Die unter den gewählten Chromatographiebedingungen protonierten Peptide und Proteine wurden am Kationenaustauscher gebunden und angereichert.
Nach Protonierung der Säule mit 0,5 M HCl und Äquilibrierung mit Puffer A (20 mM NaH2PO4, pH 2,6) wurde das Probenmaterial auf die Säule aufgetragen und die Säule mit Puffer A gespült. Die Elution erfolgte mit Puffer B (1 M Ammoniumacetat) über 5 min bei einem Fluss von 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 280 nm mittels VWD aufgenommen.
Mit Beginn des Ammoniumacetatpeaks wurde das Eluat in ein Kunststoffgefäß gesammelt (ca. 4,6 mL) und durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 2 - 3 gebracht.
Für die RP-Chromatographie wurde das Material auf drei Portionen à 1700 µL verteilt. Alle drei Läufe wurden in jeweils 96 Fraktionen gesammelt. Um die Präparation auf das Vorhandensein bestimmter signalstarker Peptide, die die Basis für die Probenauswahl waren, zu kontrollieren, wurde ein Aliquot zur MALDI-TOF-Massenspektrometrie entnommen.
II.2.3.7.4 Elektrospray-Quadrupol Time-of-flight Tandem-Massenspektrometrie Die Markerkandidaten der Differentiellen Peptidanalyse wurden von der Abteilung Inventories sequenziert, die parallel zu diesem Projekt das so genannte Peptide Trapping, die systematische Kartierung und Charakterisierung aller Peptide in einer biologischen Probenart durchführten. Die Analysen wurden im Nanospray-Modus an einem Gerät des Typs Q-Star Pulsar durchgeführt. Nach Aufnahme eines Gesamtspektrums (Full-Scan-Modus) wurde das entsprechende Vorläuferion ausgewählt und fragmentiert.
Die mit Probe gefüllte Nadel wurde in die Ionensprayquelle eingesetzt und mit der Spannungsquelle verbunden. Die Nadelspannung war auf 800 - 1000 V eingestellt. Der gewählte m/z-Bereich richtete sich nach Art des Fragmentspektrums und wurde im Full-Scan-Modus in der Regel auf den Bereich von 400 - 2000 m/z eingestellt. Bei Aufnahme des Fragmentspektrums richtete sich der gewählte m/z-Bereich nach der Größe des Vorläuferions und lag zwischen 50 - 100 (unteres Limit) und dem doppelten Wert des Vorläuferions (oberes Limit). Abhängig vom Fragmentierungsverhalten des zu analysierenden Peptids betrug die Kollisionsenergie zwischen 20 und 50 eV. Als Kollisionsgas diente Stickstoff. Die Anzahl der aufsummierten Scans variierte je nach Intensität der Signale zwischen 20 und 200.
Die Datenaufnahme und -auswertung erfolgte mit dem vom Hersteller mitgelieferten Programm BioAnalyst (Version 1.1). Konnte ein Fragmentspektrum erzeugt werden, wurde anhand dessen das selektierte Peptid über eine Datenbankrecherche in Mascot identifiziert.
III. Ergebnisse
III.1 Struktur des Patientenkollektives
Die Studie umfasste 58 Patienten, von denen Peptidkarten aus Synovialflüssigkeit und Plasma erstellt wurden. Aufgrund mangelnder Probenqualität (z. B. Hämolyse, Hämarthros) konnten nicht von allen Probanden beide Materialien analysiert werden. Es wurden 41 Peptidkarten aus Synovia und 49 Karten aus Plasma erzeugt.
III.1.1 Klassifikation nach Kellgren und Lawrence
Die Beurteilung des Schweregrades der Gonarthrose erfolgte radiologisch mit dem Kellgren und Lawrence-Score, im Folgenden abgekürzt mit „K&L“, in fragliche (Stadium I), leichte (Stadium II), mäßige (Stadium III) und schwere (Stadium IV) Gonarthrose. Die Anzahl Patienten pro Arthrosegrad zeigt Abb. III-1. Die Gruppen K&L I und II (27 Patienten) sowie K&L III und IV (31 Patienten) wurden bei der differentiellen Peptidanalyse zusammengefasst und die beiden resultierenden Kollektive miteinander verglichen.
Abbildung III-1 Patienten pro K&L-Stadium
III.1.2 Alters- und Geschlechterverteilung
Das mittlere Alter der Studienteilnehmer lag bei 56,9 Jahren (Median 62 Jahre). Der jüngste Patient war 22 Jahre alt, der älteste 89 Jahre alt. Nur 18 Patienten (31 %) waren jünger als 50 Jahre. Mit zunehmendem Alter stieg auch der Anteil der Patienten mit K&L ≥ III; diese Patienten waren mindestens 50 Jahre alt. Besonders deutlich war der Alterssprung zwischen den Patienten mit K&L I und II. Während der Mittelwert bei der ersten Gruppe 36,6 Jahre betrug (Median 35 Jahre), lag er bei der zweiten Gruppe bei 54,4 Jahren (Median 59 Jahre).
Bei weiter zunehmenden Schweregrad stieg er an auf 67,1 Jahre bei den Patienten mit K&L III (Median 67,5 Jahre) und 73,1 Jahre bei der Gruppe K&L IV (Median 72 Jahre) (Abb. III-2 und Tab. III-1).
Patientenanzahl
17
10
22
9
0 5 10 15 20 25
K&L I K&L II K&L III K&L IV
Abbildung III-2 Altersverteilung und Kellgren & Lawrence-Score: A) aufgeteilt nach Lebensdekade und B) per Arthrosestadium
Patientenanzahl
A)
B)
4
11
4 3 4
1 5
14
8
4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90
Alter (Jahre)
K&L I+II K&L III+IV
Tabelle III-1 Altersverteilung
Spannbreite (Jahre) Mittelwert (Jahre) Median (Jahre)
K&L I 22 –60 36,6 35
K&L II 30 – 72 54,4 59
K&L III 52 – 84 67,1 67,5
K&L IV 62 – 89 73,1 72
K&L I + II 22 – 72 43,2 40
K&L III + IV 52 - 89 68,9 68
K&L I - IV 22 – 89 56,9 62
Die Geschlechterverteilung war mit 30 weiblichen und 28 männlichen Patienten sehr ausgeglichen, zeigte aber eine gegenläufige Entwicklung bezüglich des Kellgren und Lawrence-Scores. 19 Patienten (70,4 %) mit K&L I oder II waren Männer, während 22 Patienten (71 %) mit K&L ≥ III Frauen waren (Abb. III-3).
Abbildung III-3 Geschlechterverteilung und Kellgren & Lawrence-Score
8
19 22
9
0 5 10 15 20 25
Frauen Männer
K&L I+II K&L III+IV
Patientenanzahl
Wie in Abb. III-4 zu sehen ist, dominierten in der Altersklasse 21 - 50 Jahre die Männer (13 x ♂, 6 x ♀), während in der Gruppe ≥ 71 Jahre mehr Frauen als Männer (2 x ♂, 11 x ♀) in die Studie aufgenommen waren. Im Bereich 51 - 70 Jahre war die Anzahl weiblicher und männ-licher Patienten identisch (jeweils 13 Patienten).
Abbildung III-4 Altersverteilung innerhalb der Geschlechter
III.1.3 Diagnosen und Beschwerdedauer
74,1 % der Patienten (20 von 27) mit K&L ≤ II wurden nicht wegen Arthrose, sondern wegen einer anderen Problematik (19 x Meniskusschaden, 1 x Ruptur des vorderen Kreuzbandes) operiert. Die arthrotischen Veränderungen waren nur ein Nebenbefund. Bei sechs Patienten dieser Gruppe (22,2 %) fand sich eine positive Traumaanamnese (1 x Ruptur vorderes Kreuzband, 5 x Meniskusläsion) für das entsprechende Gelenk. Bei vier von ihnen lag das
2
21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 Alter (Jahre)
Frauen Männer
Patientenanzahl
Ereignis nur wenige Wochen bis maximal 6 Monate zurück, bei den anderen zwei Patienten bereits 18 Monate bzw. 6 Jahre.
Abbildung III-5 OP-Indikationen: Arthrose, Meniskopathie, Ruptur des vorderen Kreuzbandes (VK)
Bei 93,5 % der Patienten (29 von 31) mit einem K&L ≥ III wurde die Gelenkspiegelung wegen der Arthrose durchgeführt, bei lediglich zwei Patienten aufgrund einer Meniskusläsion (Abb. III-5). Nur drei Patienten dieser Gruppe (9,7 %) gaben ein Trauma des Kniegelenkes an (Verdrehtrauma). Dies lag mindestens drei Jahre, maximal acht Jahre zurück. Teilweise bestanden bei den Patienten mit K&L ≥ III schon seit mehr als 20 Jahren Kniebeschwerden (mittlere Beschwerdedauer K&L III 4,1 Jahre, K&L IV 8,4 Jahre). Bei Patienten mit niedrigem Arthrosegrad lag das Auftreten der ersten Beschwerden noch nicht lange zurück (mittlere Beschwerdedauer K&L I 0,4 Jahre, K&L II 1,9 Jahre) (Abb. III-6).
7
19
1 29
2 0
5 10 15 20 25 30 35
Arthrose Meniskopathie VK-Ruptur K&L I+II K&L III+IV
Patientenanzahl
Abbildung III-6 Mittlere Beschwerdedauer
0,4
1,9
4,1
8,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
I II III IV
K&L
III.1.4 Arzneimittelgebrauch und Comorbidität
Sechs der 58 Patienten (10,3 %) nahmen regelmässig Schmerzmittel, v.a. NSAID, ein. Die häufigste Begleitmedikation waren Herz-Kreislaufmedikamente, v.a. Antihypertonika, die von 15 Patienten (25,9 %) bei entsprechender Vorerkrankung eingenommen wurden. Drei Patientinnen (5,2 %) gebrauchten orale Kontrazeptiva und eine Patientin (1,7 %) Präparate zur Hormonsubstitution im Klimakterium.
III.1.5 Probenausschluss
Proben von Patienten, die nicht den definierten Einschlusskriterien entsprachen, wurden lediglich zur Methodenentwicklung benutzt. Bei allen 58 in die Studie integrierten Patienten lagen die erhobenen Laborwerte im Normbereich, d.h. die Entzündungsparameter im Blut (Leukozytenanzahl, CRP, BSG) waren nicht erhöht und weder Nieren- noch Leberfunktion waren nachweislich beeinträchtigt.
III.2 Auswertung des experimentellen Teils
III.2.1 Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford
Als grobe Orientierung zum Eiweißgehalt der Synovia- und Plasmaproben wurde ein Bradfordtest durchgeführt. Dieser zeigte eine Reduktion des Proteingehaltes um den Faktor 100 durch Fällung mit Trichloressigsäure (Tab. III-2).
Tabelle III-2 Vergleich des Proteingehaltes vor und nach Fällung mit Trichloressigsäure
Nativ TCA-gefällt
Proteingehalt Plasma 73,3 mg/mL* 0,695 mg/mL*
Proteingehalt Synovia 18,0 mg/mL 0,2 mg/mL
*Werte Rüdiger Hess, ermittelt mit BCA Protein Assay Kit, Fa. Pierce/Perbio Science, Deutschland
III.2.2 Probenvorbereitung
Durch Zusatz der Hyaluronidase konnte die Probenausbeute bei der Ultrafiltration von gemittelt 1400 µL auf 2000 µL gesteigert werden. Letzlich hat sich die Proteinextraktion mittels TCA-Fällung durchgesetzt, da diese noch einfacher und schneller in der Durchführbarkeit war bei gleich guter Qualität der Peptidkarten. Die Probenausbeute betrug immer ≥ 1800 µL und lag damit stets über den für die Chromatographie benötigten 1700 µL.
Die TCA-Fälllung war auch die bereits etablierte Methode für die Plasmaverarbeitung.
III.2.3 Chromatographie
Dem Prinzip der Peptidkartendarstellung durch Übertragung von Peakhöhe in Farbintensität entsprechend lassen sich auch alle Chromatographieläufe vergleichend zusammen darstellen.
Die Farbintensität entspricht der Höhe des Peaks bzw. der Absorption im Chromatogramm.
Die Abb. III-7 zeigt die Chromatogramme der Plasmaanalysen. Durchgehende Banden stehen für in allen Proben vorkommende Peaks.
Erkennbar ist, dass bei den maximal neun Proben eines Analysenblocks bei dem Auftreten der Peaks keine zeitliche Verschiebung zwischen den analogen Peaks auftritt und diese zwischen den verschiedenen Blöcken nur sehr gering ist. Diese Genauigkeit wurde durch die Chromatographie eines Peptidstandardgemisches zu Beginn jedes Analysenblockes erreicht.
Bei Verschiebung der Elutionszeiten der Standardpeptide wurden diese entsprechend angepasst.
Abbildung III-7 Chromatographieläufe Plasma: Deutlich erkennbar ist die einheitliche Trennung. Die Peptide sind hier in ihrer Intensität nicht zu sehen, sondern werden erst im MS Profiling sichtbar.
Zeit
Proben 1- 49
Block 1
Block 2
Block 3
Block 4
Block 5
Block 6
III.2.4 Peptidemapping
III.2.4.1 Vergleich der Peptidkarten aus Synovialflüssigkeit und Plasma
Alle 41 aus Synovia generierten Peptidkarten wurden in die Auswertung einbezogen, während 6 der 49 Peptidkarten der Plasmamessungen wegen ihres untypischen Aussehens ausgeschlossen wurden. Die Plasmamasterkarte erscheint reichhaltiger als die Karte aus Synovialflüssigkeit (Abb. III-8). Anhand der Differenzkarte wird deutlich, dass sich die Peptidspektren beider Flüssigkeiten überlagern: Ein Großteil der Peptide ist sowohl in Synovia als auch in Plasma vorhanden.
Abbildung III-8 Vergleich des mittleren Peptidspektrums von Synovia und Plasma. Durch Subtraktion der Mittelwertskarte aller Synoviaproben (A) von der Mittelwertskarte aller Plasmaproben (B) entsteht die Differenzkarte (C). In dieser werden synoviaspezifische Signale blau, plasmaspezifische rot dargestellt. Gemeinsame Signale in beiden Flüssigkeiten erscheinen weiß.
Subtraktion
Plasma beide
Synovia
A) Synovia B) Plasma
C) Differenzkarte
III.2.4.2 Vergleich verschiedener Krankheitsstadien
Mit den in K. II.2.3.6 beschriebenen statistischen Methoden wurden die massen- spektrometrischen Messungen in Synovialflüssigkeit und Plasma nach Signalen mit großer Differenzierungskraft zwischen den Erkrankungsgruppen gescreent und eine Rangfolge erstellt.
In der Tab. III-3 sind die „Top 10“ Signale der Synoviamessungen mit einem ROC-Integral ≥ 70 % sowie die Werte der anderen erhobenen statistischen Parameter aufgeführt. Es zeigte sich eine absolute Übereinstimmung in der Reihenfolge der Markerkandidaten bei Sortierung nach ROC-Integral, p-Wert und Betrag des Korrelationsfaktors.
Tabelle III-3 Top 10 Peptidmarkerkandidaten (K&L I+II vs. K&L III+IV) aus Synovia
Peptid # ROC-AUC (%) p-Wert (u-Test) Spearmans `r´
S1 81,90 0,0005 0,55
S2 79,76 0,0011 -0,51
S3 77,14 0,0029 0,47
S4 76,67 0,0035 0,46
S5 74,76 0,0067 0,42
S6 74,52 0,0072 -0,42
S7 74,52 0,0072 -0,42
S8 74,05 0,0084 0,41
S9 73,33 0,0106 -0,40
S10 73,33 0,0106 -0,40
Die Plasmamessungen wurden auf dieselbe Weise ausgewertet wie die Synoviaproben. Peptid P10 der Tab. III-4 ist identisch mit Kandidat S1 der Tab. III-3.
Tabelle III-4 Top 10 Peptidmarkerkandidaten (K&L I+II vs. K&L III+IV) aus Plasma
Peptid # ROC-AUC (%) p-Wert (u-Test) Spearmans `r´
P1 83,11 0,0002 0,56
P2 81,58 0,0004 0,54
P3 80,26 0,0007 0,52
P4 78,29 0,0016 0,48
P5 77,41 0,0022 0,46
P6 77,19 0,0024 0,46
P7 75,00 0,0053 0,40
P8 75,00 0,0053 0,39
P9 74,56 0,0062 0,40
P10 71,27 0,0177 0,37
Zur Überprüfung der Resultate der statistischen Analyse erfolgte eine visuelle Kontrolle der Peptide in Korrelations- und Differenzkarte (Abb. III-9 und Abb. III-10): Die Top-Kandidaten sind ihrer Rankingnummer in den Tab. III-3 und III-4 entsprechend nummeriert und farblich hervorgehoben. Anhand der Einzelspektren wurden echte Signalintensitätsdifferenzen von Artefakten, z. B. durch Basislinienverschiebung entstanden, unterschieden. Die Korrelationskarte gibt alle Kandidaten mit einem Korrelationsfaktor r >
|0,5| an. Es finden sich auch unspezifische Signale, in Plasma mehr als in Synovia. Insgesamt wurden 8185 Signale aus Synovia und 9041 Signale aus Plasma extrahiert. Hiervon entsprachen etwa 50 % echten Peptidsignalen. Führt man eine grobe Anpassung des Signifikanzniveaus nach Bonferroni durch, indem man den p-Wert von 0,05 entspechend der ungefähren Größenordnung der Anzahl detektierter Signale durch den Faktor 1000 dividiert, erreicht keiner der Kandidaten aus Gelenkflüssigkeit oder Plasma das neu definierte Signifikanzniveau von p < 0,00005.
Abbildung III-9 A) Differenzkarte aus Synovia. Die Mittelwertskarte der Patienten mit K&L I und II wurde von der Mittelwertskarte der Patienten mit K&L III und IV subtrahiert. B) Korrelationskarte, r >
I0,5I. Die markierten Signale in A) und B) sind farblich verstärkt. Die Nummerierung entspricht den Kandidaten S1 – S10 aus Tab. III-3. Rot dargestellte Signale entsprechen Peptiden, deren Signalstärke bei steigendem Arthrosegrad zunimmt. Blau dagegen sind Peptide gekennzeichnet, deren Intensität bei steigendem Erkrankungsgrad abnimmt.
Fraktion
B) A)
m/z
2
1
Abbildung III-10 A) Differenzkarte aus Plasma. Die Mittelwertskarte der Patienten mit K&L I und II wurde von der Mittelwertskarte der Patienten mit K&L III und IV subtrahiert. B) Korrelationskarte, r >
I0,5I. Die markierten Signale in A) und B) sind farblich verstärkt. Die Nummerierung entspricht den Kandidaten P1 – P10 aus Tab. III-4. Rot dargestellte Signale entsprechen Peptiden, deren Signalstärke bei steigendem Arthrosegrad zunimmt. Blau dagegen sind Peptide gekennzeichnet, deren Intensität bei steigendem Erkrankungsgrad abnimmt.
1
2 3
4 5 6
7
10 9 8
1 3
2
m/z m/z
Fraktion Fraktion A)
B)
III.2.5 Weiterführende statistische Analysen
III.2.5.1 Vergleich der Signalintensitäten
Im Folgenden wird auf die Kandidaten S1 und S2 der Tab. III-3 genauer eingegangen.
Aufgrund der größeren Nähe zum Krankheitsgeschehen kommt den Markerkandidaten in Synovialflüssigkeit eine größere Bedeutung zu als den Kandidaten der Plasmamessungen.
Markerkandidat S1 zeigt eine stetige Zunahme der Signalintensität zum Krankheitsstadium, während die Intensität des Kandidaten S2 stetig fällt. Die relative Differenz der Signalintensitäten zwischen beiden Erkrankungsgruppen betrug für Kandidat S1 46,8 % (absolute Differenz 3671,4) und für Kandidat S2 47,8 % (absolute Differenz 11949,7). Die detektierten Unterschiede werden in Abb. III-11 anhand der massenspektrometrischen Signalspuren und in Abb. III-12 anhand vonBox-and-Whiskers-Plots illustriert. In der Abb.
III-11 B) ist rechts vom Signal des Kandidaten S2 auch ein Signalpeak zu sehen, dessen Intensität sich in beiden Erkrankungsgruppen nicht unterscheidet. Derartige Signale entspechen Peptiden ohne diskriminierendes Potential.
III.2.5.2 ROC-Analyse
Die ROC-Kurven (Abb. III-13) geben einen Überblick über die Sensitivität und Spezifität beider Markerkandidaten. Das Integral der ROC-Kurven beider Peptide war vergleichbar:
ROC-AUC S1 81,9 % und ROC-AUC S2 79,8 %.
Abbildung III-11 Gemittelte Signalintensität (*) der Einzelmessungen für A) Kandidat S1 und B) Kandidat S2 (blaue Signalspur K&L I+II, rote Signalspur K&L III+IV)
Abbildung III-12 Box-and-Whiskers-Plots: Signalintensität MALDI A) Kandidat S1 und B) Kandidat S2. Dargestellt wird die Verteilung der Signalintensitäten: 2s-Bereich (farbiger Balken), Median (Querstrich, durchgehend), Mittelwert (Querstrich, gestrichelt), 95 % - Perzentile (Whiskers).
m/z A)
B)
A) B) m/z
IntensitätIntensität
Intensität
K&L I+II K&L III+IV K&L I+II K&L III+IV
*
*
Intensität
Abbildung III-13 ROC-Integrale A) Kandidat S1 und B) Kandidat S2
Falsch Positive (%)
Falsch Negative (%)
1 - Spezifität SensitivitätSensitivität
A) ROC-AUC 81,9 %
B) ROC-AUC 79,8 %
1 - Spezifität
III.2.5.3 Regressions- und Korrelationsanalyse, prädikative Werte und Fallzahl
Bei der Regressionsanalyse (Abb. III-14) wird anhand der Signalintensität eines Markers das Arthrosestadium geschätzt. Sie stellt somit eine Gegenprobe für die ermittelten Marker-kandidaten dar. Als „richtig“ wurde eine Schätzung gewertet, die < 1 Stadium vom radiologisch bestimmten Wert abwich.
Grad I-IV des Kellgren und Lawrence-Scores waren dabei durch folgende Werte definiert:
• K&L I 0,5 - < 1,5
• K&L II 1,5 - < 2,5
• bzw. K&L I+II 0,5 - < 2,5
• K&L III 2,5 - < 3,5
• K&L IV 3,5 - < 4,5
• bzw. K&L III+IV 2,5 - < 4,5
Abbildung III-14 Regressionsanalyse
34 32
39
7 9
2 0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Kandidat 1 Kandidat 2 Kandidaten 1+ 2 Zuordnung richtig Zuodnung falsch
Bei Berechnung mit Kandidat S1 weicht das geschätzte Stadium bei sieben Proben (17 %) um mehr als ein Stadium ab, bei Kandidat S2 bei neun Proben (22 %). Werden beide Markerintensitäten berücksichtigt, werden nur noch zwei Proben falsch zugeordnet (4,9 %).
Dieses Ergebnis wird unterstützt durch die multiple Korrelation: Bei kombinierter Messung der Kandidaten S1 und S2 erhöht sich der Korrelationsfaktor auf |0,7|. Dagegen beträgt er für die Einzelmessungen lediglich |0,55| bzw. |0,51| (Tab. III-3). Die Abb. III-15 stellt das geschätzte Arthrosestadium dem radiologisch diagnostizierten Stadium gegenüber:
Abbildung III-15 Multiple Regression für Kandidat S1 und S2 zusammen (A), lineare Regression für Markerkandidat S1 (B) und Markerkandidat S2 (C). Die blauen Linien geben den jeweiligen Ist-Wert des Kellgren und Lawrence-Scores der 41 analysierten Proben wieder. Mittels Regressionsanalyse wurde der Kellgren und Lawrence-Score ausgehend von der Signalintensität des bzw. der Markerkandidaten in jeder Probe geschätzt. ∆: Der berechnete Wert entspricht der radiologischen Beurteilung. ◊: Abweichung der Schätzung um 1 Stadium von der radiologischen Beurteilung.♦: Abweichung > 1 Stadium von der radiologischen Beurteilung.
0 1 2 3 4 5
K&L I K&L III K&L IV
K&L II
Messungen n=41 A)
0 1 2 3 4 5
C)
0 1 2 3 4 5
K&L I K&L III K&L IV
K&L II
Messungen n=41 B)
Messungen n=41 K&L I
K&L III K&L IV
K&L II
Die sich aus der multiplen Regression ergebenen Werte für Sensitivität, Spezifität sowie die prädikativen Werte sind in Tab. III-5 zusammengefasst.
Tabelle III-5 Sensitivität, Spezifität, positive und negative prädikative Werte (PPV, PPN)
Sensitivität (%) Spezifität (%) PPV (%) NPV(%)
Kandidat S1 61,9 85 81,3 68
Kandidat S2 71,4 65 68,2 68,4
Kandidaten S1+S2 66,7 90 87,5 72
Die Abschätzung der Fallzahl ergab bei p < 0,05 und einer Power von 90 % für die Arthrosegruppe K&L I oder II 19 bzw. 20 und für die Gruppe K&L III oder IV 22 bzw. 23 Patienten für Kandidat S1 bzw. S2. Die Berechnung ging von der gemittelten Standardabweichung aus und zu den ursprünglichen Werten wurden 15 % addiert. Die tatsächliche Population der Synoviamessungen bestand aus 20 Patienten mit Stadium I oder II und 21 Patienten mit Stadium III oder IV.
III.2.5.4 Sequenzierung und identifizierte Peptide
Sowohl aus Synovia als auch aus Plasma wurde eine Sequenzierung der Interestkandidaten versucht. Alle aus Synovialflüssigkeit identifizierten Peptide waren Fibrinogenfragmente (Tab. III-6). Während das Vorgehen für Plasmaproben bereits Routine war, wurden für Synovia verschiedene Präparationen unterschiedlicher Konzentrierung ausprobiert (3-fach bis 8,5-fach). Bei Kandidat S2 handelt es sich um ein Fibrinogen-α-Fragment (Tab. III-6, Abb.
III-16). Alle anderen in Tab. III-6 angegebenen Peptide standen in keinem nachgewiesenen Zusammenhang mit der Arthrose. Sie wurden im Rahmen des Peptide Trappings sequenziert.
Kandidat S1 und andere potentielle Markerpeptide konnten bisher mit der angewandten Methode bzw. Präparation nicht bestimmt werden. Obwohl die Massen in der MALDI-Messung sichtbar waren, gelang keine Detektion in den ESI-Spektren oder es ergaben sich Hinweise auf Glykosilierungen der Peptidketten.
IV. Diskussion
IV.1 Verschiedene Ansätze in der Biomarkerforschung
In den vergangenen 20 Jahren wurden verschiedene Substanzen des Knochen- und Knorpelstoffwechsels als Marker für die Diagnostik von Gelenkerkrankungen evaluiert. Zwar konnten für einige Stoffe signifikante Konzentrationsveränderungen im Zusammenhang mit bestimmten Erkrankungen und Krankheitsstadien nachgewiesen werden (vgl. K. I.1.5), die Entdeckung wirklicher, klinisch einsetzbarer Marker ist noch ausgeblieben. Die bisher bekannten Marker erlauben noch keine spezifische Diagnostik oder Prognose. Im Vordergrund stand bisher die „klassische“ Biomarkersuche basierend auf der Evaluierung bekannter Substanzen des Gewebeauf- oder -abbaus [Lammers, R.J. et al. 2005]. Dabei angewandte Methoden waren u. a. Immunoassays, Western-blot, In-Situ-Hybridization, Nephelometrie und Turbidimetrie [Singer, F. et al. 1987] sowie quantitative PCR [Yamagiwa, H. et al. 2003].
Parallel zum Fortschritt auf dem Gebiet der Proteomics- und Functional Genomicsstrategien werden zunehmend Ansätze verfolgt, die über die Beurteilung von Einzelsubstanzen hinausgehen und eine Erfassung der gesamten Proteinzusammensetzung in Blut, Synovia und/oder Synovialis bei Gelenkerkrankungen anstreben (vgl. K. I.2). Unterschieden werden können Gelmethoden von gelfreien Methoden oder eine Kombination aus beiden [Figeys, D.
et al. 2003]. Die Gelelektrophorese erbringt verbunden an andere Methoden weitere Informationen zur Charakterisierung der gefundenen Kandidaten: so erhält man z. B. mittels Immunohistochemie eine Aussage über die Art oder Identität der gefundenen Proteine [Fritz, P. et al. 1990]. Die Kombination mit der Massenspektrometrie ermöglicht die Identifizierung eines Proteins aufgrund seines Fragmentspektrums [Lorenz, P. et al. 2003; Sinz, A. et al.
20002]. Die Herstellung von Proteinarrays erlaubt die gleichzeitige Analyse vieler Target- moleküle in einem Experiment. Kennzeichnend für diese Techniken wie auch für das in dieser Arbeit angewandte Differential Peptide Display ist die simultane Erfassung zahlreicher Markerkandidaten (High-Throughput-Profiling-Techniken) [Urbanowska, T. et al. 2003].
Statt Einzelsubstanzen oder kleiner Substanzcluster werden bis zu mehrere Tausend Peptide gleichzeitig untersucht.
Beim Differential Peptide Display werden ausschließlich Eiweißmoleküle erfasst - eine Substanzklasse, die für die Suche nach biologischen Markern besonders erfolgsversprechend ist, da sie die typischen Mediatoren biologischer Prozesse sind [Corthals, G.L. et al. 2000].
Einige Kompartimente des Organismus enthalten auch gar keine gewebespezifische RNA.
Hierzu gehören die Körperflüssigkeiten, welche aber ein reizvolles Target zur Biomarkererfassung darstellen. In den Körperflüssigkeiten „sammelt“ sich alles; Eiweiße sind die aktiven Stoffe. Auf diese Weise gelingt die Erfassung des Phenotypes der Erkrankung.
Genom und Proteom stimmen nur bedingt überein. Viele Änderungen des Proteoms sind durch Genomanalyse nicht fassbar (vgl. K I.2).
In der vorliegenden Arbeit wurde auf Peptidebene ein Screening von biologischen Proben nach geeigneten Markern durchgeführt. Das Peptidspektrum von Proben, die von Patienten mit nach Kellgren und Lawrence klassifzierter Gonarthrose stammten, wurde analysiert.
Einzelne Peptide wurden unter Zugrundelegung des beobachteten Zusammenhangs ihres Auftretens mit dem Grad der Arthose statistisch gewertet. Dieses hypothesenfreie Verfahren ermöglicht eine Selektion auch solcher Peptide, die bisher noch gar nicht im Zusammenhang mit Arthrose oder allgemein mit dem Gelenkstoffwechsel beobachtet worden sind. Die weitere Validierung solcher Kandidaten erscheint besonders aussichtsreich.
Durch die differentielle Peptidanalyse findet die Auswahl potentieller Biomarker statt. Der nächste Schritt ist die Identifizierung der differenzierenden Signale. Hierzu wird die ESI-Quadrupol-TOF-Massenspektrometrie benutzt, bei der für das Ausgangsmolekül charakteristische Fragmentspektren erzeugt werden. Durch Recherchen in Datenbanken von Fragmentspektren kann das Peptid identifiziert oder vermutet werden.
Die Analyse von Peptiden unterscheidet sich dabei von den anderen Proteomics-Techniken:
Die Separation von Peptiden mittels 2-DE ist unbefriedigend. Aufgrund des kleineren Molekulargewichtes der Peptide werden eine schlechtere Auftrennung und Anfärbbarkeit erreicht. RP-Chromatographie und Kationenaustauschchromatographie dagegen ermöglichen eine nahezu verlustfreie Separation, da die Mehrheit der Peptide keine komplexe Sekundär- oder Tertiärstruktur besitzen und sich spontan falten kann. Zusätzlich erlaubt die Säulenchromatographie die Variation der Aufreinigungsmenge des Peptidmaterials von wenigen Submikrogramm bis zu Kilogramm mit preparativer Chromatographie. Durch eine für jedes Probenmaterial optimierte Vorbereitung wurden vorhandene Proteine mit einem
Molekulargewicht von mehr als 20 kDa zuvor abgetrennt. Anders als das 2-DE Gel basiert die Peptidkarte auf numerischen Daten und ist lediglich eine Visualisierung von Signalstärken.
Molekulargewicht von mehr als 20 kDa zuvor abgetrennt. Anders als das 2-DE Gel basiert die Peptidkarte auf numerischen Daten und ist lediglich eine Visualisierung von Signalstärken.