. a. p., 1, 4 und 8 Wo. p. p.) zur Kalbung
Tage a.p. Tage p.p. Tage p.p. Tage p.p.
Tiernummer Kalbung (~ 1 Wo. a.p.) (~ 1 Wo. p.p.) (~ 4 Wo. .p.p.) (~ 8 Wo. p.p.) o22 15.12.2003 12 3 24 52 o46 16.12.2003 13 2 23 51 o54 11.12.2003 8 7 28 56 o62 05.12.2003 2 13 34 62
3.5.4.2 Probenanalytik
Das gewonnene Blut wurde in den Röhrchen vorsichtig geschwenkt, um den Gerinnungshemmer der Plasmaröhrchen bzw. den Gerinnungsaktivator der Serumröhrchen in Form kleiner Plastikkugeln gleichmäßig zu verteilen. Nach schonendem Transport wurden die Plasmaröhrchen im Kühlschrank aufbewahrt, während die Serumröhrchen bei Zimmertemperatur ruhig stehen und vollständig gerinnen sollten. Nach ein bis zwei Stunden wurden die Blutproben dann bei 2120 g1 und 15 °C für 10 Minuten zentrifugiert (Varifuge 3. OR, Hereaus Sepatech). Der entstandene Überstand (Plasma oder Serum) wurde in 3,5 ml und 55 x 12 mm große Probenröhrchen der Firma Sarstedt überführt, verschlossen und bei –20 °C tiefgefroren gelagert. Die Serumproben wurden tiefgefroren in das Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht und dort auf bestimmte Blutinhaltsstoffe untersucht. Diese waren in Bezug auf den Gesamtstoffwechsel Gesamteiweiß, Harnstoff, Gesamtbilirubin und β-Hydroxybuttersäure, als
g1 = Erdbeschleunigung
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Leberenzyme AST, γ-GT und GLDH. An Mineralstoffen wurden die Gehalte von Calcium, Magnesium, Phosphor und die Spurenelemente Kupfer und Zink im Serum bestimmt. Außerdem wurden die Konzentrationen an ß-Carotin, Vitamin A und E gemessen. Dazu wurden die Proben langsam bei Zimmertemperatur aufgetaut, erneut zentrifugiert und danach wurde der Überstand für die einzelnen Messungen genutzt. Tabelle 27 zeigt die hierzu genutzten Methoden und Prinzipien.
Tabelle 27: Analysenmethoden und -prinzipien zur Messung der Blutinhaltsstoffe Bestimmungsmethode Prinzip
Calcium Ammonium-Molybdat-UV-Test kolorimetrisch
Magnesium Xylidylblau-Methode kolorimetrisch Phosphor Ammonium-Molybdat-UV-Test kolorimetrisch
Kupfer Wellenlänge 327,395 opt. Emmissionsspektrometrie Zink Wellenlänge 213,857 opt. Emmissionsspektrometrie ß-Carotin Optische Bestimmung semiquantitativer Farbtest Vitamin A Methode von Rammell fluoreszenzphotometrisch Vitamin E Methode von Rammell fluoreszenzphotometrisch
Eiweiß,ges. Biuretmethode kolorimetrisch
Harnstoff UV-Methode enzymatischer UV-Test
ß-HBS UV-Methode enzymatischer UV-Test
Bilirubin, ges. Jendrassik/Gróf-Methode kolorimetrisch AST Standardmethode der DGKC kinetisch-enzymatisch
γ-GT IFCC-Methode kinetischer Farbtest
GLDH Standardmethode der DGKC enzymatischer UV-Test
Zur Angabe der statistischen Sicherheit der Messverfahren gibt Tabelle 28 neben den Analysegeräten und den genutzten Reagenzien die Variationskoeffizienten für die Präzision bei Mehrfachmessungen an.
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Tabelle 28: Analysengeräte und -reagenzien zur Messung von Blutinhaltsstoffen mit den Variationskoeffizienten der jeweiligen Hersteller (VK in %) zur Präzision in der Serie
Gerät Reagenz VK (%) zur Präzision
Calcium Cobas-Mira Mti1 2,27
Magnesium Cobas-Mira HITADO2 3,97
Phosphor Cobas-Mira HITADO 3,4
Kupfer ICP-OES - 1,93
Zink ICP-OES - 4,07
Vitamin A HPLC Merck3 5,6
Vitamin E HPLC Merck 4,22
Eiweiß Cobas-Mira Sigma4 1,57
Harnstoff Cobas-Mira LT-SYS5 4,11
ß-HBS Cobas-Mira Randox6 7,4
Bilirubin Cobas-Mira LT-SYS 3,01
AST Cobas-Mira ABX7 3,82
γ-GT Cobas-Mira HITADO 5,48
GLDH Cobas-Mira Roche8 8,89
1 = mti Diagnostics, Idstein
2 = Hitado Diagnostic Systems, Möhnesee Delecke
3 = Fa. Merck, Darmstadt
4 = Sigma Diagnostics, Deisenhofen
5 = LT-SYS®, Berlin
6 = Randox Laboratories Ltd., United Kingdom
7 = ABX Deutschland, Göppingen
8 = Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Die Messung der Gesamtstoffwechselparameter, der Leberenzyme und der Mengenelemente erfolgte in einem Analysenvollautomaten (Cobas-Mira, Fa. Hoffmann-La Roche & Co. AG Diagnostika, Basel) bei 25 °C und die Ergebnisse wurden auf 37 °C umgerechnet. Die Messung der Spurenelemente erfolgte mit einem Emmissionsspektroskop und die der Vitamine mit einer HPLC.
Die Konzentration des ß-Carotins im Serum wurde rein optisch mit einem Test der Firma Hoffmann-La Roche durch Vergleich mit einer Farbskala beurteilt. Die Eichung und die
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Qualitätskontrollen der Geräte, sowie alle Messungen wurden dankenswerterweise vom Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vorgenommen.
Die Ergebnisse der Messungen wurden dann mit den Referenzwerten der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover verglichen, die Tabelle 29 zeigt.
Tabelle 29: Referenzwerte für Blutinhaltsstoffe der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Parameter Wert Einheit
Calcium 2,1-3 mmol/l
Magnesium 0,7-1,2 mmol/l
Phosphor 1,1-2,4 mmol/l
Kupfer 12-24 µmol/l
Zink 12-24 µmol/l
ß-Carotin >200 µg/dl
Vitamin A >0,3 mg/l
Vitamin E >3,0 mg/l
Eiweiß, ges. 60-80 g/l
Harnstoff <8 mmol/l
ß-HBS <1 mmol/l
Bilirubin, ges. <7 µmol/l
AST <50 U/l
γ-GT <20 U/l
GLDH <8 U/l