Aus der
BioVisioN AG, Hannover
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover
Differentielle Analyse des Peptidspektrums von Synovia und Blutplasma
bei Gonarthrose
vorgelegt von Astrid Johanne Buß
aus Aurich
2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 7. Mai 2007
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: PD Dr. med. Peter Schulz-Knappe Referent: PD Dr. med. Heinrich-Hubert Thole Korreferent: PD Dr. rer. nat. Andreas Pich
Tag der mündlichen Prüfung: 7. Mai 2007
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Ing. Klaus-Dieter Jürgens Prof. Dr. med. Sigurd Lenzen Prof. Dr. med. Thomas Brinker
An dieser Stelle möchte ich all jenen danken, die auf verschiedene Weise zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben, insbesondere:
Herrn PD Dr. Peter Schulz-Knappe für die Überlassung des Themas, sein großes Engagement und die sehr guten Arbeitsbedingungen in der BioVisioN AG.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Schultz, Herrn Prof. Dr. Christoph Lohmann und Frau Cornelia Sinn für die Bereitstellung des Probenmaterials und für die klinischen Daten.
Allen Patienten für ihre Teilnahme an der Studie.
Herrn PD Dr. Hans-Dieter Zucht für seine vielfältigen Ideen und Anregungen.
Herrn Dr. Hartmut Selle und Herrn Dr. Rüdiger Hess für die stete Ansprechbarkeit und Förderung meiner Arbeit.
Harald, Michael, Jens, Petra, Rudolf, Suse, Evelyn, Monika, Kirsten, Birgit, Kerstin, Daniela und allen anderen Mitarbeitern der BioVisioN AG für die tatkräftige Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Ralph für mittlerweile fünf wundervolle Jahre und sein Verständnis, wenn gemeinsame Aktivitäten mal wieder der Fertigstellung dieser Arbeit zum Opfer fielen.
Meinem Bruder Holger für sein großes Interesse und viele fachliche Tipps.
Allen meinen Freunden für ihre Geduld und stete Bereitschaft zur Ablenkung von der Arbeit.
Ganz herzlich meiner Familie für den großen Rückhalt. Die liebevolle Unterstützung meiner Eltern hat mir mein Studium und die Durchführung dieser Arbeit ermöglicht.
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung... 1
I.1 Arthrose ... 1
I.1.1 Definition und Terminologie... 1
I.1.2 Epidemiologie und volkswirtschaftliche Bedeutung ... 1
I.1.3 Klassifikation, Ätiologie und Pathogenese ... 3
I.1.4 Klinik, Diagnostik und Therapie... 9
I.1.5 Biomarkerforschung... 18
I.2 Peptidomics... 21
I.2.1 Bedeutung von Peptiden im Organismus... 21
I.2.2 Entschlüsselung komplexer molekular-biologischer Vorgänge... 23
I.3 Zielsetzung der Arbeit ... 29
II. Patienten und Methoden... 30
II.1 Aufbau der Studie... 30
II.1.1 Gewinnung des Probenmaterials ... 30
II.1.2 Patientendaten... 31
II.1.3 Ausschlusskriterien... 32
II.1.4 Radiologische Beurteilung des Arthrosegrades... 33
II.2 Experimentelle Durchführung ... 34
II.2.1 Benutzte Geräte... 34
II.2.2 Reagenzien, Peptidstandards und Chromatographiemedien... 35
II.2.3 Differential Peptide Display ... 36
II.2.3.1 Hyaluronidase ... 37
II.2.3.2 Ultrafiltration... 37
II.2.3.3 Fällung mit Trichloressigsäure... 37
II.2.3.4 Reversed-Phase-Chromatographie ... 38
II.2.3.5 Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie ... 38
II.2.3.6 Datenauswertung... 39
II.2.3.7 Identifizierung der differenzierenden Peptidignale... 41
II.2.3.7.1 Fällung mit Trichloressigsäure... 41
II.2.3.7.2 Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford... 41
II.2.3.7.3 Reversed-Phase- und Kationenaustauschchromatographie... 42
II.2.3.7.4 Elektrospray-Quadrupol Time-of-flight Tandem-Massenspektrometrie ... 43
III. Ergebnisse... 44
III.1 Struktur des Patientenkollektives... 44
III.1.1 Klassifikation nach Kellgren und Lawrence ... 44
III.1.2 Alters- und Geschlechterverteilung... 45
III.1.3 Diagnosen und Beschwerdedauer... 48
III.1.4 Arzneimittelgebrauch und Comorbidität ... 50
III.1.5 Probenausschluss ... 50
III.2 Auswertung des experimentellen Teils ... 51
III.2.1 Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford... 51
III.2.2 Probenvorbereitung ... 51
III.2.3 Chromatographie ... 51
III.2.4 Peptidemapping ... 53
III.2.4.1 Vergleich der Peptidkarten von Synovialflüssigkeit und Plasma... 53
III.2.4.2 Vergleich verschiedener Krankheitsstadien... 54
III.2.5 Weiterführende statistische Analysen ... 58
III.2.5.1 Vergleich der Signalintensitäten ... 58
III.2.5.2 ROC-Analyse... 58
III.2.5.3 Regressions- und Korrelationsanalyse, prädikative Werte und Fallzahl ... 61
III.2.5.4 Sequenzierung und identifizierte Peptide ... 64
IV. Diskussion... 67
IV.1 Verschiedene Ansätze in der Biomarkerforschung... 67
IV.2 Anforderungen an einen Biomarker zur Diagnostik von Gelenkerkrankungen ... 70
IV.3 Messung in verschiedenen Untersuchungsmaterialien ... 72
IV.4 Statistische Beurteilung der Markergüte... 75
IV.5 Sequenzierungsergebnisse ... 79
V. Zusammenfassung... 82
VI. Summary... 83
VII. Literaturverzeichnis... 84
VIII. Abkürzungsverzeichnis... 94
Curriculum vitae... 96
Erklärung nach §2 Abs. 5 und 6 PromO ... 97
I. Einleitung
I.1 Arthrose
I.1.1 Definition und Terminologie
Die Arthrose, auch Osteoarthrose genannt, ist eine fortschreitende, primär nicht entzündliche, degenerative Veränderung der Knorpel- und Knochenstruktur eines oder mehrerer Gelenke. In der englischsprachigen Literatur gebräuchliche Synonyme sind Osteoarthrosis bzw.
Osteoarthritis, degenerative Arthrosis/Arthritis und Arthrosis/Arthritis deformans [Hackenbroch, M. 1935; Lorenz, A. 1939]. Letzteres bringt die zunehmende Schädigung der Gelenkstruktur zum Ausdruck. Die Bezeichnungen beginnend mit „Osteo-“ betonen die Beteiligung des gelenknahen Knochens am Krankheitsprozess. Die Endung „-itis“ deutet die sekundär, reaktiv entstehende entzündliche Komponente der Erkrankung an.
Es handelt sich bei der Arthrose um eine heterogene Gruppe sich teilweise überlappender Erkrankungen verschiedenster Ätiologien mit ähnlichen biologischen und morphologischen Gelenkveränderungen als gemeinsame Endstrecke [Pullig, O. et al. 2001]. Sie ist definiert als ein chronisch progressives Krankheitsbild, das gekennzeichnet ist durch Veränderungen des Gelenkknorpels, der Struktur und Form der Gelenkflächen, der Gelenkkapsel und der Synoviabeschaffenheit, meist unter Mitbeteiligung des subchondralen Knochengewebes.
Prädilektionsstellen sind die Hüft-, Knie-, Wirbel- und Interphalangealgelenke [Gesundheitsberichterstattung des Bundes 1998; Günther, K.P. et al. 2002; Valley, V. et al.
2005].
I.1.2 Epidemiologie und volkswirtschaftliche Bedeutung
Die Arthose ist keine Erscheinung der Neuzeit, sondern ein sehr altes Leiden: So wurden an Skeletten von Neandertalern und Funden aus dem Neolithikum [Miehle, W. 2000] ebenso wie bei der 1991 in den Ötztaler Alpen entdeckten Mumie eines vor etwa 5000 Jahren
verstorbenen Mannes, der als “Ötzi“ bekannt wurde, arthrotische Veränderungen der Gelenke festgestellt [Spindler, K. 2001]. Es handelt sich weltweit um die häufigste Form aller Gelenkveränderungen und die häufigste chronische Erkrankung in den Industrienationen [Felson, D.T. et al. 1988; Lohmander, L.S. 2000; Mollenhauer, J.A. et al. 2002, Swoboda, B.
2001]. Trotz unterschiedlicher Häufigkeit bei verschiedenen ethnischen Gruppen ist die Arthrose gekennzeichnet durch eine außerordentlich hohe Prävalenz in allen geographischen Regionen [Hoaglund, F.T. et al. 1973].
Die bestehende Datenbasis zur Epidemiologie der Arthose ist aufgrund methodischer Probleme bei der Falldefinition (vgl. K. I.1.4) sehr uneinheitlich und zur exakten quantitaven Beschreibung der sozialmedizinischen Bedeutung nicht ausreichend [Gesundheitsberichterstattung des Bundes, 1998; Hunsche, E. et al. 2001; Swoboda, B. 2001].
Gegenwärtig bestehen nach auf niederländischen Daten [van Saase, J.L. et al. 1989]
beruhenden Schätzungen des Statistischen Bundesamtes bei 35 Millionen Deutschen radiologisch sichtbare degenerative Gelenkveränderungen. 15 Millionen haben zumindest zeitweise Beschwerden, 5 Millionen häufig. Gesichert ist, dass Prävalenz und Inzidenz mit fortschreitendem Alter zunehmen. Während nur 4 % der 20-jährigen an Arthrose leiden, sind es 70 % der über 70-jährigen. Deshalb ist aufgrund der gegenwärtigen Altersentwicklung der Bevölkerung in den Industrienationen von einer weiter zunehmenden sozioökonomischen Bedeutung der Arthrose auszugehen. Waren 2001 24 % der Bevölkerung 60 Jahre alt oder älter und hatten 4 % sogar ein Alter von 80 Jahren oder mehr, steigt Schätzungen zufolge im Jahr 2050 der Anteil der mindestens 60-jährigen auf 37 % und der der mindestens 80-jährigen auf 12 %. Die Lebenserwartung soll um rund 6 Jahre (bei Frauen auf 86,6 Jahre, bei Männern auf 81,1 Jahre) steigen [Pötzsch, O., et al. 2003]. Damit werden immer mehr Menschen ihre Arthrose „erleben“.
Die indirekten, nicht-medizinischen Kosten z. B. durch Arbeitsunfähigkeitstage, Frühbe- rentungen und Versorgung durch Dritte wiegen mindestens genauso schwer oder übertreffen sogar die direkten Behandlungskosten der Arthrose [Hunsche, E. et al. 2001; Leardini, G. et al. 2004]. Auch durch Nebenwirkungen der Therapie mit nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAID), z. B. gastrointestinale Blutungen, entstehen beträchtliche Kosten [Hunsche, E. et al.
2001]. Die Gonarthrose belegte 2003 in Deutschland Rang 6 bei den häufigsten Anlässen zur vollstationären Behandlung von weiblichen Patienten [Statistisches Bundesamt, 2005].
Erkrankungen des Bewegungsapparates im Allgemeinen verursachen bei Männern wie Frauen nach Erkrankungen des Herz-Kreislauf- und Verdauungssystems die meisten Behand- lungskosten und waren führender Grund zur Frühberentung [Gesundheitsberichterstattung des Bundes, 1998/2002].
Die WHO trägt der zunehmenden Bedeutung der Gelenkerkrankungen Rechnung, indem sie die Jahre 2001 – 2010 zur „world bone decade“ ausgerufen hat.
I.1.3 Klassifikation, Ätiologie und Pathogenese
Nach ätiologischen Gesichtspunkten erfolgt die Klassifikation in primäre und sekundäre Arthrosen [Mitchell, N.S. et al. 1977]. Die primären Arthrosen, deren Ursache unbekannt ist (idiopathisch), werden unterteilt in lokalisierte Arthrosen mit singulärem Gelenkbefall und generalisierte Arthrosen mit dem Befall von mehr als drei Gelenkregionen [Altman, R. et al.
1986]. Als Auslöser vermutet man ein Zusammenspiel genetischer, nutritioneller, hormoneller und altersabhängiger Prozesse. Sie manifestieren sich meist erst im fortgeschrittenen Alter.
Von einigen Autoren werden die Polyarthrosen als selbständige Krankheitsgruppe interpretiert, da sie sich in ihren Eigenschaften stark von den übrigen Arthroseformen unterscheiden [Hackenbroch, M.H. 2002].
Die in der Regel oligoartikulär auftretenden sekundären Arthrosen sind Folgen bestimmter Grundkrankheiten und weisen in der Vorgeschichte einen für einen degenerativen Gelenkprozess prädisponierenden Faktor auf, eine sogenannte präarthrotische Deformität oder Präarthrose [Hackenbroch, M. 1943]. Sie führen vorzeitiger zu Beschwerden als die primären Arthrosen.
Arthropathien sind der Arthrose nahe stehende Gelenkerkrankungen, die im weiteren Krankheitsverlauf in sekundäre Arthrosen münden.
Tab. I-1 fasst die möglichen Ätiologien der Arthrose zusammen:
Tabelle I-1 Ätiologie der Arthrose [modifiziert nach Reichel, H. 2000]
Ätiologische Gruppe Ursache
Entzündliche Genese Rheumatoide Arthritis
Juvenile rheumatoide Arthritis Lokale Arthritis
Metabolische Genese Alkaptonurie
Diabetes mellitus Hyperlipoproteinämien
Morbus Wilson Nephrokalzinose
Gicht Hämochromatose Chondrokalzinose
Rachitis
Endokrine Genese Akromegalie
Hypothyreose Hyperparathyreoidismus
Gerinnungsstörung Hämophilie
Gelenkdeformitäten und –inkongruenzen Posttraumatische Kongruenzstörungen Postarthritische Kongruenzstörungen
Osteochondrosis dissecans Aseptische Knochennekrosen
Meniskektomie
Sonstige mechanische Genese Genu varum/valgum/recurvatum Sub-/Luxationen Chronische artikuläre Instabilität Unbehandelte Meniskusläsionen
Beinlängendifferenzen
Kompensatorische Überbelastung (Funktions- störungen der Nachbargelenke, Arthrodesen,
Klumpfuß, nach Amputation etc.) Unphysiologische Entlastung bzw. Immobilisation
Neurogene Genese Tabes dorsalis
Diabetische Neuropathie Syringomyelie
Periphere Nervenläsion (Charcot Gelenk)
Osteopathien Morbus Paget
Kollagenosen Marfan-Syndrom
Ehlers-Danlos-Syndrom
Endemische Arthrosen Kashin-Beck-Krankheit
Zwar gibt es manifeste Risikofaktoren, aber keiner sollte isoliert betrachtet werden, da erst ein Zusammenspiel mehrerer Faktoren zur Auslösung einer Arthrose führt. Eine starke Gelenkbelastung ist ein möglicherweise ursächlicher, aber alleine nicht ausreichender Faktor [Reichel, H. 2000]: Ein intensiv gebrauchtes und ansonsten gesundes Gelenk erträgt bis ins hohe Alter große Belastungen, wenn die initiale mechanische oder enzymatische Knorpelläsion ausbleibt. Es entwickelt sich lediglich das sogenannte Altersgelenk [Hackenbroch, M.H. 1979; Rutishauser, E. et al. 1955] mit typischer diffuser Demineralisierung und schmerzfreier enggradiger Bewegungseinschränkung ohne sichere klinische oder radiologische Arthrosezeichen. Auch die biochemische Zusammensetzung des Knorpels im Altersgelenk ist eine andere als in arthrotisch veränderten Gelenken [Grushko, G. et al. 1989; Venn, M.F. 1978]. Es handelt sich bei der Arthrose um mehr als einen Alterungsprozess. Es ist davon auszugehen, dass jahrzehntelang auf den Knorpel einwirkende mechanische Belastungen und Umweltfaktoren bei vorliegender genetischer Prädisposition [Dieppe, P. 1995] oder präarthrotischer Deformität die Gelenkeinheit dekompensieren lassen.
Haglund beschrieb bereits 1923 die Arthrose als Endstadium nach diversen artikulären Vorerkrankungen [Haglund, P. 1923]. Allgemein anerkannte oder diskutierte Risikofaktoren sowie die Pathogenese der Arthrose zeigt Abb. I-1.
Gesicherte Kenntnisse über die Rolle genetischer Faktoren liegen noch kaum vor, diskutiert werden u. a. Mutationen des Typ 2 Pro-Kollagen Gens (COL2A1) auf Chromosom 12 [Knowlton, R.G. et al. 1990; Palotie, A. et al 1989], ein Polymorphismus des Vitamin D- und Östrogenrezeptors sowie eine Veränderung der Genregion des Chromosoms 2, die für Fibronectin, den Interleukin-8 Rezeptor und die α-2 Kette des Kollagen Typ 5 kodiert [Sowers, M. 2001; Woitge, H.W. et al. 1999]. Eine von Loughlin et al. durchgeführte Studie konnte allerdings keine Assoziation dieser Gendefekte mit einer Prädisposition für Arthrose nachweisen [Loughlin, J. et al. 2000].
Generell erkranken Frauen häufiger an einer Arthrose – dies gilt als gesichert für die Polyarthrose der Finger und die (bilaterale) Gonarthrose [Adams, P.F. et al. 1992; Davis, M.A. et al. 1989; Hughes, S.L. et al. 1995]. Möglicherweise besteht ein Zusammenhang mit der postmenopausalen Hormonumstellung. Am Hüftgelenk erkranken dagegen Männer nach radiologischen Kriterien früher und häufiger. Sie haben aber kaum öfter als Frauen unter Hüftschmerzen zu leiden. Kaukasier scheinen häufiger von der Arthrose, zumindest von der
des Hüftgelenkes, betroffen zu sein als amerikanische Indianer, Afrikaner und Asiaten [Sun, Y. et al. 1997].
Abbildung I-1 Risikofaktoren (RF) und Pathogenese: Bei günstiger RF-Konstellation entwickelt sich ein Altersgelenk, bei ungünstiger Konstellation entsteht ein Circulus vitiosus im pathogenetischen Ablauf der Arthrose.
Studien zum Einfluss eines erhöhten Körpergewichts auf die Entwicklung einer Arthrose kamen zu widersprüchlichen Ergebnissen. Vermutlich führt eine Gewichtsreduktion bei bereits bestehender Gonarthrose der Frau zu einer Verbesserung der Beschwerden und möglicherweise zu einer Verzögerung der Progredienz [Felson, D.T. et al. 1992]. Eine Diät ist am effektivsten in Kombination mit Physiotherapie und verbessert Knieschmerz und Gelenkfunktion [Messier, S.P. et al. 2004]. Die „Ulm Osteoarthrose-Studie“ [Günther, K.P. et al. 2002] wies einen eindeutigen Zusammenhang zwischen Übergewicht und bilateraler Gonarthrose nach, während bei Patienten mit Coxarthrose kein signifikanter Zusammenhang bestand.
Die gesamte funktionelle Einheit des Gelenkes bestehend aus Knorpel, subchondralem Knochen, Synovia, Synovialis, Kapsel-/Bandapparat und Muskelmantel, das
„Artikulationsorgans“ [Otte, P. 2000], ist in den Krankheitsprozess mit einbezogen. Die zentrale Rolle in der Pathologie der Arthrose spielt jedoch der hyaline Gelenkknorpel, der die knöchernen Gelenkkörper überzieht. Hierbei handelt es sich um eine nur wenige Millimeter dicke, jedoch hochdifferenzierte Gewebeschicht. Die Chondrozyten stellen den einzigen zellulären Baustein dar. Sie sind in die extrazelluläre Matrix, die über 90 % des Gewebevolumens ausmacht, eingebettet. Gefäße, Nerven und Lymphbahnen fehlen [Pullig, O. et al. 2001; Swoboda, B. et al. 1996]. Ernährt wird der Knorpel durch die Synovialflüssigkeit oder Synovia, eine klare, viskose Flüssigkeit. Es handelt sich um ein Dialysat des Blutserums, das reich an Hyaluronsäure ist. Dieses spezifische Sekretionsprodukt wird von den Synoviozyten der Gelenkkapsel, die die Synovialis (Synovialmembran) formen, gebildet. Die Synovia dient der Gelenkschmierung und Ernährung des hyalinen Knorpels.
Eine Kapselschädigung gleich welcher Art kann ihre Produktion beeinträchtigen. In der Synovialmembran gebildete Entzündungsmediatoren schädigen die Knorpelmatrix und können so die Entstehung einer Arthrose fördern. Motor des stetigen Substrataustausches über die Diffusionsstrecke Synovialisgefäße, Synovia und Knorpel ist die intermittierende Kompression mit kontinuierlicher verformender „Massage“ durch physiologische Belastung und Bewegung. Extreme Zustände, Überbelastung ebenso wie Immobilisierung, können irreversible Schädigungen zur Folge haben.
Hauptmatrixbestandteile sind die für die Festigkeit des Knorpels verantwortlichen Kollagene, v.a. Typ-II-Kollagen, und die Proteoglykane, v.a. Aggrekan, die für die hydroelastische Verformbarkeit sorgen. Die Kollagene bilden ein hochorganisiertes Fasernetz, in das
Proteoglykane und kleine nicht-kollagene Matrixproteine eingelagert sind. Die Proteoglykane sind in ihrer Struktur mit einer „Flaschenbürste“ vergleichbar, deren Stiel von einem Protein und deren Borsten von Polysaccharidketten gebildet werden. Durch Bindung an Hyaluronsäureketten über das „link protein“ bilden sich anionische Aggregate mit hoher Wasserbindungsfähigkeit. Es entsteht ein starker osmotischer Druck, der zu Wassereinlagerung und der prallelastischen Struktur des Knorpels führt.
Entsprechend den biomechanischen Anforderungen (Stützfunktion, Druckkompensation, Nährstofftransport, Signalübertragung) sind die Kollagenfibrillen in der Vertikalebene zonenspezifisch angeordnet [Pullig, O. et al. 2001]: Nämlich parallel zur Knorpeloberfläche in der superfiziell liegenden Tangentialschicht und senkrecht zur Knorpeloberfläche in der mittleren und tiefen Knorpelzone (Übergangs- bzw. Rädiärzone). In der mittleren und tiefen Zone sind die Chondrozyten von einer perizellulären Matrix umgeben, die aus einem korbartig angeordneten Geflecht aus Kollagenfibrillen besteht.
Kennzeichen der Arthrose ist der kontinuierliche Knorpelverlust, der auf einem Ungleichgewicht zwischen Belastung und Belastbarkeit des Knorpels beruht. Dieses Missverhältnis kann primär mechanisch oder metabolisch initiiert sein. Bei der mechanisch bedingten Induktion führt eine pathologische Spannungsverteilung zur lokalen Überlastung und zum Überschreiten der Toleranzschwelle des Knorpels. Die enzymatisch bedingte Knorpelzerstörung basiert auf einem Überwiegen kataboler Stoffwechselvorgänge. Es lassen sich vermehrt proteolytische Enzyme (Kollagenasen, Stromelysine, Gelatinasen, Aggrekanasen), die von den Chondrozyten [Sokoloff, L. 1982] und den Zellen der gereizten Synovialis [Puhl, W. et al. 1978] gebildet werden, nachweisen. Beide Mechanismen führen zur Zerstörung der Chondrozyten und Freisetzung weiterer degradierender, proteolytischer Enzyme, die einerseits die Knorpeldegeneration fördern (sekundäre Knorpelläsion), andererseits eine Reizung der Synovialmembran verursachen (Detritussynovitis).
Ohne therapeutisches Eingreifen resultiert ein Circulus vitiosus aus anhaltender Entzündung mit progredienter Knorpelzerstörung (Abb. I-1). Schließlich endet ein anfänglich oberflächlicher Proteoglykanverlust mit der Freilegung des kollagenen Netzwerkes [Sokoloff, L. 1980], was einen vermehrten Einstrom von Wasser und Makromolekülen nach sich zieht. Nach dieser anfänglichen Knorpelerweichung entstehen Spalten und Fissuren, die bis zur subchondralen Knochengrenzlamelle reichen können. Als Reaktion des Knorpels auf
die veränderten biomechanischen und physikalischen Eigenschaften verbreitert sich die „tide mark“, die Grenze zwischen dem eigentlichen Knorpel und dem verkalkten Knorpel am Übergang zum Knochen [Howell, D.S. 1980].
Knorpel ist ein bradythrophes Gewebe, das aufgrund seiner Avaskularität und des langsamen Stoffwechsels auf Schäden kaum mit regenerativen Prozessen antworten kann. Die sogenannte Brutkapselbildung stellt den Versuch der Chondrozyten dar, durch Proliferation die Synthese extrazellulärer Matrix zu steigern und den Knorpelverlust zu kompensieren [Dustmann, H.O. et al. 1978]. Dies gelingt aber nur in quantitativ unzureichendem Maß. Bei Eröffnung des subchondralen Markraumes wird der Knorpel zwar in seiner Menge vollständig durch sich chondroid umwandelndes Granulationsgewebe ersetzt, doch ist dieser Ersatzknorpel qualitativ minderwertig und erliegt auf Dauer der Degeneration [Otte, P. 1974].
Bei überwiegend enzymatischer Genese fehlen die beschriebenen Reparationsvorgänge. Es kommt dann zu raschem Knorpelverlust ohne morphologische Anpassungen. Schließlich liegt der subchondrale Knochen bloß. Das Reiben der Gelenkkörper führt zu fortschreitender Deformität. In den Randzonen der Gelenke entstehen Osteophyten, wahrscheinlich im Rahmen enchondraler Osteogenese. Vermutlich reduzieren diese Exostosen im Sinne einer Abstützreaktion durch Vergrößerung der Auflagefläche den auf das Gelenk einwirkenden Druck und führen gleichzeitig durch Einschränkung der Beweglichkeit zu einer Ruhigstellung des Gelenkes. Der subchondrale Knochen reagiert mit Sklerosierung (Spongiosaverdichtung) auf den dauerhaft pathologisch erhöhten Druck und mit Bildung subchondraler Zysten und Pseudozysten als Ausdruck umschriebener Nekrosen [Zacher, J. et al. 2001]. Die Kapselfibrose und Verformung der Gelenkkörper schränken die Beweglichkeit immer weiter ein, so dass es im Spätstadium zur fibrösen, selten zur knöchernen Einsteifung des Gelenkes kommt [Debrunner, A.M. 1994]. Einige der beschriebenen morphologischen Veränderungen sind in Abb. I-2 schematisch dargestellt.
I.1.4 Klinik, Diagnostik und Therapie
Die Diagnose der Arthrose folgt aus der Kombination unspezifischer, aber typischer Symptome, allen voran der Schmerz und die Funktionseinschränkung des Gelenkes.
Allmählich entwickelt sich ein charakteristischer Anlauf- oder Einlaufschmerz, gefolgt von einer schmerzfreien Phase, die aber nach Erreichen der Belastbarkeitsgrenze endet. In
Spätstadien kann ein Dauerschmerz auftreten, der die Nachtruhe stören und völlig aufheben kann. Morgensteifigkeit der Gelenke ist möglich, hält aber im Gegensatz zur rheumatoiden Arthritis nur kurz an.
Abbildung I-2 Vergleich des A) gesunden Kniegelenkes mit einem B) arthrotisch veränderten Knie, das Knorpelzerstörung und Osteophytenbildung zeigt. Weitere typische Merkmale der Arthrose sind Kapselverdickung, Hypertrophie der Synovialis und subchondrale Sklerose. [Aus: Information booklet Osteoarthritis, Arthritis Research Campaign 2004]
A)
B)
Allein anhand der klinischen Symptome und dem körperlichen Untersuchungsbefund mit Krepitationen bei Bewegung, Vergröberung der Knochenkontur, Bewegungseinschränkung und oftmals Atrophie der gelenknahen Muskulatur gelingt die Diagnosestellung der Arthrose auch ohne Röntgenbild mit hoher Sensitivität. Vom American College of Rheumatology (ACR) wurden Klassifikationskriterien der Arthrose erarbeitet [Altmann, R. 1986]. Je mehr Kriterien erfüllt sind, desto spezifischer gelingt die Stellung der Diagnose (Tab. I-2).
Tabelle I-2 ACR-Klassifikation der Gonarthrose
Klinische Befunde Klinische & Radiologische Befunde
Klinische & Laborbefunde
Knieschmerz und mindestens drei der folgenden sechs Parameter
(Sensitivität 95 %, Spezifität 69 %)
Knieschmerz und mindestens einer der folgenden drei Parameter (Sensitivität 91 %, Spezifität 86 %)
Knieschmerz und mindestens fünf der folgenden neun Parameter
(Sensitivität 92 %, Spezifität 75 %) oder
Knieschmerz und mindestens vier der folgenden sechs Parameter
(Sensitivität 84 %, Spezifität 89 %)
• Alter > 50 Jahre
• Morgensteifigkeit < 30 min
• Krepitation
• Druckschmerz am Knochen
• Vergröberung der Knochenkonturen
• Keine tastbare Überwärmung
• Alter > 50 Jahre
• Morgensteifigkeit < 30 min
• Krepitation & Osteophyten
• Alter > 50 Jahre
• Morgensteifigkeit < 30 min
• Krepitation
• Druckschmerz am Knochen
• Vergröberung der Knochenkonturen
• Keine tastbare Überwärmung
• BSG < 40 mm/1. Stunde
• Rheumafaktor < 1:40
• Zeichen eines arthrotischen Gelenkergusses
Röntgenaufnahmen des betroffenen Gelenkes dienen der Sicherung der Diagnose.
Veränderungen wie Gelenkspaltverschmälerung als Zeichen für eine Verminderung des Knorpels, später Osteophytenbildung und Sklerosierung des subchondralen Knochens spiegeln die pathologisch–anatomischen Vorgänge wider. Allerdings ist bei Auftreten dieser Veränderungen die Arthrose bereits recht weit fortgeschritten.
Folgende verschiedene klinische Stadien können unterschieden werden [Hackenbroch, M.H.
2002; Zacher, J. et al. 2001]:
• Stumme oder latente Arthrose: aktuell keine Symptome, in der Vorgeschichte eventuell aktive Erkrankungsphasen, radiologische Arthrosezeichen;
• Manifeste Arthrose: deutlicher Schmerz und messbare Funktionseinschränkung, Radiologie meist positiv;
• Aktivierte Arthrose: Zusätzlich zum Schmerz deutliche Ergussbildung, sichtbare Funktionseinschränkung und Schwellung, Radiologie meist positiv;
• Dekompensierte Arthrose: Symptomatik konservativ nicht mehr beherrschbar, Radiologie positiv;
Häufig besteht gerade im Frühstadium der Arthrose eine große Diskrepanz zwischen klinischem Beschwerdebild und Röntgenbefund [Reichel, H. 2000, Zacher, J. et al. 2001].
Starke Beschwerden können auftreten, denen meist eine Synovialitis zu Grunde liegt. Im Röntgenbild finden sich jedoch lediglich diskrete Veränderungen. Umgekehrt können Patienten mit deutlichen radiologischen Zeichen einer Arthrose bei fehlender synovialer Reizung nur geringe Beschwerden haben. Lediglich 40 - 50 % aller röntgenologisch detek- tierten Arthrosen sind klinisch auffällig [Weseloh, G. et al. 1983]. Spätestens mit Beginn der synovialen Reaktion macht sich die Arthrose auch klinisch durch lokale Entzündungszeichen und Schmerz bemerkbar.
Die Stadieneinteilung der Arthrose aufgrund radiologischer Veränderungen geht zurück auf Kellgren und Lawrence [Kellgren, J.H. et al. 1957], wurde 1963 vom Empire Rheumatism Council adaptiert und baut auf folgenden klassischen Röntgenzeichen auf:
Gelenkspaltverschmälerung, subchondrale Sklerose, Knochenzysten, Osteophyten (vgl. K.
II.1.4). Diese Klassifizierung hat wegen ihrer unzureichenden Sensitivität bei der Progressionsbeurteilung [Günther, K.P. et al. 1997] geringe klinische Relevanz und dient hauptsächlich Studienzwecken. Auf numerischen Bewertungssystemen aufgebaute Scores wie der WOMAC- und der Lequesne-Arthroseindex spiegeln die jeweilige klinische Situation wider, liefern jedoch keine phasenunabhängige Definition des Schweregrades. Sie basieren auf subjektiven Kriterien, die auch bei Gebrauch einer Schmerzskala schwer zu reproduzieren sind. Eine sowohl radiologisch wie klinisch befriedigende Stadieneinteilung der Arthrose existiert nicht.
Weitere bildgebende Verfahren wie Kernspintomographie und Knochenszintigraphie sind geeignet zur Beantwortung spezieller Fragestellungen. So ermöglicht die Kern- spintomographie im Gegensatz zum konventionellen Röntgen eine direkte Abbildung des Knorpels sowie eine Beurteilung subchondraler Veränderungen und der Osteophytenaktivität.
Auch kleinere Oberflächendefekte und intrachondrale Läsionen und die Entzündung der Synovialis können inzwischen auf diese Weise sichtbar gemacht werden [Graichen, H. et al.
2000; Loeuille, D. et al. 2005]. Die Zunahme der tomographisch gemessenen Verdickung der Synovialis korreliert gut mit dem Kellgen- und Lawrence-Score [Hill, C.L. et al. 2001].
Die sichere Beurteilung von Menisken und Bändern ist vor allem zur Differentialdiagnose im frühen Krankheitsstadium hilfreich. Die Knochenszintigraphie mit 99mTc liefert Informationen über die Aktivität des gelenknahen subchondralen Knochens, der als Target der Ursachen- und Prognoseforschung aktuell in den Fokus gerückt ist. Beide Methoden sind von hohem wissenschaftlichem Interesse, spielen in der derzeitigen klinischen Routine aber noch kaum eine Rolle. Die Sonographie ermöglicht eine gute Beurteilung des Weichgewebes und flüssigkeitsgefüllter Räume. Sie ist daher hauptsächlich im Schulter- und Hüftbereich zum Nachweis von Gelenk- oder Schleimbeutelergüssen und zur Beurteilung gelenknaher Sehnen- und Labrumschädigungen indiziert.
Mit Hilfe von Laboruntersuchungen kann eine entzündliche Genese der Gelenkbeschwerden ausgeschlossen werden. Bei der kompensierten Arthrose sind die Entzündungszeichen im Serum negativ: Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit (BSG), C-reaktives Protein (CRP), Leukozytenzahl und Eiweißfraktionen in der Elektrophorese liegen im Normbereich. Im Gelenkerguss sind weder Rhagozyten (Hinweis auf RA) noch Kristalle nachweisbar, die Viskosität ist nur wenig herabgesetzt. Farbe und Eiweißgehalt der Synovia sind unauffällig.
Im Rahmen der Entzündungsreaktion ändern sich die Eigenschaften der Synovia (Tab. I-3).
Die Viskosität ist herabgesetzt, aber im Vergleich zum entzündlich rheumatischen Gelenkerguss hoch. Das Gesamtprotein ist erhöht, aber niedriger als bei primär entzündlichen Effusionen [Partsch, G. 2000; Zacher, J. et al. 2001].
Der Wert der Synoviaanalyse liegt damit bisher im Wesentlichen in einer Ausschlussdiagnostik bei differentialdiagnostischen Zweifelsfällen. Auf biochemische Marker der Arthrose wird im K. I.1.5 eingegangen.
Tabelle I-3 Laborwerte bei Arthrose und chronischer Polyarthritis [Partsch, G. 2000]
Parameter Gesundes Gelenk Arthrose
(Reizerguss)
Chronische Polyarthritis
Volumen ≤ 3,5 mL > 3,5 mL Bis 80 mL
Aussehen Strohgelb, klar Bernsteinfarben, klar Gelb/grünlich, klar/trüb
Viskosität Hoch Hoch Stark erniedrigt
Mucinausfällung Gut Gut Mäßig, schlecht
pH-Wert 7,31 - 7,64 7,25 - 7,54 6,85 - 7,41 Leukozyten < 200/µL < 2000/µL Bis 60.000/µL Gesamtprotein 1,1 - 2,2 g/dL < 3 g/dL < 4 g/dL
Eine spezifische Therapie, die den Krankheitsprozess nachweisbar aufhält oder das Gelenk zu einer Restitutio ad integrum führt ist bisher nicht bekannt [Felson, D.T. et al. 2000].
Grundsätzlich gilt, dass die beste Therapie der Arthrose ihre Prophylaxe ist. Am ehesten kausal orientiert sind Präventionsversuche bei bestehenden Risikofaktoren. Hierzu gehören zum Beispiel Gewichtsreduktion bei Adipositas, Modifikation von repetitiven stereotypen Bewegungsabläufen, ausreichende körperliche Bewegung zum Erhalt von Gelenkbeweglichkeit und Muskelkraft, aber auch die (operative) Korrektur von präarthrotischen Deformitäten. Ziele der Behandlung der Arthrose sind die Schmerzstillung, Verbesserung der Beweglichkeit und die Verzögerung des Fortschreitens der Arthrose.
Endziel bei allen gelenkerhaltenden therapeutischen Eingriffen ist die Wiederherstellung der physiologischen Gelenkkinematik und – propriozeption [Anders, S. et al. 2001].
Die Therapie basiert auf drei Säulen [Steinmeyer, J. 2001]:
• konservative nicht-medikamentöse Therapie
• medikamentöse Therapie
• operative Therapie
Abhängig vom jeweiligen Erkrankungsstadium kommen die Behandlungsformen einzeln oder kombiniert zur Anwendung. Die Tab. I-4 gibt am Beispiel der Arthrose des Kniegelenks einen Überblick über die verschiedenen Therapiemöglichkeiten:
Tabelle I-4 Behandlungsmöglichkeiten bei Gonarthrose bzw. präarthrotischer Deformität Konservative nicht-medikamentöse Therapie
Beratung, Aufklärung
Gesunde Ernährung, Verhaltensregeln (Beruf, Freizeit) Physiotherapie/Physikalische Therapie
Quadrizepstraining Wärme-/Kälteanwendungen
Ultraschall Elektrotherapie
Akupunktur Hydro-/Balneotherapie
Intermittierende Extensionen und Stretching (Kontrakturprophylaxe) Orthopädietechnische Hilfsmittel
Gehhilfen (Handstock, Unterarmgehstütze, Rollgestell) Orthopädische Schuhzurichtungen
(Einlagen, Schuhranderhöhungen, Fersenkeil) Stabilisierende Orthesen
Spezielle Hilfsmittel
(Toilettensitzerhöhung, Strumpfanzieher, Badewannenlifter) Medikamentöse Therapie
Analgetika Myotonolytika
Nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) Glukokortikoide
Slow acting drugs in osteoarthritis (SADOA) Operative Therapie
Gelenkerhaltend
Symptomatisch: Lavage, Shaving, Débridement Knochenstimulierend: Knochenanbohrung, Mikrofraktionierung, Abrasionsarthroplastik
Korrekturosteotomien Arthrodesen Autologe Transplantation Periost- und Perichondriumtransplantation
Osteochondrale Transplantation (Monozylinder/Mosaikplastik) Chondrozytentransplantation
Gelenkersetzend
Totale Endoprothese, Teilprothese (Schlitten) Gelenkeliminierend
Resektions(interpositions)arthroplastik Arthrodese
Ein Entzündungsprozess darf nicht unbehandelt bleiben, geeignet sind hierzu nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID). Obwohl bewiesen ist, dass Antiphlogistika selbst, v.a. Steroide, schädlich auf die Chondrozyten wirken können, wiegt das sichere Fortschreiten der Knorpelzerstörung durch die Entzündung schwerer bei der Entscheidung zur Therapie [Fassbender, H.G. 1991]. Eine intraartikuläre Applikation von Steroiden bleibt der hochschmerzhaften aktivierten Arthrose zur Beseitigung der Synovialitis vorbehalten [Reichel, H. 2000]. Am Hüftgelenk wird hiervon allerdings abgeraten, da die Gefahr einer Knochennekrose besteht [Arzneimittelkommission der Deutschen Ärzteschaft, 1997].
Eigentlich zur Behandlung rheumatischer Arthritiden entwickelt, scheint die Radiosynovioorthese auch bei der aktivierten Arthrose, vornehmlich der größeren Gelenke, erfolgreich angewandt werden zu können. Die Ansprechrate ist etwas geringer als bei der RA [Rau, H. et al. 2004]. Es wird zur Verödung der entzündeten Synovialis eine radioaktive Substanz in das Gelenk injiziert, wodurch Schmerzen zurückgehen und die Gelenkfunktion verbessert wird.
Glukosamine scheinen nicht nur einen symptomatischen Effekt zu haben, sondern wirken möglicherweise auch krankheitsmodifizierend, da sie nach jüngsten Studien die fortschreitende Zerstörung des Gelenkknorpels verlangsamen könnten [Goldberg, V.M. et al.
2005; Poolsup, N. et al. 2005].
Entzündungshemmende oder schmerzstillende Phytopharmaka, wie z. B. Teufelskralle und Weidenrinde, werden gelegentlich unterstützend eingesetzt. Sie sollen helfen, den Verbrauch von NSAID und anderer chemisch definierter Analgetika zu reduzieren und deren Neben- wirkungen gering zu halten [Loew, D. et al. 1999].
Der Hauptgrund für den Einsatz der selektiven Cycloxygenase-2 (COX-2) Hemmer war ihr bisher angenommenes günstigeres Wirkungs-Nebenwirkungs-Verhältnis. Sie haben nämlich ein im Vergleich zu den nicht selektiven Cyclooxygenase-Hemmern ein endoskopisch nachgewiesenes niedrigeres Risiko der Entstehung gastrointestinaler Geschwüre [Hawkey, C.
et al. 2000]. Allerdings zeigte sich in einer Langzeitstudie [Graham, D.J. et al. 2005] ein vermehrtes Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse, weshalb die Wirkstoffe Rofecoxib und Valdecoxib vom Markt genommen wurden.
Ist das Stadium der Dekompensation trotz angemessenen Einsatzes aller physiotherapeutischen, medikamentösen und orthopädietechnischen Mittel erreicht, muss in der Regel die Indikation zur Operation gestellt werden.
Da Endoprothesen das Risiko der Auslockerung in sich tragen, wodurch eine begrenzte Haltbarkeit bedingt ist, bleiben sie möglichst dem fortgeschrittenen Lebensalter vorbehalten.
Prothesenwechsel sind zwar möglich, aber aufwendiger und mit mehr Komplikationen verbunden als die Erstoperation. Bei jüngeren Patienten sind deshalb gelenkerhaltende Operationen zu bevorzugen. Deren Erfolg ist allerdings weniger sicher und meistens von kürzerer Dauer. Die Entscheidung zur Endoprothese darf aber nicht von einer starren Altersgrenze abhängig gemacht werden. Neben den klinischen Daten muss auch der individuelle Leidensdruck des jeweiligen Patienten berücksichtigt werden [Hackenbroch, M.H. 2002].
Die meisten intraartikulären Operationen werden arthroskopisch durchgeführt. Die Arthoskopie dient nicht nur diagnostischen Zwecken: Mittels Gelenklavage, Entfernung freier Gelenkkörper und nekrotischer oder zerrissener Meniskus- und Knorpelanteile, Abfräsen von Osteophyten und Glättung von Knorpel- oder Knochenoberflächen kann ein Gelenk „saniert“
werden. Dieses sogenannte Shaving oder Debridément des Gelenkes ist rein palliativ und hat nur einen zeitlich begrenzten Erfolg [Marlovits, S. et al. 2000]. Es wird in Kombination mit einer Tibiakopfumstellung bei jungen Patienten als Alternative zur Totalendoprothese (TEP) gesehen [Schonholz, G.J. 1989].
Bei den knochenmarkstimulierenden Verfahren wird durch Bohrungen und Fräsen subchondraler Knochen freigelegt und hierbei durch Anregung pluripotenter Stammzellen des Knochenmarks das Auswachsen von Faserknorpel in den von hyalinem Knorpel freien Defekt provoziert. Diese Methode ist nur für umschriebene fokale Knorpeldefekte geeignet. Diese Einschränkung gilt auch für die autologe osteochondrale Transplantation (OCT), bei der aus nicht belasteten Gelenksbereichen Stanzen mit Knochen- und Knorpelzylindern von einigen Millimetern Durchmessern entnommen und in Defekte in Belastungszonen gesetzt werden.
Bei traumatisch entstandenen, größeren Defekten werden auch Allografts eingesetzt [Felson, D.T. et al. 2000]. Da aber der sowohl bei den knochemarkstimulierenden Verfahren wie auch bei der OCT entstehende Faserknorpel nur von minderer Qualität ist und im weiteren Verlauf abgetragen wird, kann hierdurch keine Heilung erzielt werden. Mit der Periost- und
Perichondriumtransplantation ist anfänglich eine gute Wiederherstellung der Gelenkknorpelfläche zu erreichen, im weiteren Verlauf entwickelt sich aber häufig eine enchondrale Ossifikation [Gaissmaier, C. et al. 2003].
Ein neueres sich noch in der Entwicklung befindendes Verfahren ist die autologe Chondrozytentransplantation (ACT), bei der arthroskopisch entnommene gesunde Knorpelzellen mehrere Wochen kultiviert werden und die vermehrten Zellen im Rahmen einer Arthrotomie reimplantiert werden. Eine kürzlich veröffentlichte Studie zeigte, dass sich in 80 % der Patienten hyalinartiger Knorpel mit einer ähnlich guten Belastbarkeit wie der hyaline Knorpel bildet. Im ersten postoperativen Jahr waren die Ergebnisse allerdings schlechter als bei der Mikrofrakturierung. Dies wird wahrscheinlich durch die notwendige Gelenkeröffnung und daran verbundene längere Rehabilitationszeit verursacht. Erst nach 24 Monaten wird die endgültige Gewebequalität erreicht [Gaissmaier, C. et al. 2003]. Die ACT ist gerade bei jüngeren Patienten mit isolierten tiefreichenden Knorpeldefekten geeigneter Größe und Lokalisation ein vielversprechender Ansatz zur Gelenkrekonstruktion [Anders, S.
et al. 2001]. Für die Behandlung degenerativer Knorpelschäden liegen derzeit noch keine validen Daten vor [Wiese, M. 2003]. Brittberg, der bereits 1994 diese Methode beschrieb, nennt die Arthrose ausdrücklich als Kontraindikation [Brittberg, M. et al. 1994, 2001].
Die Arthrodese (operative Gelenkversteifung) beseitigt erfolgreich den Schmerz und wird vor allem an kleineren Gelenken angewandt. Bei den großen Gelenken ist die Arthrodese aufgrund des großen Funktions- und Mobilitätsverlustes nur selten indiziert, so z. B. bei der hochgradigen posttraumatischen Gonarthrose eines Patienten, der noch zu jung für eine endoprothetische Versorgung ist, sowie bei chronischen Kniegelenkinfektionen, die operativ und konservativ nicht beherrschbar sind und bei denen sich eine Prothese verbietet [Felson, D.T. et al. 2000].
I.1.5 Biomarkerforschung
Die Diagnose der Arthrose in einem frühen Stadium ist ein derzeit noch ungelöstes Problem.
Die Diagnose basiert auf der klinischen Symptomatik und dem Röntgenbild, in dem arthrotische Veränderungen aber erst in einem fortgeschrittenen Stadium sichtbar sind.
Wünschenswert wäre eine Diagnose der Arthrose bereits bevor es zu irreversiblen
Veränderungen der Knochen- und Knorpelstruktur eines Gelenkes käme. Dies böte die Möglichkeit einer frühzeitigen therapeutischen Intervention und positiven Beeinflussung des Krankheitsverlaufes.
Eine neue Ebene der Diagnostik ist die Bestimmung biochemischer Marker. In den letzten Jahren hat sich die Forschungsaktivität zur Suche nach molekularen Markern für Arthrose verstärkt. Solche Marker, gemessen in Synovialflüssigkeit, Blut oder Urin, könnten nicht nur die Diagnose einer Gelenkerkrankung vereinfachen, sondern auch den Therapieverlauf zu verfolgen und zu beurteilen helfen. Durch ein generelles Vorsorgescreening könnten Risikogruppen für Arthrose bzw. Patienten mit schnell progressiver Arthrose identifiziert werden und frühzeitigen Prophylaxe- und Therapiemaßnahmen unterzogen werden. Der Therapieerfolg ließe sich mit Hilfe von Biomarkern monitoren. Auch könnten die auf molekularer Ebene gewonnen Erkenntnisse das Verständnis über die pathophysiologischen Vorgänge bei Arthrose vertiefen und Ansätze für neue Therapien bieten [Swoboda, B. et al.
1996].
Ein Biomarker würde die Klassifizierung der Arthrose verbessern, die Einordnung in verschiedene Krankheitsstadien vereinfachen und somit das in K. I.1.4 geschilderte Problem der Falldefinition lösen. Hieran hat auch die Pharmaindustrie ein großes Interesse: Angesichts steigender Kosten in der Arzneimittelforschung ist man bestrebt, in jeder Phase der Entwicklung, die Wirksamkeit und Sicherheit neuer Substanzen zu belegen. Ziele sind das Senken der Entwicklungskosten und eine schnellere Markteinführung.
Per definitionem wird unter einem Biomarker ein objektiv messbarer Parameter verstanden, der einen physiologischen oder pathologischen Zustand oder eine pharmakologische Antwort auf einen therapeutischen Eingriff anzeigt [Zolg, J.W. et al. 2004]. Korreliert der Analyt mit hinreichender Sensitivität und Spezifität mit einem Krankheitsverlauf, dann wird dieser auch als diagnostischer Marker bezeichnet. Kann ein Biomarker mit einem klinischen Endpunkt als Indikator für die Wirksamkeit eines Medikamentes in Einklang gebracht werden, so kann er als Surrogatmarker für die Wirksamkeit einer Substanz in klinischen Studien verwendet werden.
In den in der Tab. I-5 aufgeführten Untersuchungen erwies sich die Messung von Substanzen des Kollagenstoffwechsels am erfolgversprechendsten. Generell erscheint aber die Messung
eines einzelnen Markers wenig aussichtsreich. Vermutlich ist eine Messung multipler Marker nötig. Otterness et al. postulieren die parallele Messung mehrerer Marker, die jeweils verschiedenen Clustern angehören: z. B. Entzündungsmarker, Marker des Knochenstoff- wechsels, anabole und katabole Knorpelmarker und Wachstumsfaktoren [Otterness, I.G. et al.
2003].
Tabelle I-5 Mögliche Arthrosemarker aus Knochen, Knorpel und Synovialis
Synthesis Breakdown
Bone N- and C-terminal propeptides of collagen type 1
Pyridinoline Deoxypyridinoline
Osteocalcin Tartrate-resistant acid phosphatase Alkaline phosphatase C- and N-terminal telopeptides of
collagen type I Bone sialoprotein Cartilage N- and C-propeptide of
collagen Type 2 (either the immature type 2A or the mature type 2B)
Fragments of aggrecan-carrying protein Keratan sulfate (epitopes 5D4, ANP9)
Cartilage oligomeric matrix protein Chondroitin sulfate
(epitopes 846, 3B3, 7D4)
Collagenase-generated cleavage epitope of collagen type 2 Human cartilage glycoprotein-39 Pyridinoline
Cartilage-derived retinoic protein
C-terminal telopeptide of collagen type 2 Synovial
membrane
N-terminal propeptides of collagen type 3 Hyaluron
Human cartilage glycoprotein-39 Cartilage oligomeric matrix protein Matrix metalloproteinases-1,-2,-3,-9
Tissue inhibitors of metalloproteinases-1,-2
Pyridinoline
C- and N-terminal telopeptides of collagen type I
Glucosul-galactosyl pyridinoline
Inflammation Ultrasensitive CRP
[Chevalier, X. et al. 2005]
I.2 Peptidomics
I.2.1 Bedeutung von Peptiden im Organismus
Peptide und Proteine gehören zu den Grundbausteinen des Lebens. Strukturell handelt es sich um Polymere der 20 proteinogenen Aminosäuren (AS). Sie zeichnen sich durch sich wiederholende amidartige Verknüpfungen der α-Aminogruppe einer AS mit der Carboxylgruppe einer anderen AS aus (Peptidbindung). Der Unterschied zwischen Proteinen und Peptiden ist fließend und liegt in der Größe: Peptide bestehen im Allgemeinen aus nicht mehr als 100 AS und haben ein Molekulargewicht bis etwa 15 oder 20 kDa. Größere Moleküle werden als Proteine bezeichnet. Eine scharfe Grenze ist aber schwer zu definieren.
Ursprünglich beruht die Trennung beider Stoffklassen auf dem Kriterium der Dialysierbarkeit durch natürliche Membranen [Jakubke, H.D. 1996].
Betrachtet man die Nukleinsäuren als Konstruktionsplan eines Organismus, so sind die Peptide und Proteine das Material, mit dem die Bauanleitung umgesetzt wird. Sie erfüllen Funktionen als Strukturelemente, Enzyme in Stoffwechselvorgängen, Rezeptoren und inter- und intrazelluläre Signalstoffe. Als biologisches Redoxsystem in Form des Glutathion schützen sie die Zellen vor Oxidation. Viele Wirkstoffe wie Immunglobuline, Zytokine, Wachstumsfaktoren, tierische und pflanzliche Toxine sind Peptide bzw. Proteine.
Als Hormone erhalten sie die Homöostase im Organismus. Peptidhormone stellen noch vor der Gruppe der Steroidhormone die größte Hormongruppe dar. Sie sind verantwortlich für Regulation von Temperatur, Flüssigkeitsvolumen, Blutdruck, Ionenkonzentration, Glukosekonzentration, Wachstum und Reproduktion. Sie werden in Drüsen oder spezialisierten Zellen gebildet, über ein Transportsystem einem oder mehreren Wirkungsorten (Zielzellen) zugeführt und lösen durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor eine zellspezifische Aktivität aus.
Mutationen im Genom eines Organismus führen zu qualitativen Veränderungen des Genotyps und können prädisponierend für eine Erkrankung sein. Peptide und Proteine präsentieren den aktuellen Phänotyp (K. I.2.2) und können so pathologische Prozesse widerspiegeln. Eine
systematische Kartierung und Identifizierung des Peptidspektrums biologischer Quellen erscheint damit ein besonders aussichtsreicher Ansatz zur Entdeckung weiterer in der klinischen Medizin nutzbarer Substanzen, speziell auch für Erkrankungen des Bewegungsapparates, z. B. in Form molekularer Marker.
Viele Peptide werden bereits zur Diagnostik und Therapie von Erkrankungen genutzt: Das bekannteste in der klinischen Medizin eingesetzte Peptid ist sicherlich das Insulin, welches beim juvenilen Diabetes lebenslang substituiert werden muss. Weitere Beispiele für die therapeutische Anwendung von Peptiden sind das Somatropin zur Behandlung des Zwergwuches, Erythropoetin bei tumorbedingter und renaler Anämie, Faktor VIII zur Therapie der Hämophilie A, koloniestimulierende Faktoren bei iatrogen induzierter Myelodysplasie oder Interferon zur Therapie viraler Hepatitiden. Abb. I-3 gibt einen Überblick über klinisch relevante Peptide und ihr Molekulargewicht:
Abbildung I-3 Peptide mit bekannter biologischer Funktion. Das angegebene Molekulargewicht gibt die Größe der bioaktiven Form nach dem Processing an. [Schulz-Knappe, P. et al. 2003]
Eine von der mRNA ausgehende Analyse der Genexpression gibt nur einen kleinen Ausschnitt der biologischen Ereignisse wieder [Lorenz, P. et al. 2003; Urbanowska, T. et al.
2003]. Ebenso wenig wie die tatsächliche Menge exprimierter Eiweiße können auf Basis der mRNA auch keine posttranslationalen Modifikationen vorhergesagt werden. Letztere spielen eine große Rolle für die biologische Funktion und Aktivität von Proteinen [Ideker, T. et al.
2002; Schikowski, B. et al. 2000]. So wird z. B. Interleukin 8 durch N-terminale Spaltung aktiviert und das Insulin erreicht seine „reife“ Form nach Abspaltung des Signalpeptids und des C-Peptids.
I.2.2 Entschlüsselung komplexer molekular-biologischer Vorgänge
Anfang der 90er wurde verstärkt begonnen, das Genom des Menschen und anderer Lebewesen zu erforschen (Genomics). In der Hoffnung auf ein tiefgehendes Verständnis der Entstehung von Krankheiten auf molekularer Ebene wurde in großem Maßstab die Sequenzierung der DNA vorangetrieben. Dieser Ansatz wird inzwischen durch weitere globale Profiling-Technologien ergänzt (Abb. I-4):
Abbildung I-4 Verschiedene Strategien zur Aufklärung komplexer biologischer Vorgänge im Organismus [modifiziert nach Schulz-Knappe, P. et al. 2001]
Nach erfolgreicher Entschlüsselung des menschlichen Genoms steht nun die Funktionsanalyse der an den Zellprozessen beteiligten Proteine und Peptide, also des Proteoms, im Vordergrund. Der Begriff Proteom wurde 1995 von Wilkins und Humpher [Wasinger, V.C. et al. 1995] eingeführt und umfasst die Gesamtheit aller von einem Genom kodierten Proteine. Mittels Transcriptomics wird die Umsetzung der Gensequenzen in ihre Produkte auf Eiweißebene untersucht. Dieser Ansatz wird dadurch begrenzt, dass insgesamt über 250 000 humane Proteine existieren, aber nur 30 000 bis 40 000 Gene. Diese deutlich größere Vielfalt auf Proteinniveau entsteht durch unterschiedliche prä-mRNA-Prozessierung zur reifen mRNA, enzymatische Spaltung und poststranslationale Modifizierungen der Proteine. Ein Gen kann somit für mehrere Proteine oder Peptide kodieren, so dass aus der Nukleinsäuresequenz nur bedingt auf die kodierten Stoffe und deren Wirkung im Organismus geschlossen werden kann. Abb. I-5 verdeutlicht die multiplen Prozessierungsmöglichkeiten am Beispiel eines Peptidhormons:
Abbildung I-5 Prozessierung von Peptidhormonen. Die Umsetzung der das Genom repräsen- tierenden Nukleinsäuren in Genprodukte stellt einen vielstufigen Prozess dar. Auf allen Stufen können dabei regulierende Mechanismen angreifen, die die Quantität sowie die Qualität des Genproduktes beeinflussen. [Schulz-Knappe, P. 1996]
Kleine Veränderungen wie die Abspaltung einer einzelnen AS oder posttranslationale Modifikationen (Phosphorylierung, Amidierung, Sulfatierung, Glykosilierung, Oxidation etc.) können die biologische Funktion eines Peptids völlig verändern.
Umfassende Analysen zur Kartierung und Identifizierung von Eiweißen finden innerhalb der Proteomforschung (Proteomics) statt. Sie bedient sich der Auftrennung von Proteinen mit zweidimensionaler Gelelektrophorese (2-DE) und anschließender massenspektrometrischer Sequenzierung. Bei diesem Vorgehen werden Substanzen mit einem Molekulargewicht kleiner als 10 kDA, also die meisten Peptide, nicht erfasst. Gründe dafür sind der große mengenmäßige Überschuss von Proteinen gegenüber Peptiden, die in diesem Massenbereich unzureichende Auflösung der 2-DE sowie die schlechte Anfärbbarkeit der kleineren Peptidmenge. Zur Entschlüsselung des Peptidspektrums einer spezifischen Quelle kommt dieser Ansatz also gar nicht oder nur bedingt in Frage. Erforderlich ist deshalb ein Peptidomprojekt (Peptidomics) zur systematischen Charakterisierung von Peptiden und kleinen Proteinen mit einem Molekulargewicht von 0,5 bis 15 kDa in komplexen, biologischen Quellen [Schulz-Knappe, P. et al. 2001]. Hauptanwendungsgebiet ist der Extrazellulärraum präsentiert durch Körperflüssigkeiten wie z. B. Blutplasma, Synovia, Liquor und Urin. Aber auch verschiedene Gewebeproben und Zellkulturen wurden bereits erfolgreich analysiert.
Den Zusammenhang zwischen Proteom und Peptidom gibt Abb. 1-6 wieder. Proteolyse, Diffusion, Sekretion und Reuptake sind nur wenige Beispiele biochemischer und physikochemischer Prozesse, die die hohe Dynamik der Eiweißzusammensetzung biologischer Proben bedingen. Als Abbauprodukte größerer Moleküle stellen Peptide auch Marker für degenerative Prozesse dar (aus dem Griechischen: πεπτειν - verdauen).
Nachdem durch geeignete und für jede Quelle individuelle Probenvorbereitung Proteine möglichst umfangreich abgetrennt wurden, werden die Peptide mittels chromatographischer Methoden aufgetrennt. Die genaue Kartierung und Identifizierung erfolgt dann mit verschiedenen massenspektrometrischen Methoden oder dem sukzessiven Aminosäureabbau nach Edman.
Abbildung I-6 Peptidom und Proteom sind durch Proteasen dynamisch verbunden.
[Schulz-Knappe et al., 2005]
Peptidomics besteht aus zwei sich ergänzenden Ansätzen:
• Differential Peptide Display (DPD): Quantitativer und qualitativer Vergleich verschiedener Erkrankungsstadien oder zwischen einem kranken Kollektiv und einer gesunden Kontrollgruppe.
• Peptide Trapping: Die gezielte Identifizierung von Peptiden, die aufgrund ihrer molekularen Masse und ihres chromatographischen Verhaltens charakterisiert sind.
Dies ermöglicht die Erstellung einer Inhaltsangabe eines Probenmaterials auf Peptidniveau.
Der Arbeitsablauf einer Peptidomanalyse gliedert sich in folgende Schritte (Abb. I-7):
1. Auswahl relevanter Probenkollektive und Materialgewinnung 2. Extraktion der Peptide aus der biologischen Quelle
3. Fraktionierung mittels RP-HPLC
4. Analyse jeder einzelnen Fraktion durch MALDI-TOF-MS
5. Vergleich der massenspektrometrischen Daten der definierten Kollektive (Detektion von Differenzen im Peptidmuster)
6. Identifizierung potentieller Marker 7. Medizinisch-biologische Interpretation
Abbildung I-7 Peptidomics Workflow [Budde, P. et al. 2004]
Für jede Probe entstehen bei der MALDI-TOF-MS 96 Einzelspektren. Diese werden mit der von BioVisioN entwickelten Software SpectromaniaTM in Reihenfolge der Elution der gesammelten chromatographischen Fraktionen zu einer Peptidkarte kombiniert. Dabei werden die Massenspekten um 90° gedreht, so dass die Spektren quasi „von oben“ betrachtet werden.
Die unterschiedliche Intensität der Massensignale wird durch die Farbintensität kodiert. Von jeder Probe entsteht ein individueller „Fingerabdruck“, eine sogenannte Peptidkarte, die das Elutionsverhalten der Peptide in der Chromatographie und die detektierten Massen in den einzelnen Fraktionen berücksichtigt und optisch einem 2-DE Gel ähnelt.
Die x-, y-, und z-Achse einer solchen Darstellung sind die relative molekulare Masse, die chromatographische Fraktion und die Intensität der gemessenen massenspektrometrischen Signale. Die zu Grunde liegenden massenspektrometrischen Messwerte sind in einer Datenbank zusammen mit den klinischen Daten gespeichert und werden für die statistische Auswertung verwendet. Peptidkarten bzw. die ihnen entsprechenden Datensätze werden mit statistischen Methoden vergleichend analysiert, um Unterschiede im Peptidmuster bei verschiedenen Krankheitszuständen zu identifizieren.
Die Auswahl des geeigneten Probenmaterials ist einerseits abhängig vom Ort des pathologischen Geschehens und der Verstoffwechselung von Markerkandidaten im Organismus und andererseits praktischen Erwägungen wie die Einfachheit der Probengewinnung. Abb. I-8 verdeutlicht die sich teilweise gegenläufig verhaltenden Auswahlkriterien.
Abbildung I-8 Kompartimente des Körpers und Kriterien bei der Wahl des besten Probenmaterials
[Schulz-Knappe et al. 2005]
,
I.3 Zielsetzung der Arbeit
Die Arthrose ist eine der weitverbreitesten Erkrankungen. Im Widerspruch zu ihrer großen epidemiologischen und volkswirtschaftlichen Bedeutung stehen die bisher unzureichenden Diagnose- und Therapiemöglichkeiten. Die Diagnosestellung ist erst im fortgeschrittenen Stadium möglich, die Therapie vorwiegend symptomatisch. Hinzu kommt, dass die Pathogenese bislang noch nicht vollständig geklärt ist. Eine schmerzfreie Gelenkfunktion auch im höheren Lebensalter als Faktor der Lebensqualität, bei einem oftmals risikoträchtigen Sport- und Freizeitverhalten, wäre wünschenswert.
Ein Schwerpunkt der Arthroseforschung ist die Suche nach molekularen Markern, verbunden mit der Hoffnung auf ein tieferes Verständnis der pathophysiologischen Vorgänge als Grundlage für bessere Diagnose- und Therapiemöglichkeiten. Eine große Substanzklasse mit vielfältigen Aufgaben im Organismus und Potential zur Diagnostik von Gelenkerkrankungen sind die Peptide. Hier setzt die vorliegende Arbeit an: Mit der Methodik des Differential Peptide Display wurden Peptidkarten aus Plasma- und Synovialflüssigkeitsproben von Patienten mit Gonarthrose hinsichtlich ihres Peptidgehaltes kartiert und vergleichend analysiert. Ziel war das Aufzeigen von Peptiden, deren Auftreten in einem charakteristischen und krankheitsspezifischen Zusammenhang mit der Entstehung der Gonarthrose steht.
Die Arbeit gliedert sich in drei Abschnitte:
Im ersten Schritt wurde eine Methode zur Herstellung von Peptidkarten aus Synovia entwickelt und etabliert. Hierbei standen die Erarbeitung einer geeigneten Probenvorbereitung und die Optimierung von Chromatographie und Massenspektrometrie im Mittelpunkt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Blutplasma und Synoviaproben von 58 Patienten mit nach Kellgren und Lawrence klassifizierter Gonarthrose vermessen und statistisch signifikante Markerkandidaten, mit deren Hilfe eine Zuordnung des Arthrosestadiums gelingt, herausgearbeitet.
Im dritten Ansatz wurde Synovia in größerer Menge aufbereitet. Dies diente als Basis für die a) Sequenzierung und Identifizierung der detektierten Markerkandidaten und b) generelle Inventarisierung des Peptidoms von Synovia durch die BioVisioNs-interne Abteilung Inventories.
II. Patienten und Methoden
II.1 Aufbau der Studie
II.1.1 Gewinnung des Probenmaterials
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Blutplasma und Synovialflüssigkeit aus dem Kniegelenk verarbeitet. Das Material stammte von Patienten der Orthopädischen Klinik der Georg- August-Universität Göttingen.
Alle Patienten unterzogen sich im Zeitraum März bis Dezember 2000 einer Arthroskopie eines Kniegelenks. Es handelte sich um Personen mit Gonarthrose verschiedener Schweregrade. Das Vorhaben wurde von der Ethikkommission der Universität Göttingen genehmigt. Patienten, die nach Aufklärung ihre schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie gaben, wurde bei der präoperativen regulären Abnahme für die klinisch-chemische Untersuchung ca. 9 mL Blut zusätzlich aus einer Kubitalvene abgenommen. Das daraus gewonnene Plasma sowie die bei der Kniespiegelung asservierte und für diagnostische Untersuchungen nicht benötigte Synovialflüssigkeit wurde BioVisioN zur Verfügung gestellt.
Die Gewinnung der Proben bedeutete also keine zusätzliche Belastung für den Patienten, weder eine zusätzliche Untersuchung noch andere Intervention fand statt. Das Kniegelenk wurde vor Beginn des operativen Eingriffs punktiert. Falls auf diese Weise keine Synovia asserviert werden konnte, geschah die Probengewinnung über das Arthroskop: Der Trokar wurde in das Gelenk eingeführt, dann eine Spritze aufgesetzt, um so mit dem stumpfen Trokar schadlos in die verschiedenen Rezessus des Gelenkes zu gelangen und Synovia zu gewinnen.
Das erhaltene Volumen variierte zwischen 0.5 mL und 12 mL.
Jede Probe und die dazugehörigen Patientendaten wurden für BioVisioN in anonymisierter Form kodiert. Synovialflüssigkeit und Blut wurden direkt nach Abnahme zentrifugiert (10 min bei 2500 x g bzw. 2100 x g und 4° C), der Überstand abpipettiert und bei - 80 °C bis zum Transport an BioVisioN gelagert.
II.1.2 Patientendaten
Folgende Daten wurden erfasst:
Allgemeine Daten
• Alter
• Geschlecht
• Körpergöße
• Gewicht
• ethnische Zugehörigkeit Angaben zum Bewegungsapparat
• Zeitpunkt und Art der Diagnosestellung
• frühere Operationen (Datum und Art des Eingriffs)
• Auflistung aller erkrankten Gelenke (Diagnose und Lokalisation)
• spezifische Familienanamnese
• Klassifikation des Erkrankungsgrades nach Kellgren und Lawrence
• spezifische Medikation
Klinisch-chemische Parameter (in Vollblut oder Serum)
• Erythrozyten
• Hk
• Hb
• Leukozyten
• BSG
• CRP
• Transaminasen
• Gesamtprotein
• Albumin
• Kreatinin
• Kreatininclearance
Synovia-Analyse
• Volumen des Punktates
• Farbe des Punktates
Comorbidität
• Begleiterkrankungen
• Begleitmedikation
• frühere (nicht-orthopädische) Eingriffe
II.1.3 Ausschlusskriterien
Von der Studie ausgeschlossen waren Patienten, auf die mindestens eines der folgenden Kriterien zutraf:
• intraartikuläre Therapie innerhalb der letzten 3 Monate
• Behandlung mit DMOAD oder SADOA
• Vorliegen einer anderen den Knochenstoffwechsel betreffende Erkrankung (z. B. RA, SLE, schwere Osteoporose)
• bestehende Schwangerschaft oder Stillen
• operativer Eingriff in den letzten 6 Monaten
• akute inflammatorische Episode
• Leber- und/oder Niereninsuffizienz
• Vorliegen einer viralen Infektion: HIV, Hepatitis B, Hepatitis C
• Vorliegen einer malignen Erkrankung
Desweiteren wurde nur makroskopisch unauffällige, klare Synovialflüssigkeit mit typischer hell-gelber Farbe verarbeitet. Proben mit stärkerer gelber bzw. rötlicher Verfärbung als Hinweis auf stattgefundene Blutungen oder Trübung als Zeichen einer vorliegenden Entzündung wurden wegen unkontrollierbarer Beimengung intrazellulärer Substanzen und möglicher Verfälschung des Peptidmusters nicht verwandt. Ein gesundes Gelenk enthält etwa bis zu 3,5 mL Synovia [Partsch, G. 2000]. Ein größeres Volumen ist typisch für einen akuten Gelenkprozess (z. B. kurz nach einem Trauma oder bei aktivierter Arthose).
Um Veränderungen des Peptidoms durch einen akuten Reizzustand oder durch Verdünnungseffekte möglichst auszuschließen, wurden Punktate mit einem höheren Volumen lediglich zur Methodenentwicklung und nicht im Rahmen der Studie genutzt.
II.1.4 Radiologische Beurteilung des Arthrosegrades
Die Degeneration der Gelenke wurde präoperativ anhand von Röntgenbildern des Kniegelenkes (Aufnahmen im anterior-posterioren Strahlengang) beurteilt. Dabei wurde immer durch dieselben zwei Untersucher der Zustand des Gelenkes unter Verwendung des Kellgren und Lawrence-Scores [Kellgren und Lawrence 1957, Empire Rheumatism Council 1963] klassifiziert. Der englische Radiologe Kellgren teilte in den 50er Jahren konventionell radiologische arthrotische Veränderungen eines Gelenkes in vier Schweregrade (Tab. II-1).
Diese Einteilung hat sich zur einfachen radiologischen Beurteilung des Schweregrades einer Arthrose bewährt. Es handelt sich um einen Summen-Score, bei dem die Bewertungen von Einzelmerkmalen einer Gonarthrose zu einem Gesamtwert, der den Erkrankungsgrad präsentiert, addiert werden.
Tabelle II-1
Erläuterung des Kellgren und Lawrence-Scores zur radiologischen Klassifizierung der Arthrose
Stadium Radiologische Merkmale
I Keine Gelenkspaltverschmälerung
(zweifelhafte Arthrose) Keine Osteophyten
Geringe subchondrale Sklerosierung
II Geringe Gelenkspaltverschmälerung
(leichte Arthrose) Beginnende Osteophytenbildung
Angedeutete Konturunregelmäßigkeit der Gelenkfläche
III Gelenkspaltverschmälerung (mäßige Arthrose) Ausgeprägte Osteophytenbildung
Deutliche Konturunregelmäßigkeiten der Gelenkfläche
Subchondrale Zystenbildung
IV
(schwere Arthrose)
Ausgeprägte Gelenkspaltverschmälerung bis zur vollständigen Destruktion Destruktion und Nekrose der Gelenkpartner
