Lokalisierung und physiologische
Charakterisierung der Serinprotease DEG7 in Arabidopsis thaliana
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr.rer.nat)
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Ulrike Mogg
Tag der mündlichen Prüfung: 24.Oktober 2014 1.Referent: Dr. Dietmar Funck 2.Referentin: Frau Prof. Elisa May
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS)
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ... VII Abstract ... IX
Einleitung ... 11
1. Proteostase ... 11
1.1 Modifizierung von Proteinen durch limitierte Proteolyse ... 12
1.2 Proteinqualitätskontrolle: ein Zusammenspiel von Proteasen und Chaperonen ... 13
2. Klassifizierung von Proteasen ... 14
3. Deg/HtrA-Proteasen ... 16
4. Nma111p, die Deg/HtrA-Protease in Saccharomyces cerevisiae ... 17
5. DEG-Proteasen in A. thaliana ... 18
5.1 DEG-Proteasen im Chloroplasten ... 19
5.1.1 DEG1, 5 und 8 im Thylakoidlumen ... 20
5.1.2 DEG2 im Stroma ... 20
5.2 DEG15 im Peroxisom ... 21
5.3 DEG10 und DEG14 im Mitochondrium ... 22
5.4 DEG9 im Zellkern ... 22
6. DEG7, die in dieser Arbeit untersuchte Protease ... 23
7. Der Zellkern ... 24
7.1 Import von Proteinen in den Zellkern ... 25
8. Dual lokalisierte Proteine: ein Protein in zwei Organellen ... 25
9. Programmierter Zelltod ... 26
9.1 Das Mycotoxin Fumonisin B1 ... 27
10. Modellorganismus: Arabidopsis thaliana ... 28
11. Ziele dieser Arbeit ... 29
Ergebnisse und Diskussion ... 31
1. Mikroskopische Lokalisierungsstudien zu DEG7 ... 31
1.1 DEG7 ist im Zellkern lokalisiert ... 31
1.2 Die einteilige KLS von DEG7 wird in den Zellkern importiert ... 32
1.3 Beide Spleißvarianten von DEG7 sind im Zellkern lokalisiert ... 35
1.4 C-terminal verkürztes DEG7Met1-Leu243 ist ebenfalls im Zellkern lokalisiert ... 37
2. Lokalisierung von DEG7 durch Zellfraktionierung ... 39
IV
2.1 Lokalisierung von überexprimiertem DEG7-GFP im Zellkern ... 39
2.2 DEG7 ist nicht im Stroma lokalisiert ... 42
2.3 Isolierte Wildtyp-Zellkerne weisen natürlich vorkommendes DEG7 auf ... 43
2.4 DEG7 wird reduziert in Zellkernen von ∆deg7-Mutanten exprimiert ... 45
3. Versuche zum Erhalt eines spezifischen DEG7-Antikörpers ... 48
3.1 Aufreinigung des Antiserums α-DEG7Lys202-Gly216 über positive und negative Adsorption ... 48
3.1.1 Aufreinigung des Antigens DEG7Met1-Gln563 ... 49
3.1.2 Aufreinigung von Pyrrolin-5-Carboxylatreduktase (P5CR) für die negative Adsorption ... 50
3.2 Die Aufreinigung des Antiserums α-DEG7Lys202-Gly216 führte zu einer Verbesserung der Sensitivität und Spezifität für DEG7 ... 51
3.3 Ein Peptidantikörper gegen DEG7Glu545-Ser558 detektiert kein natives DEG7 in isolierten Zellkernen aus A. thaliana ... 53
3.3.1 Ein Antigen im Bereich zwischen den beiden Hälften von DEG7 verspricht hohe Spezifität und Immunogenität ... 54
3.3.2 α-DEG7Glu545-Ser558 erkennt rekombinantes DEG7 aus E. coli und überexprimiertes DEG7-GFP in Zellkernextrakt aus A. thaliana ... 55
4. Überexpression von DEG7 und Nma111p in der ∆nma111-Hefemutante zeigen erhöhte Sterblichkeit nach Hitzestress ... 58
4.1 Genotyp der ∆nma111-Deletionsmutante konnte bestätigt werden ... 58
4.2 DEG7 wird in der ∆nma111-Deletionsmutante exprimiert ... 59
4.3 Die Expression von DEG7 und Nma111p unter der Kontrolle des Nma111- Promotors verändert die Hitzetoleranz von Hefen nicht ... 62
4.4 Galaktose-gesteuerte Expression von DEG7 in der ∆nma111-Hefemutante führt zu einer geringeren Überlebensrate unter Hitzestress ... 63
5. Physiologische Charakterisierung von DEG7 ... 66
5.1 Charakterisierung von homozygoten ∆deg7-Linien ... 66
5.2 Generierung von ∆deg7/∆deg9 T-DNA Insertionsmutanten ... 68
5.3 ∆deg7-Mutanten weisen unter normalen Wachstumsbedingungen keine Defekte in Wachstum und Entwicklung auf ... 70
5.4 Aktivierung der Cysteinprotease RD21 benötigt DEG7 nicht ... 70
5.5 DEG7 ist am programmierten Zelltod in A. thaliana beteiligt ... 72
Schlussfolgerungen und Ausblick ... 75
Material und Methoden ... 79
1. Chemikalien... 79
2. Software ... 79
3. Internetseiten ... 79
4. Antibiotika ... 79
5. Organismen ... 80
6. Molekularbiologische Methoden ... 81
6.1 DNA-Extraktion aus A. thaliana ... 81
6.2 RNA-Extraktion aus A. thaliana ... 81
6.3 cDNA-Synthese... 81
6.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 81
6.4.1 Annealing von Primern ... 84
6.5 Agarose-Gelelektrophorese ... 84
6.6 Klonierung ... 84
6.6.1 Blunt-end Klonierung ... 85
6.6.2 Gerichtete TOPO-Klonierung® ... 85
6.6.3 Gateway®-Klonierung ... 86
6.6.4 Restriktion ... 86
6.7 Transformation von A. tumefaciens ... 86
6.8 Transformation von S. cerevisiae ... 87
7. Biochemische Methoden ... 87
7.1 Gesamtprotein-Extraktion aus S. cerevisiae durch NaOH-Lyse ... 87
7.2 Gesamtprotein-Extraktion aus E. coli, die DEG7Met1-Asp1070 heterolog exprimieren ... 87
7.3 Gesamtprotein-Extraktion aus A. thaliana ... 87
7.4 Überexpression von Proteinen in S. cerevisiae ... 88
7.5 Isolierung von Organellen aus A. thaliana ... 88
7.5.1 Zellkerne ... 88
7.5.2 Intakte Chloroplasten, Thylakoide und Stroma ... 88
7.6 Proteinbestimmung ... 89
7.7 SDS-PAGE und Immunoblot Analyse ... 89
7.8 Heterologe Expression in E. coli ... 90
7.9 Aufschluss von E. coli durch Sonifizierung ... 90
7.10 Proteinaufreinigung über Nickelaffinitätschromatographie ... 91
7.10.1 Aufreinigung von DEG7Met1-Gln563 ... 91
7.10.2 Aufreinigung von P5CR ... 92
VI
7.11 Antiserum Aufreinigung ... 92
7.11.1 Vorbereitung der Säulen ... 92
7.11.2 Reinigung des Antiserums α-DEG7S206 ... 92
7.11.3 Regeneration der Säulen ... 93
8. Zellbiologische Methoden ... 93
8.1 Thermotoleranz Assay in S. cerevisiae... 93
8.2 Transformation von A. thaliana mittels Floral dip ... 93
8.3 Transiente Transformation von N. benthamiana ... 94
8.4 Epifluoreszenz-Mikroskopie von Protoplasten ... 94
8.5 Sterilisation von A. thaliana Samen ... 94
8.6 Induktion von programmiertem Zelltod durch Fumonisin B1 in A. thaliana ... 95
8.7 Anzuchtsbedingungen für A. thaliana ... 95
Referenzen ... 97
Danksagung ... 111
Publikation ... 113
Zusammenfassung
Zusammenfassung
DEG/HtrAProteasen sind ATP-unabhängige Serin-Endopeptidasen und kommen in nahezu allen Domänen des Lebens vor. Mitglieder dieser Familie besitzen eine Proteasedomäne des Chymotrypsin-Typs mit His-Asp-Ser als katalytische Triade und eine oder mehrere C-terminal vorliegende Protein-Protein Interaktionsdomänen, die PDZ-Domänen. Nach Daten aus anderen Organismen sind DEG/HtrA-Proteasen häufig an der Proteinqualitätskontrolle beteiligt. Dies ist vermutlich für photosynthetische, sesshafte Organsimen besonders wichtig, da sie zahlreichen Stresssituationen ausgeliefert sind, wodurch es zu Schädigungen von Proteinen kommt. Das Genom von A. thaliana kodiert für sechzehn DEG Proteasen, die in verschiedenen subzellulären Kompartimenten lokalisiert sind.
Die Serinprotease DEG7 ist doppelt so lang wie die anderen fünfzehn DEG-Proteasen in A. thaliana, was vermutlich das Ergebnis einer Genduplikation ist. Diese resultiert in einer ungewöhnlichen Domänenanordnung von DEG7 mit zwei Proteasedomänen, von denen die erste potentiell katalytisch aktiv ist, während die zweite in einer degenerierten, inaktiven Form vorliegt. Es wurde berichtet, dass DEG7 im Chloroplast von A. thaliana vorkommt und dort am Reparaturzyklus von PSII beteiligt sein soll. Ich konnte sowohl über mikroskopische Lokalisierungsstudien mit DEG7-GFP Fusionsproteinen, als auch über Immunoblot-Analyse nachweisen, dass DEG7 im Zellkern lokalisiert ist.
In dieser Arbeit wurden zwei DEG7-Peptidantikörper charakterisiert, die rekombinantes DEG7 aus E. coli erkennen. Die Sensitivität sowie die Spezifität beider Peptidantikörper gegenüber DEG7 im Pflanzenextrakt waren jedoch gering. Deshalb wurde eines der beiden Antiseren über negative und positive Adsorption aufgereinigt. Die Spezifität für DEG7 in Pflanzenextrakt konnte erhöht werden, es wird aber weiterhin ein zweites, unbekanntes Kernprotein mit einem ähnlichen Molekulargewicht erkannt.
Das Hefe-Ortholog von DEG7, Nma111p, ist ebenfalls im Zellkern lokalisiert und hat dort eine Funktion in der Einleitung der Apoptose. Überexpression der artfremden DEG7-Protease in einem S. cerevisiae ∆nma111-Deletionsstamm zeigte den gleichen fördernden Effekt auf die hitzebedingte Apoptoseinduktion wie Überexpression von Nma111p. Apoptose in Hefezellen ist ein vergleichbarer Prozess zum programmierten Zelltod in Pflanzen. Nach der Charakterisierung von zwei unabhängigen ∆deg7-T-DNA Insertionsmutanten konnte ich zeigen, dass die Sensitivität von Keimlingen der beiden ∆deg7-Mutanten gegenüber dem Mycotoxin Fumonisin B1 als Elicitor von programmiertem Zelltod im Vergleich zu Wildtyp-Keimlingen signifikant erniedrigt war. Ich konnte somit zeigen, dass DEG7 eine pro-apoptotische Funktion besitzt und postuliere, dass DEG7 als positiver Regulator im pflanzlichen Zelltod agiert, indem Proteine, die inhibierend auf den Zelltod wirken, im Zellkern abgebaut werden.
Abstract
Abstract
DEG/HtrA proteases are ATP-independent serine endopeptidases and occur in all domains of life. Members of this family contain a chymotrypsin type protease domain with His-Asp-Ser as a catalytic triad and one or more C-terminally located protein-protein interaction PDZ domains.
DEG/HtrA proteases are often involved in protein quality control which is especially important in photosynthetic, sessile organisms that are subjected to numerous stress situations, which lead to damaged proteins. The genome of Arabidopsis thaliana encodes for sixteen DEG proteases which are localized in various subcellular compartments.
The serine protease DEG7 is twice as long as all other fifteen DEG proteases in A. thaliana, suggesting that DEG7 underwent an internal gene duplication event. The domain arrangement of DEG7 is unusual because it contains two protease domains, one active and one degenerated.
Recently, it was reported that DEG7 is located in the chloroplast of A. thaliana and is potentially involved in the PSII repair cycle. I demonstrate here that DEG7 was found in the nucleus, both by localisation studies using DEG7-GFP and detection of DEG7-GFP in isolated nuclei by immunoblotting.
In this work, two peptide antibodies against DEG7 were generated, which detected recombinant DEG7 expressed in E. coli. However, both antisera showed poor sensitivity or specificity for DEG7 in plant extracts. Therefore one antiserum was purified by negative and positive adsorption, resulting in an increased specificity for DEG7 in plant extract. However, a second unknown nuclear protein with a similar molecular weight of DEG7 is still detected.
The yeast ortholog of DEG7, Nma111p, is localised in the nucleus and mediates apoptosis. The introduction of A. thaliana DEG7 protease into S. cerevisiae demonstrated that overexpression of DEG7 had the same promoting effect on the induction of apoptosis under heat stress as overexpression of Nma111p in the yeast deletion strain ∆nma111. Apoptosis in yeast cells is a process similar to plant programmed cell death (PCD). After the characterisation of two independent ∆deg7 knockout plants, the sensitivity of seedlings of ∆deg7 knockout plants against the fungal toxin Fumonisin B1 as elicitor for programmed cell death was significantly diminished in comparison to seedlings of wildtype plants. I conclude that DEG7 exhibits a pro- apoptotic function and propose that DEG7 acts as a positive regulator of plant PCD by degrading inhibitors of PCD in the nucleus.
Einleitung
1. Proteostase
Proteine werden aus demselben Satz von 20 Aminosäuren aufgebaut, sind also Ketten aus vielen Aminosäure-Einheiten. Ob ein Protein nun eine enzymatische oder hormonelle Funktion übernimmt, Antikörper-Aktivität aufweist oder es sich um Transport-, Struktur- oder Speicherproteine handelt, hängt ab von ihren Aminosäurebausteinen, die eine charakteristische Sequenz bilden. Die spezifische Funktion jedes Proteins ist in seinem Gen festgelegt (Lehninger 1987). Die Gesamtheit der Proteine innerhalb einer Zelle, aber auch eines Gewebes oder Organismus wird als Proteom bezeichnet. Unter Proteostase versteht man die Aufrechterhaltung eines funktionalen Proteoms, worauf im Folgenden näher eingegangen wird:
Ein aufeinander abgestimmter Vorgang von Prozessen in einer Zelle ist essentiell für die Lebensfähigkeit der Zelle und wird als Proteostase bezeichnet. Die Proteostase schließt drei Prozesse ein: zum einen die Proteinbiogenese, zum anderen die Proteinmodifikationen sowie des Weiteren die Proteinqualitätskontrolle, die auch den Abbau von Proteinen einschließt (Abb.
1). Die Prozesse der Proteostase führen dazu, dass das Proteom einer Zelle erhalten bleibt und die Zelle bzw. der Organismus die Fähigkeit besitzt sich auf Proteinebene an umweltbedingte Veränderungen anzupassen (Arnsburg und Kirstein-Miles 2014). Es wird auf diese Weise gewährleistet, dass jedes Protein funktionstüchtig vorliegt. Ist dies nicht mehr der Fall werden Proteine eliminiert um die Zelle vor Schäden zu bewahren (Baker und Haynes 2011, Powers und Balch 2013).
Abb. 1: Die Proteostase schließt drei Prozesse ein: Proteinbiosynthese, Proteinmodifikationen und Aggregation und/oder Abbau von Proteinen (modifziert von http://www.sfb969.uni- konstanz.de/research/)
Einleitung
12
Im Rahmen der Proteostase nimmt insbesondere bei der Proteinqualitätskontrolle der Abbau von Proteinen, die Proteolyse, wichtige Funktionen wahr. Bei der Proteolyse kommt es zur Hydrolyse von Peptidbindungen eines Proteins, was durch Enzyme, die als Proteasen bezeichnet werden, katalysiert wird. Neben der Reparatur falsch gefalteter Proteine und dem Abbau von Proteinen, die nicht mehr funktionstüchtig sind oder nicht mehr benötigt werden übernimmt die Proteolyse auch Funktionen an der Reifung von Vorläuferproteinen und ist damit an Vorgängen der Signaltransduktion und an posttranlationalen Modifikationen beteiligt (Wickner et al. 1999, Hasenbein et al. 2007, Turk und Stoka 2007). Die Spaltung einer Peptidbindung ist irreversibel und eine unkontrollierte intrazelluläre Proteolyse ist gefährlich für die Zelle. Komplexe Mechanismen stellen sicher, dass das richtige Protein zum richtigen Zeitpunkt abgebaut wird (Huesgen 2007). Es gibt Proteasen, deren Substratspezifität so hoch ist, dass sie ausschließlich ein Substrat angreifen, während Proteasen mit einem breiteren Substratspektrum ein Signal wie beispielsweise eine Konformationsänderung oder posttranslationale Modifikation des Substrats benötigen um proteolytisch aktiv zu werden (Turk und Stoka 2007). Einige Proteasen werden als inaktives Vorläuferprotein synthetisiert und werden erst aktiviert wenn sie ihr Zielkompartiment erreicht haben oder werden erst unter bestimmten zellulären Bedingungen proteolytisch aktiv.
Im Folgenden wird auf zwei der drei Prozesse in der Proteostase nämlich auf die Proteinmodifikationen und die Proteinqualitätskontrolle näher eingegangen, da es dort zur Beteiligung von Proteasen kommt.
1.1 Modifizierung von Proteinen durch limitierte Proteolyse
Proteasen können durch limitierte Proteolyse Proteine irreversibel modifizieren und sind an Prozessen wie Signaltransduktionen und posttranslationalen Modifikationen beteiligt (Hasenbein et al. 2007, Turk und Stoka 2007). Proteine mit N-terminalen Präsequenzen bzw.
Transitpeptiden werden aufgrund der Signalsequenz zum korrekten subzellulären Kompartiment geführt. Die Signalpeptide werden zumeist nach dem Import ins Zielkompartiment, z.B. das Mitochondrium (Neupert 1997), den Chloroplasten (Kirwin et al. 1988, Shi und Theg 2013) oder das Peroxisom (Swinkels et al. 1991, Lanyon-Hogg et al. 2010) spezifisch vom Protein abgespalten und stellen ein Beispiel für eine posttranslationale Modifikation dar. Eine selektive Prozessierung an einer spezifischen Stelle eines Proteins kann auch zur Aktivierung oder Inaktivierung eines Enzyms führen. Die Auslösung des programmierten Zelltods bei Tieren beispielsweise erfolgt durch eine proteolytische Signalkaskade, die Caspasekaskade, unter Beteiligung von Proteasen. Eine Initiator-Caspase wird nach Empfang eines pro-apoptotischen Signals durch autoproteolytische Spaltung aktiviert und spaltet ihrerseits wiederum Effektor- Procaspasen. Die aktiven Effektor-Caspasen wirken daraufhin auf eine Vielzahl von weiteren Substraten und führen schließlich zum Zelltod (Thornberry 1998, Turk und Stoka 2007, Kurokawa und Kornbluth 2009). Alternativ kann bei einer Signaltransduktion ein Vorläuferprotein mehrfach durch zahlreiche Proteasen gespalten werden. Ein Beispiel hierfür ist die Weiterleitung eines Stressignals über die Membran im σE-Signalweg in Escherichia coli. In der Plasmamembran von E. coli wird die Serinprotease DegS durch die Interaktion mit einem falsch gefalteten Protein aktiviert und spaltet das Transmembranprotein RseA an einer periplasmatischen Proteinschleife (Clausen et al. 2002, Walsh et al. 2003, Wilken et al. 2004,
Einleitung Hasenbein et al. 2007, Barchinger und Ades 2013). Dieses Ereignis löst eine weitere Spaltung von RseA durch eine zweite Protease, der Metalloprotease YaeL, aus und führt zur Freisetzung des alternativen σE-Faktors aus dem Vorläuferprotein RseA. Der freie σE-Faktor schaltet dann die Transkription von Genen zur Stressantwort an (Hasenbein et al. 2007, Barchinger und Ades 2013).
1.2 Proteinqualitätskontrolle: ein Zusammenspiel von Proteasen und Chaperonen
Bei der zellulären Qualitätskontrolle sollen aggregierte oder geschädigte Proteine entweder verhindert, repariert oder abgebaut werden um die Zellhomöostase aufrechtzuerhalten (Wickner et al. 1999, Bukau et al. 2006, Baker und Haynes 2011). Die dreidimensionale Faltung eines Proteins hängt von den intramolekularen Wechselwirkungen einer Polypeptidkette ab und ist durch die Primärstruktur vorgegeben. Bei korrekt gefalteten löslichen Proteinen befinden sich hydrophobe Reste meist im Inneren des Proteins während bei nicht nativ gefalteten Proteinen die hydrophoben Reste ins wässrige Milieu ragen und dort mit Proteinen und hydrophoben Substanzen aggregieren um dem wässrigen Milieu zu entgehen (Ellis und Minton 2006, Hartl et al. 2011). Die Aggregation von Proteinen führt zur Beeinträchtigung der normalen Zellfunktion und kann beim Menschen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson zur Folge haben (Soto et al. 2006, Baker und Haynes 2011, Hartl et al. 2011).
Abb. 2: Qualitätskontrolle von Proteinen durch das Zusammenspiel von Chaperonen und Proteasen
Chaperone helfen Polypetidketten bei der korrekten Faltung nach Verlassen des Ribosoms und können falsch gefaltete Proteine wieder entfalten und in den korrekten Faltungszustand überführen. Nicht zu rettende, falsch gefaltete oder geschädigte Proteine werden abgebaut durch die Beteiligung von Proteasen und durch den proteosomalen Abbau.
Einleitung
14
Falsch gefaltete Polypeptidketten können bereits bei der Biosynthese am Ribosom entstehen oder posttranslational, wenn eine Zelle oder ein Organismus Stress ausgesetzt ist. Unter Stress werden vermehrt aggressive chemische Reagenzien wie beispielsweise reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet, die zumeist schädliche Modifikationen von Proteinen auslösen können (Wickner et al. 1999, Tatsuta 2009). Deshalb entwickelte sich während der Evolution ein gut abgestimmtes Netzwerk aus Proteasen und Chaperonen, die den Faltungszustand von Proteinen permanent kontrollieren (Baker und Haynes 2011) (Abb. 2).
Chaperone sind Proteine, die ungefaltete Proteine, insbesondere Polypeptidketten die das Ribosom gerade verlassen, erkennen und ihnen bei der korrekten Faltung behilflich sind (Bukau et al. 2006, Liberek et al. 2008, Hartl et al. 2011). Einige Chaperone sind zylindrisch aufgebaut und stellen für die Faltung ein zentrales Kompartiment zur Verfügung. Auf diese Weise kann sich die Polypeptidkette getrennt von anderen Proteinen oder bereits vorhandenen Aggregaten falten (Hartl et al. 2011, Kim et al. 2013). Bereits aggregierte und falsch gefaltete Proteine können mithilfe von Chaperonen gerettet werden, indem sie entfaltet werden und erneut in den korrekten Faltungszustand überführt werden (Bukau et al. 2006, Liberek et al. 2008).
Proteinaggregate oder falsch gefaltete Proteine, die nicht mehr durch Chaperone gerettet werden können, werden durch Proteasen vollständig abgebaut (Wickner et al. 1999, Bukau et al. 2006).
Die dabei entstehenden Aminosäuren werden bei der Neusynthese von Proteinen recycelt.
Manche Enzyme besitzen sowohl Chaperon- als auch Proteaseaktivität, wie für einige Mitglieder der Serinproteasen-Familie der Deg-Proteasen gezeigt wurde (Spiess et al. 1999, Clausen et al. 2002). Die primäre Abbaumaschinerie für Proteine in Eukaryoten ist das ATP- abhängige 26S-Proteasom, ein hoch konserviertes Oligomer aus Threoninproteasen (DeMartino et al. 1996, Glickman und Ciechanover 2002). Proteine, die für den proteasomalen Abbau bestimmt sind, werden durch Ubiquitinierung markiert indem mehrere Ubiquitin-Proteine an das abzubauende Protein angehängt werden. Eine regulatorische Untereinheit des 26S- Proteasoms erkennt aufgrund der Ubiquitinierung das abzubauende Protein und entfaltet das Protein unter Verbrauch von ATP. Die entfaltete Polypeptidkette wird ins Proteasom geführt und zu Oligopeptiden abgebaut (Glickman und Ciechanover 2002, Vierstra 2003). Neben der Beseitigung von falsch gefalteten Proteinen, die z.B. durch zellulären Stress entstanden sind, ist der proteasomale Abbauweg auch für die Regulation der Transkription, die Zelldifferenzierung, die Hormonantwort, die Stoffwechselregulation, die Pathogenabwehr und die Seneszenz zuständig sowie am Zelltod beteiligt (Hellmann und Estelle 2002, Yang und Yu 2003, Smalle und Vierstra 2004). Bakterien und eukaryotische Organellen, die durch Endosymbiose entstanden sind wie Mitochondrien und Chloroplasten, besitzen keinen proteosomalen Abbauweg (Gottesman 2003), überflüssige Proteine werden durch ATP-abhängige Proteasen wie Clp-, Lon- und FtsH-Proteasekomplexe oder durch ATP-unabhängige Proteasen wie Deg- Proteasen abgebaut (Gottesman 2003, Jarvis und Robinson 2004, Adam et al. 2006, Huesgen et al. 2006, Baker und Haynes 2011).
2. Klassifizierung von Proteasen
Wie im vorherigen Kapitel bereits beschrieben, stellt die Proteolyse, ein wichtiger Mechanismus bei der Proteinqualitätskontrolle, bei der Reifung von Vorläuferproteinen sowie an posttranslationalen Modifikationen dar (Wickner et al. 1999, Hasenbein et al. 2007, Turk und
Einleitung Stoka 2007). Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine große Anzahl an Proteasen benötigt wird um diverse Funktionen der Proteolyse zu erfüllen. In allen bisher vollständig sequenzierten Genomen kodieren 2-5% aller Gene für Proteasen (Barrett et al. 2003). Bezieht man alle Gene mit ein, die am Ubiquitin-Proteasom-System in Eukaryoten beteiligt sind, ist der Anteil noch höher (Vierstra 2003). In Pflanzen, die den proteasomalen Abbauweg auch besitzen, kann von ungefähr 10% aller Gene ausgegangen werden, die für Proteine kodieren, die am Abbau von Proteinen beteiligt sind (Vierstra 2003).
Abb. 3: Mechanismus der Spaltung einer Peptidbindung durch eine Serinprotease
Zuerst kommt es zur Erhöhung der Nukleophilie des katalytischen Serinrests durch die Bildung einer Wasserstoffbrücke mit dem Histidin (1). Die entstandende Hydroxylgruppe greift dann die Carbonylgruppe der Peptidbindung an unter Ausbildung eines Zwischenprodukts (2). Nach Neuordnung der Elektronen wird die Aminokomponente freigesetzt und das Serin acetyliert (3). Der nukleophile Angriff eines Wassermoleküls am Acyl- Enzym-Zwischenprodukt (acetyliertes Serin) (4) führt zu einem Zwischenprodukt (5) und schließlich zur Deacetylierung des Serins unter Freisetzung der Carbonsäurekomponente (6) (Berg et al. 2013).
(http://de.wikipedia.org/wiki/Katalytische_Triade )
Für eine bessere Übersicht wird die Vielzahl der verschiedenen Proteasen nach strukturellen und funktionalen Kriterien in Gruppen eingeteilt. Zum einen werden Proteasen allgemein unterteilt anhand ihrer endo- bzw. exoproteolytischen Aktivität. Endoproteasen hydrolisieren eine Peptidbindung innerhalb eines Peptids, während Exoproteasen an N- oder C-terminalen Resten spalten und in Amino- oder Carboxyproteasen unterteilt werden (Barrett et al. 2001).
Einleitung
16
Zum anderen werden in der MEROPS-Datenbank Proteasen in Klans und Familien unterteilt (Rawlings et al. 2006). Ein Klan besteht aus Proteasen, die evolutionär von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen und ähnliche dreidimensionale Faltung aufweisen (Rawlings und Barrett 1993, Rawlings et al. 2006). Proteasen innerhalb einer Familie weisen den gleichen molekularen Mechanismus der Peptidspaltung auf und der „katalytische Aminosäurerest“ der Protease, der den Spaltungsprozess initiiert, ist namensgebend für die jeweilige Familie:
Aspartat-, Cystein-, Glutamat-, Serin-, Threonin- oder Metalloproteasen (Rawlings und Barrett 1993, Rawlings et al. 2006). Die Hydrolyse einer Peptidbindung durch Proteasen erfolgt entweder durch direkte Aktivierung eines Wassermoleküls bei Aspartat-, Glutamat- und Metalloproteasen oder es erfolgt bei Serin-, Cystein- und Threoninproteasen ein nukleophiler Angriff der katalytisch aktiven Aminosäure-Seitenkette auf die Carbonylgruppe der Peptidbindung. Dabei kommt es zur Ausbildung eines Zwischenprodukts zwischen Protease und Substrat, welches dann durch ein Wassermolekül hydrolysiert wird (Barrett et al. 2003) (Abb.
3). Die hohe Nukleophilie des katalytischen Aminosäurerests wird durch die räumliche Nähe eines Histidinrests und teilweise durch einen zusätzlichen Aspartatrest in der Protease erreicht (Abb. 3). Diese drei essentiellen Aminosäurereste werden als katalytische Triade einer Protease bezeichnet (Rawlings und Barrett 1993, Berg et al. 2013).
3. Deg/HtrA-Proteasen
Deg-Proteasen, auch als HtrA-Proteasen bezeichnet, gehören zur Familie der ATP- unabhängigen Serinproteasen und sind in nahezu jedem Organismus, einschließlich Gram- positiver und Gram-negativer Prokaryoten, Pflanzen und Säugern konserviert (Clausen et al.
2002). Alle Deg-Proteasen besitzen eine Proteasendomäne des Chymotrypsin-Typs und gehören gemäß der MEROPS-Datenbank zur S1B Familie des Klan PA (Rawlings et al. 2008). Die katalytische Triade wird von den drei Aminosäureresten in der Reihenfolge Histidin, Aspartat und Serin vom N-Terminus ausgehend gebildet (Pallen und Wren 1997). Auf die Proteasedomäne folgen zumeist eine oder mehrere PDZ-Domänen (Clausen et al. 2002). Die PDZ-Domänen sind an der Substraterkennung, an Interaktionen zwischen Untereinheiten und somit der Bildung von homooligomeren Komplexen und an der Regulation der Aktivität beteiligt (Clausen et al. 2002, Walsh et al. 2003, Ehrmann und Clausen 2004, Kim und Kim 2005, Krojer et al. 2008). Die Abkürzung PDZ steht für die ersten drei Proteine, bei denen eine solche Domäne identifiziert wurde, nämlich PSD-95/SAP90, Disc-large und ZO-1 (Ponting 1997). Teilweise sind weitere Strukturelemente am N-Terminus vorhanden wie Signalsequenzen, Transmembranhelices oder IGFBP (insulin-like growth factor-binding protein)-Domänen (Clausen et al. 2002, Hansen und Hilgenfeld 2013). Der Prototyp dieser Familie, DegP oder HtrA, wurde zweimal unabhängig bei der Untersuchung von E. coli Mutanten entdeckt. Die Stämme hatten entweder die Fähigkeit, periplasmatische Proteine abzubauen (degradation of periplasmic proteins), oder die Toleranz gegenüber erhöhten Temperaturen (high temperature requirement) verloren (Lipinska et al 1989, Strauch et al.
1989).
Einleitung
Abb. 4: Typische Domänenanordnung von Deg/HtrA-Proteasen (Schuhmann 2008)
Deg/HtrA-Proteasen besitzen eine Vielfältigkeit hinsichtlich ihrer physiologischen Funktionen.
Prokaryotische Deg-Proteasen sind an der Hitzestress-Antwort beteiligt und wichtig für die Toleranz gegenüber erhöhten Temperaturen, extremen pH-Werten sowie erhöhtem oxidativen und osmotischen Stress. Sie wirken dem Stress bei der Proteinfaltung entgegen und spielen eine wichtige Rolle in der Proteinqualitätskontrolle periplasmatischer Proteine (Skorko-Glonek et al.
1999, Clausen et al. 2002, Alba und Gross 2004, Onder et al. 2008). In Eukaryoten sind HtrA- Proteasen an zahlreichen zellulären Prozessen wie der Neugestaltung der extrazellulären Matrix, der Apoptose und der Proteinqualitätskontrolle beteiligt (Hansen und Hilgenfeld 2013).
Menschliche HtrA-Proteasen sind außerdem involviert in die Zellentwicklung und in Alterungsprozesse. Es wird des Weiteren angenommen, dass sie eine Rolle spielen bei Erkrankungen wie Arthritis, Krebs, Parkinson und Alzheimer (Clausen et al. 2011).
Homooligomere Komplexe von Deg/HtrA-Proteasen werden aus Trimeren, die die Grundeinheit darstellen und durch die Interaktion der Proteasedomänen entstehen, gebildet (Clausen et al. 2002). Aus diesen Trimeren werden dann oligomere Komplexe höherer Ordnung gebildet wie beispielsweise Hexamere bei DegP aus E. coli und bei DEG1 in A. thaliana (Clausen et al. 2002, Kley et al. 2011), wobei für DegP in E.coli auch die Bildung von 12- oder 24meren beschrieben wurden (Krojer et al. 2008). Die Interaktionen zwischen den Trimeren-Grundeinheiten zu höheren Oligomeren werden durch die PDZ- Domänen vermittelt (Kim und Kim 2005, Krojer et al. 2008).
Fast jedes untersuchte Genom enthält Gene, die für Deg/HtrA-Proteasen kodieren, jedoch unterscheiden sie sich in der Anzahl an Deg/HtrA-Proteasen. Prokaryoten besitzen drei, Pilze (einschließlich Hefe) nur eine, wobei manche Pilze Gene für zwei Isoformen besitzen (Schuhmann et al. 2011) und Säuger besitzen fünf Deg/HtrA-Proteasen (Clausen et al.
2002). Pflanzliche Genome wie A. thaliana, Oryza sativa und Populus trichocarpa kodieren für eine größere Anzahl nämlich 16, 15 und 17 Deg-Gene (Adam et al. 2001, Garcia-Lorenzo et al. 2006, Tripathi und Sowdhamini 2006). Der Grund für die größere Anzahl an Deg-Proteasen in Pflanzen ist bisher ungeklärt. Eine Erklärung könnte sein, dass aufgrund der Sessilität von Pflanzen mehr Proteasen zur Proteinqualitätskontrolle benötigt werden, da sie Stresssituationen nicht entgehen können. Darüber hinaus besitzen sie im Gegensatz zu Säugern und Prokaryoten ein oder zwei endosymbiontische Organellen mehr.
4. Nma111p, die Deg/HtrA-Protease in Saccharomyces cerevisiae
Das Genom des eukaryotischen Modelorganismus S. cerevisiae kodiert für eine einzige Deg/HtrA-Protease, genannt Nma111p (nuclear mediator of apoptosis, systematischer Name Ynm3). Nma111p besitzt, vermutlich durch eine interne Genduplikation, zwei Proteasedomänen (Abb. 7). In der N-terminalen Proteasedomäne ist die katalytische Triade His121-Asp152-Ser235/236
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klar erkennbar, wohingegen in der zweiten Proteasendomäne nicht mehr alle drei Aminosäure- Reste vorliegen, wodurch diese Domäne vermutlich keine katalytische Aktivität mehr aufweist (Fahrenkrog 2011). Die Konsensus-Sequenz (GNSSG) in der aktiven Proteasedomäne enthält zwei Serinreste, Ser235 und Ser236, wobei noch nicht eindeutig geklärt wurde, ob ein oder beide Serinreste katalytisch aktiv sind. Es wurde sowohl für Ser235 als auch für Ser236 gezeigt, dass sie entscheidend beteiligt sind an der proteolytischen Aktivität (Fahrenkrog et al. 2004, Belanger et al. 2009, Padmanabhan et al. 2009). Ein zweiteiliges Kernlokalisierungssignal (KLS) am N- Terminus führt dazu, dass Nma111p in den Zellkern transloziert wird (Belanger et al. 2009).
Nma111p verbleibt auch unter umweltbedingtem Stress im Zellkern und wird nicht ins Cytosol entlassen (Belanger et al. 2009). Das mitochondrielle Homolog in vielzelligen Tieren, die Deg- Protease HtrA2/Omi wird unter Stressbedingungen ins Cytosol freigesetzt und unterstützt dort die Apoptose indem es inhibitorische Proteine, IAP (inhibitor of apoptosis protein) degradiert (Srinivasula et al. 2003). IAPs binden an Caspasen und inhibieren auf diese Weise die Apoptose direkt. IAPs besitzen typischerweise ein bis drei BIR (Baculovirus IAP repeat) – Domänen (Vaux und Silke 2005). In Hefe gibt es nur ein IAP-ähnliches Protein mit einer BIR-Domäne, das Bir1p, welches ein Substrat von Nma111p ist und abgebaut wird (Walter et al. 2006). Bei Überexpression von Nma111p wurde ein verstärkter proteolytischer Abbau von Bir1p beobachtet, wobei das Ser235 notwendig für die Spaltung von Bir1p war (Belanger et al. 2009).
Die physiologische Funktion von Nma111p in Hefe wird jedoch kontrovers diskutiert: zum einen wird Nma111p eine Apoptose-induzierende Aktivität zugesprochen (Fahrenkrog et al.
2004, Belanger et al. 2009), zum anderen wurde bei Nma111p eine thermoprotektive Funktion beobachtet (Padmanabhan et al. 2009). Neben der proteolytischen Aktivität weist Nma111p eine ATP-unabhängige und allgemein vorhandene Chaperonaktivität auf. Im Gegensatz zu den bakteriellen HtrA-Proteasen, deren Wechsel von Chaperon- zu Proteaseaktivität temperaturabhängig ist (Spiess et al. 1999), übernimmt Nma111p auch bei erhöhten Temperaturen Chaperonfunktion und verhindert die Aggregation von Proteinen (Padmanabhan et al. 2009). Bei Tong et al. (2006) wurde des Weiteren beschrieben, das Nma111p als Regulator im Fettsäure-Stoffwechsel beteiligt ist und die Fetthomöostase beeinflusst. In einer Hefemutante ohne Nma111p wurde ein Anstieg der Aufnahme von Fettsäuren, die Akkumulation von Triglyceriden in der frühen stationären Phase und freie Fettsäuren in der Zelle beobachtet. Ebenso wurde die Fettsäure-abhängige Genregulation verändert.
5. DEG-Proteasen in A. thaliana
Das Genom von A. thaliana, das für 16 Deg-Gene kodiert, weist eine erheblich größere Anzahl auf im Vergleich zu anderen Organismen wie E. coli mit drei, S. cerevisiae mit einer oder Säugetieren mit vier bis fünf Deg-Genen im Genom (Clausen et al. 2002, Kim und Kim 2005, Rawlings et al. 2008). Höhere Pflanzen können Stresssituationen nicht entfliehen und benötigen vermutlich zelluläre Mechanismen um eine Toleranz gegenüber umweltbedingtem Stress zu entwickeln. Es ist vorstellbar, dass Deg-Proteasen hierbei eine Rolle spielen (Schuhmann 2008), den Deg-Proteasen wird allgemein eine Beteiligung bei der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase und bei der Prozessierung von Proteinen zugesprochen.
Die 16 Deg-Proteasen in A. thaliana lassen sich in vier Gruppen unterteilen (Abb. 5), wobei die Einteilung auf Ähnlichkeiten in ihrer Domänenanordnung und auf Aminosäuresequenz-
Einleitung Analysen basieren (Helm et al. 2007). DEG1, 5, 8 und 14 bilden die Gruppe 1, da sie den HtrA- Proteasen aus Eukaryoten und Bakterien am ähnlichsten sind, die eine (menschliches HtrA2) oder zwei (E.coli DegP) PDZ-Domänen am C-Terminus neben der N-terminalen Proteasedomäne besitzen (Pallen und Wren 1997, Clausen et al. 2002). Gruppe 2 schließt mit 10 Vertretern die meisten Deg-Proteasen ein. Sie weisen eine putative PDZ-Domäne und einen verlängerten C-Terminus auf, der keinerlei Ähnlichkeit zu einem bekannten Protein besitzt (Helm et al. 2007). Alle Deg-Proteasen mit einem mitochondriellen oder chloroplastidären Transitpeptid gehören zu den Gruppen 1 oder 2 (Helm et al. 2007). Gruppe 3 beinhaltet nur eine Deg-Protease aus A. thaliana, nämlich DEG7, die doppelt so lang ist wie alle anderen Deg- Proteasen. Sie enthält neben den drei vorhergesagten PDZ-Domänen jeweils eine degenerierte Protease- und PDZ-Domäne (Helm et al. 2007). Die verbleibende Protease DEG15 ist die einzige in Gruppe 4 und besitzt keine erkennbare PDZ-Domäne und die Proteasedomäne ist zum C-Terminus hin verschoben (Helm et al. 2007).
Abb. 5: Einteilung der Deg-Proteasen aus A. thaliana in vier Gruppen basierend auf Analysen der Aminosäuresequenz und der Domänenanordnung (modifiziert von Helm et al. (2007))
Im Folgenden werden die Kenntnisse über die A. thaliana Deg-Proteasen hinsichtlich ihrer Lokalisierung und möglichen Rolle in der Zelle zusammengefasst und beschrieben:
5.1 DEG-Proteasen im Chloroplasten
Chloroplasten sind aus ehemaligen Endosymbionten entstanden und sind deshalb von einer äußeren und inneren Membran umgeben. Im Inneren der Chloroplasten, dem Stroma, ist ein internes Membransystem enthalten, die Thylakoide. Anhand ihrer Struktur lassen sich die Thylakoide weiter unterteilen in Grana-Stapel und Stroma-Lamellen (Schleiff und Becker 2011). Neben der Funktion der Photosynthese übernehmen Chloroplasten Funktionen bei der Synthese von Aminosäuren, Proteinen, Fettsäuren, Fetten, Vitaminen, Nukleotiden, Nukleinsäuren und sekundären Metaboliten. Weitere Funktionen sind die Assimilation von Stickstoff sowie die Reduktion und Assimilation von Schwefel (Joyard et al. 2010). Die chloroplastidären Deg-Proteasen sind die bisher am besten untersuchten, vor allem hinsichtlich ihrer Rolle beim Abbau photogeschädigter photosynthetischer Proteine und bei der Biogenese des Photosystems II (PSII) (Schuhmann und Adamska 2012). Insgesamt wurde für 5 Deg-
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Proteasen in A. thaliana eine chloroplastidäre Lokalisation vorhergesagt (Huesgen et al. 2005), wobei 3 im Thylakoidlumen (DEG1, 5 und 8) und eine im Stroma (DEG2) experimentell untersucht wurden. Bei DEG6 und DEG16 handelt es sich vermutlich um Pseudogene, da es bisher keinerlei Nachweis von Transkripten oder Proteinen gibt. Auch für DEG7 wurde eine Lokalisation im Stroma beschrieben, was aber in Widerspruch zu Sequenz-basierten Vorhersagen und den Ergebnissen dieser Arbeit steht (Sun et al. 2010).
5.1.1 DEG1, 5 und 8 im Thylakoidlumen
DEG1, die Deg-Protease, die als erste in Pflanzen untersucht und charakterisiert wurde, bildet Homooligomere aus (Itzhaki et al. 1998, Chassin et al. 2002). Die Kristallstruktur des DEG1- Hexamers wurde aufgeklärt, wobei das DEG1-Hexamer aus zwei übereinanderliegenden Trimer-Ringen besteht (Kley et al. 2011). Die Bildung des DEG1-Komplexes wird über den pH im Thylakoidlumen reguliert. DEG1 liegt in vitro als Monomer vor, wenn die Bedingungen basisch (pH 8) sind. Sinkt bei Belichtung der pH-Wert im Thylakoid-Lumen, kommt es unter pH 6 zur Oligomerisierung von DEG1 zu Hexameren. Auf diese Weise wird gewährleistet, dass DEG1 nur aktiv vorliegt, wenn Proteine aufgrund von photooxidativen Schäden abgebaut werden müssen (Kley et al. 2011). Es wurde beobachtet, dass DEG1 eine Reihe an luminalen Proteinen wie Plastocyanin und die Untereinheit PsbO des wasserspaltenden Komplexes von PSII abbaut und somit an der Proteinhomöostase im Thylakoidlumen beteiligt ist (Chassin et al.
2002). Das D1 Protein ist jedoch das Hauptsubstrat von DEG1, wenn es zu photooxidativen Schädigungen unter Starklichtverhältnissen kommt. Dabei spaltet DEG1 eine im Lumen- lokalisierte Proteinschleife des D1 Proteins (Abb. 6) (Kapri-Pardes et al. 2007). Neben der proteolytischen Aktivität agiert DEG1 auch als Chaperon und assistiert beim Zusammenbau und der Biogenese des PSII, indem es mit dem D2 Protein des Reaktionszentrums im PSII interagiert (Sun et al. 2010).
Die beiden luminalen Proteasen DEG5 (ohne PDZ-Domäne) und DEG8 (eine PDZ-Domäne) (Abb. 5) oligomerisieren im Verhältnis 1:1 zu einem Heterooligomer (Peltier et al. 2002, Schubert et al. 2002, Sun et al. 2007). DEG8 ist proteolytisch aktiv in Anwesenheit von photogeschädigtem D1 Protein des PSII Reaktionszentrums, wohingegen von DEG5 bisher keine Aktivität gezeigt werden konnte. Eine Beteiligung von DEG5/DEG8 am D1 Abbau wird postuliert, vermutlich spaltet der Komplex eine luminale Proteinschleife des D1 Proteins und trägt somit zum Abbau nach Schädigung bei (Abb. 6) (Sun et al. 2007). Unter Starklichtbedingungen kam es zur Inhibierung des Wachstums von ∆deg8- und ∆deg5- Knockoutmutanten sowie einer Doppelmutante, was einen weiteren Hinweis auf die Rolle bei der Reparatur des geschädigten PSII darstellt (Sun et al. 2007). Zusätzlich wurde für DEG5 eine Funktion während der Pflanzenentwicklung und dem Abbau der β-Untereinheit des Cytochrom b559 (PsbF Untereinheit) nach Verwundung festgestellt (Lucinski et al. 2011).
5.1.2 DEG2 im Stroma
Die auf der stromalen Seite an die Thylakoidmembran angelagerte DEG2-Protease besitzt zwei PDZ-Domänen (Abb. 5) (Haussühl et al. 2001). Unter Starklicht wird DEG2 an der Thylakoidmembran akkumuliert und ist am Abbau des photogeschädigten D1 Proteins des PSII- Reaktionszentrums beteiligt, indem eine ins Stroma-ragende Proteinschleife des D1 Proteins
Einleitung gespalten wird (Abb. 6) (Haussühl et al. 2001). Bisher wurden keine weiteren Thylakoidmembran-Proteine gefunden, die von DEG2 abgebaut werden. Die proteolytische Funktion von DEG2 wird Redox-abhängig reguliert, wobei DEG2 unter oxidierenden Bedingungen größere Aktivität aufweist (Stroher und Dietz 2008). Untersuchungen von ∆deg2 Knockoutmutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp unter Starklichtbedingungen keine phänotypischen Unterschiede hinsichtlich Wachstumsrate, Kinetik des D1-Abbaus, photosynthetischer Leistung oder der Fähigkeit, sich vom Stress durch Starklicht zu erholen (Huesgen et al. 2006). DEG2 gehört einem Netzwerk aus Enzymen an, die für die Proteinqualitätskontrolle im PSII mitverantwortlich ist (Huesgen et al. 2009). Lucinski et al.
(2011) beobachtete in einer ∆deg2 Knockoutmutante einen verminderten Abbau von Lhcb6 (Lichtsammelndes Protein im PSII) unter kurzzeitigem Salzstress, bei Verwundung, bei erhöhten Temperaturen sowie bei starker Bestrahlung mit Licht. DEG7, die untersuchte Deg- Protease in dieser Arbeit wird in Kapitel 6 detailliert vorgestellt.
Abb. 6: Modell des Abbaus von photogeschädigtem D1 Protein des PSII Reaktionszentrum unter Beteiligung von chloroplastidären Deg-Proteasen (Kapri-Pardes et al. 2007)
5.2 DEG15 im Peroxisom
Bei Peroxisomen handelt es sich um Organellen, die aus dem Endoplasmatischen Retikulum abgeschnürrt werden und die von einer einfachen Membran umgeben sind (Lanyon-Hogg et al.
2010). Sie übernehmen neben der ß-Oxidation von Fettsäuren auch Funktionen bei der Photorespiration, der Entgiftung von Wasserstoffperoxid sowie der Biosynthese von Pflanzenhormonen (Mano und Nishimura 2005). Peroxisomale Proteine sind im Zellkern kodiert und werden an cytosolischen Ribosomen synthetisiert (Lazarow und Fujiki 1985). Der Transport in die Peroxisomen erfolgt posttranlational über zwei bekannte Import-Systeme, für die eine jeweils spezifische Erkennungssequenz, eine Peroxisomale Transportsequenz (PTS) benötigt wird. PTS1 ist ein C-terminales Tripeptid (SKL), das nicht vom Protein abgespalten wird und PTS2 ein N-terminales Nonapeptid, das weniger konserviert ist wie das PTS1-Signal und dessen allgemeine Konsensus-Sequenz (R/K)(L/V/I)X5(H/Q)(LA) ist (Brown und Baker 2003). Das PTS2 wird jedoch nach erfolgreichem Import ins Peroxisom abgespalten (Lanyon-
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Hogg et al. 2010). A. thaliana enthält ausschließlich eine Deg-Protease, nämlich DEG15, in Peroxisomen (Schuhmann et al. 2008). Die Domänenanordnung ist im Vergleich zu den anderen Deg-Proteasen untypisch, denn die Proteasedomäne ist zum C-Terminus hin verschoben und es gibt keine PDZ-Domänen (Abb. 5) (Helm et al. 2007). DEG15 wurde in Wassermelone (Citrullus vulgaris) als Monomer und Dimer beschrieben (Helm et al. 2007).
Das normalerweise vorliegende Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer kann durch Zugabe von Ca2+ zur dimeren Form verschoben werden. Allgemein übernimmt das Monomer abbauende Funktion, während das Dimer eine prozessierende Aktivität erworben hat (Helm et al. 2007). In A. thaliana übernimmt DEG15 ebenfalls prozessierende Funktion am Präprotein der glyoxysomalen Malatdehydrogenase (gMDH) und weiteren Proteinen, die eine N-terminales PTS2 enthalten (Schuhmann et al. 2008). DEG15 in A. thaliana beeinflusst vermutlich die ß- Oxidation (Schuhmann et al. 2008), denn ∆deg15 Knockoutmutanten wiesen gegenüber einem nicht-toxischen Herbizid-Vorläufer, der durch die peroxisomale ß-Oxidation in ein toxisches Herbizid vewandelt wird, eine erhöhte Toleranz auf (Schuhmann et al. 2008).
5.3 DEG10 und DEG14 im Mitochondrium
Über die mitochondriellen Deg-Proteasen ist noch wenig bekannt (Schuhmann und Adamska 2012). Von den vorhergesagten sechs wurde die Lokalisation bisher von zwei, nämlich DEG10 und DEG14 über Fluoreszenzmikroskopie bestätigt (Huesgen et al. 2005, Huesgen 2007, Basak et al. 2014, Gasparic 2014). Über DEG3, 4, 11 und 12 gibt es bisher ausschließlich Microarray- Daten (Winter et al. 2007), die experimentell hinsichtlich ihrer Lokalisation und Funktion noch überprüft werden müssen (Schuhmann und Adamska 2012). Das mitochondrielle HtrA2/Omi in Säugetieren wird mit dem Einsetzen der Apoptose ins Cytosol entlassen und agiert dort als Vermittler der Apoptose (Verhagen et al. 2002). Neben der pro-apoptotischen Funktion von HtrA2/Omi wird eine Beteiligung bei der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase in Mitochondrien berichtet (Martins et al. 2004, Chao et al. 2008). Transkripte von A. thaliana DEG10 lagen erhöht vor nach einer Behandlung mit Inhibitoren der mitochondriellen Elektronentransportkette (Lister et al. 2004). Die Inhibierung der Elektronentransportkette führt zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und geschädigten Proteinen in Mitochondrien (Sweetlove et al. 2002). Eine Beteiligung von DEG14 bei der Thermotoleranz wurde erstmals von Larkindale und Vierling (2008) beobachtet. Verschiedene Stressbedingungen wie oxidativer Stress sowie der Einfluss von Metallen auf das Transkriptlevel von DEG14 wurden untersucht, aber ausschließlich unter Hitzestress kommt es zu einem Anstieg (Basak et al.
2014). Eine Funktion in der Proteinhomöostase wie bei HtrA2/Omi in Säugetieren konnte für DEG14 gezeigt werden und ist durchaus auch für DEG10 in A. thaliana möglich (Schuhmann und Adamska 2012, Basak et al. 2014).
5.4 DEG9 im Zellkern
Im Kapitel 7 wird ausführlich über den Aufbau und die Funktionen des Zellkerns berichtet.
Durch Proteom-Analysen gab es Hinweise, das DEG9 im Kernkörperchen lokalisiert ist (Pendle et al. 2005), was durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wurde (Erhardt 2012). Die physiologische Funktion von DEG9 ist noch nicht aufgeklärt, aber im Kernkörperchen findet
Einleitung hauptsächlich die Biogenese ribosomaler Untereinheiten statt. Es kann vermutet werden, dass DEG9 in diesen Prozess involviert sein könnte (Schuhmann und Adamska 2012).
6. DEG7, die in dieser Arbeit untersuchte Protease
DEG7 als einziger Vertreter in Gruppe 3 weist unter den DEG-Proteasen in A. thaliana ebenfalls wie DEG15 in Gruppe 4 eine ungewöhnliche Struktur auf (Helm et al. 2007, Schuhmann et al. 2011) (Abb. 7(B)). DEG7 und das Ortholog in Pilzen, Nma111p, sind im Vergleich zu den anderen Deg/HtrA-Proteasen fast doppelt so lang, was vermutlich auf einer internen Genduplikation beruht (Abb. 7(A)). In ihrer Domänenanordnung besitzen sie deshalb zwei Proteasedomänen, eine von den beiden liegt jedoch degeneriert vor und DEG7 weist bis zu vier PDZ-Domänen auf (Clausen et al. 2002). Nicht nur in Pilzen, sondern auch in grünen und heterokonten Algen, Haptophyten, Moosen und höheren Pflanzen wurden Gene für DEG7- ähnliche Proteasen identifiziert (Schuhmann et al. 2011). Augrund einer Intron-Beibehaltung existieren in A. thaliana sogar zwei Spleißvarianten von DEG7 (Hund 2010).
Abb. 7: Genduplikationsevent von DEG7 und der Vergleich der Domänenanordnung zum Ortholog in S. cerevisiae (Nma111p)
(A)DEG7 ist das Ergebnis einer Genduplikation eines Gens, das für eine gewöhnliche HtrA-Protease kodiert, mit anschließender Degeneration der zweiten Proteasedomäne. Die resultierende Domänenanordnung von DEG7 wurde schematisch dargestellt. (B) Anordnung der vorhergesagten Domänen und ihre Position in der Sequenz im Vergleich von DEG7 mit seinem Ortholog Nma111p in Pilzen. Die katalytische Triade in der Proteasedomäne wurde mit dem Einbuchstabencode der Aminosäuren (H:Histidin, D:Aspartat und S:Serin) und ihrer Position (Zahl) angegeben.
Die Aussagen über die subzelluläre Lokalsierung von DEG7 sind kontrovers. Bei Tanz et al.
(2014) wurde DEG7 in Mitochondrien und im Zellkern lokalisiert, während Sun et al. (2010) beschrieben haben, dass DEG7 in Arabidopsis im Stroma der Chloroplasten mit der Thylakoidmembran assoziiert sei. An isolierten Thylakoidmembranen, die mit Starklicht behandelt wurden, wurde beobachtet, dass nach Zugabe von rekombinantem DEG7, Proteine des PSII Komplexes (D1, D2, CP43 und CP47) degradiert wurden. Dies wurde so gedeutet, dass
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DEG7 am Abbau von Kernkomponenten des PSII beteiligt ist und damit zum PSII Reparaturzyklus beiträgt (Sun et al. 2010). Allgemein oligomerisieren Deg/HtrA-Proteasen als Grundeinheit zu Trimeren. Die Interaktion der Monomere zu Homo-Oligomeren wird durch die Proteasedomäne vermittelt (Krojer et al. 2002, Wilken et al. 2004). Auch DEG7 trimerisiert, wobei die Trimerbildung nicht durch die aktive sondern durch die zweite degenerierte Proteasedomäne vermittelt wird (Schuhmann et al. 2011). Bisher wurden noch keine Hinweise dafür gefunden, dass DEG7 Multimere ausbildet wie z.B. Hexamere bei DEG1 und DEG2.
7. Der Zellkern
Der Zellkern einer eukaryotischen Zelle wurde erstmals im 17.Jahrhundert unter einem Lichtmikroskop von Antonie van Leeuwenhoek entdeckt (Erhardt et al. 2010). Im Zellkern erfolgen hauptsächlich die Speicherung und Vermehrung der DNA sowie die Transkription der DNA in RNA und die Prozessierung von RNA (Shaw und Brown 2004). Das Karyoplasma wird durch eine doppelschichtige Kernhülle (nuclear envelope) vom Zytoplasma abgetrennt. Über die Kernhülle erfolgt ein dynamischer Austausch von Molekülen durch Kernporenkomplexe (NPC, von engl. nuclear pore complex), die die Kernhülle perforieren (Bui et al. 2013).
Kleinere Moleküle können frei durch die NPC diffundieren, während große Proteine nur durch die Kernhülle gelangen, wenn sie spezielle Import- oder Exportsignale tragen (Fahrenkrog und Aebi 2002). Im Karyoplasma ist ein Kernkörperchen enthalten, dessen überwiegende Funktion in der Transkription und Prozessierung der ribosomalen RNAs (rRNA) und dem Zusammenbau der Ribosomen-Untereinheiten besteht (Shaw und Brown 2004) (Abb. 8). Der Rest des Zellkerns ist aufgebaut aus chromatinhaltigen Bereichen, aus mehr oder weniger dicht gepacktem Chromatin (Shaw und Brown 2004) (Abb. 8). Ein weiteres Subkompartiment im Karyoplasma sind die „speckles“ (dt. Flecken), die in Abb. 8 nicht dargestellt sind. Speckles in Pflanzen weisen im Gegensatz zu tierischen Speckles Serin/Arginin (SR)-reiche Proteine auf, die Spleißfaktoren sind, die ein RNA-bindendes Motiv enthalten, und ein Teil des Spleißosoms darstellen. Sie sind somit an der Intron- und Exonerkennung beteiligt (Graveley 2000).
Abb. 8: Darstellung eines Zellkerns (modifiziert nach Shaw und Brown (2004))
Das Karyoplasma wird vom Zytoplasma durch eine doppelschichtige Kernhülle mit Kernporen vom Zytoplasma abgetrennt. Das Karyoplasma enthält neben dem Kernkörperchen noch die Chromosomen.
Einleitung 7.1 Import von Proteinen in den Zellkern
Bewegungen von Makromolekülen in und aus dem Zellkern heraus erfolgt durch den NPC. Der Transport von Proteinen durch die Zellkernhülle in beide Richtungen erfordert eine komplexe Regulation (Hicks und Raikhel 1995). Der Transport von Ionen und kleinen Proteinen (<
40 kDa) zwischen dem Zytoplasma und dem Kern durch NPCs kann durch passive Diffusion erfolgen. Der Transport von größeren Proteinen ist beschränkt und benötigt das Vorhandensein eines Kernlokalisierungssignals (KLS) (Fahrenkrog und Aebi 2002). Der klassische Zellkernimport-Zyklus beginnt im Zytoplasma indem Importin α das KLS eines Proteins erkennt und an das zu transportierende Protein bindet (Gorlich et al. 1994). Anschließend wird Importin β gebunden, welches die Interaktion mit dem NPC vermittelt, was zur Translokation in den Zellkern führt (Gorlich et al. 1995). Der Import-Komplex wird im Zellkern dissoziiert, indem Ran-GTP an Importin β bindet. Es kommt zu einer Änderung der Konformation von Importin β und somit zur Entlassung aus dem Komplex (Lee et al. 2005). Das Protein wird aus dem Importin α-Protein-Komplex in den Zellkern entlassen, indem das Nukleoporin Nup2 (Nup50/Npap60 in Vertebraten) (Matsuura et al. 2003, Matsuura und Stewart 2005) und ein Exportrezeptor dazu führen, dass Importin α recycelt und im Zytoplasma wieder zur Verfügung gestellt wird (Matsuura und Stewart 2004).
Die KLS haben einen hohen Anteil an basischen Aminosäuren wie Arginin und Lysin (Chelsky et al. 1989). Die klassischen KLS (cKLS) bestehen entweder aus einer einteiligen oder zweiteiligen kurzen Sequenz mit einem hohen Anteil an diesen basischen Aminosäureresten.
Der Prototyp einer einteiligen KLS wurde im großen T-Antigen des Affenvirus 40, Simian Virus 40 (SV40), (PKKKRKV) identifiziert (Kalderon et al. 1984) und zweiteilige am Nucleoplasmin (KRPAATKKAGQAKKKK) (Dingwall et al. 1988). In höheren Pflanzen wurden beide Arten von cKLS gefunden. Der Transkriptionsaktivator R aus Zea mays beispielsweise besitzt drei cKLS, zwei SV40-ähnliche und eine zweiteilige KLS, wobei zwei der drei KLS für den Import in den Zellkern in vivo benötigt werden (Shieh et al. 1993).
8. Dual lokalisierte Proteine: ein Protein in zwei Organellen
Während der Evolution wurden in eukaryotischen Zellen Endosymbionten aufgenommen, was zur Folge hatte, dass viele zelluläre Funktionen verdoppelt wurden. Diese wurden teilweise wieder reduziert, teilweise zwischen den Organellen verschoben oder sie blieben unverändert erhalten. Auf diese Weise kam es auch zur Entstehung von Enzym-Isoformen, die in zwei oder mehreren Kompartimenten vorkommen und zweifach lokalisiert wurden (Krause und Krupinska 2009). In höheren Pflanzen gibt es zunehmend Erkenntnisse über Proteine, die im Zellkern und in Mitochondrien oder Plastiden zu finden sind. Die dual lokalisierten Proteine in Pflanzen kommen überwiegend in den drei DNA-enthaltenden Kompartimenten vor und sind dort oft am DNA und RNA Metabolismus beteiligt (Small et al. 1998). Drei grundlegende Strategien für die duale Lokalisierung können unterschieden werden. Zum einen das twin targeting, bei dem zwei getrennte Signalsequenzen in einem Protein vorhanden sind und miteinander konkurrieren. Zum anderen mehrdeutige Signale (ambiguous targeting), die von verschiedenen Importkomplexen erkannt werden (Karniely und Pines 2005). Neben der Möglichkeit, dass ein Protein verschieden lokalisiert ist, gibt es auch die Variante, dass durch alternatives Spleißen eines Gens
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verschieden lokalisierte Protein-Isoformen entstehen. Von dem RNA-bindenden Protein cp31 aus A. thaliana gibt es beispielsweise durch differenzielles Spleißen des ersten Exons eine chloroplastidäre Isoform sowie ein Isoform im Zellkern (Ohta et al. 1995). Für ein duale Lokalisierung kann darüber hinaus eine posttranslationale Modifikation eines Proteins (Karniely und Pines 2005) oder ein Transport zwischen den Kompartimenten durch eine Vesikel- vermittelte Freisetzung verantwortlich sein. Rubisco containing bodies (RCBs) beispielsweise sind von einer Doppelmembran umgeben und im Zytoplasma oder in der Vakuole zu finden und bewahren die Ribulose-1,5-biphosphat Carboxylase (Rubisco) und andere stromale Proteine vor einem extraplastidären Abbau (Chiba et al. 2003). Ebenfalls beobachtet wurde ein Transfer von Stromaproteinen zwischen zwei Plastiden (Kwok und Hanson 2004).
9. Programmierter Zelltod
Nachdem bisher nur über die Aufrechterhaltung der Homöostase in einer Zelle berichtet wurde, wird in diesem Kapitel nun der programmierte Zelltod als Konsequenz auf chaotische Zustände durch Stress erläutert. Multizelluläre Organismen besitzen die Fähigkeit, überschüssige oder geschädigte Zellen, die während der normalen Entwicklung oder durch umweltbedingten Stress entstehen, zu eliminieren. Der zelluläre Prozess, der zum Abbau von unerwünschten Zellen führt, wird als programmierter Zelltod (PCD, in engl. programmed cell death) bezeichnet (Fomicheva et al. 2012). Die am besten untersuchte Form von PCD ist die Apoptose in Tieren, die durch verschiedene morphologische und biochemische Eigenschaften gekennzeichnet ist (Kerr et al. 1972), wobei bei Tieren Caspasen, eine Familie von sehr spezifischen Cysteinproteasen eine entscheidende Rolle in der Apoptose spielen (Nicholson und Thornberry 1997). Der programmierte Zelltod in Pflanzen übernimmt Funktionen bei der Entwicklung wie beispielsweise Xylembildung, Samenkeimung und Seneszenz sowie an der Antwort auf osmotischen und oxidativen Stress, an Hitzestress und an der Pathogenabwehr. Pflanzen besitzen ebenfalls wie Tiere zahlreiche Formen von PCD (Reape et al. 2008, Williams und Dickman 2008). Beide Reiche teilen gemeinsame Charakteristika wie u.a. DNA- Fragmentierung, Cytochrom c - Freisetzung aus Mitochondrien, Zellschrumpfung und Bildung von ROS (Reape und McCabe 2010). Die molekularen Mechanismen des pflanzlichen PCD sind bisher jedoch um einiges weniger untersucht worden als die der tierischen Apoptose. Da aber bei Tieren ähnliche morphologische Anzeichen vorliegen, würde dies einen ähnlichen molekularen Mechanismus bei Pflanzen implizieren. Deshalb ist es verwunderlich, dass Caspasen in Pflanzen nicht vorkommen (Fomicheva et al. 2012). Im Genom von A. thaliana und Reis wurde bei der Suche nach Caspase-Homologen keine Caspasen detektiert, trotz der Caspase-ähnlichen Aktivität, die während des pflanzlichen PCD beobachtet wurde. Erst nach intensiveren bioinformatischen Analysen wurde eine Familie von Proteasen gefunden, die entfernt ähnlich zu Caspasen sind: die Metacaspasen in Pflanzen, Pilzen und Protozoen (Uren et al. 2000). Aufgrund ihrer Struktur gehören Metacaspasen wie Caspasen zum Klan von Cystein- abhängigen Proteasen. Pflanzliche Genome enthalten bis zu 10 Gene für Metacaspasen (Tsiatsiani et al. 2011). Metacaspasen werden als Präproteine synthetisiert (Tsiatsiani et al.
2011), wobei die reife Metacaspase durch autokatalytische Prozessierung des Zymogens entsteht (Vercammen et al. 2004, Watanabe und Lam 2011). Metacaspasen hydrolisieren jedoch nicht die gleichen Peptidsubstrate wie Caspasen, da sie nicht hinter spezifischen Aspartatresten
Einleitung spalten, sondern Spezifität für Arginin- und Lysinreste aufweisen. Es kann festgestellt werden, dass Metacaspasen keine direkten Orthologe von Caspasen sind und neben dem programmierten Zelltod an weiteren Prozessen in Pflanzen beteiligt sind (Vercammen et al. 2004, Watanabe und Lam 2005, Vercammen et al. 2006).
Auch hinsichtlich morphologischer Charakteristika des PCD unterscheiden sich Pflanzen und Tiere. Sterbende, tierische Zellen bilden sogenannte „apoptotic bodies“ aus, die anschließend abgebaut werden durch phagozytierende Zellen um entzündliche Reaktionen zu verhindern.
Beim pflanzlichen programmierten Zelltod werden keine „apoptotic bodies“ gebildet, nicht nur aufgrund der Abwesenheit von phagozytierenden Zellen sondern auch wegen der starren Zellwand aus Zellulose und Lignin (Fomicheva et al. 2012). Der programmierte Zelltod in Pflanzen wurde anhand von morphologischen Eigenschaften in zwei Hauptarten unterteilt: der vakuoläre und der nekrotische Zelltod (van Doorn et al. 2011). Der vakuoläre Zelltod beinhaltet eine Autophagozytose der Vakuole begleitet mit einer Zunahme der Größe und der Freisetzung von Hydrolasen nach dem der Tonoplast geplatzt ist. Die Morphologie der Zellorganellen und die Integrität der Plasmamembran bleiben bis zum Moment des Zerreißens des Tonoplasts aufrechterhalten. Der vakuoläre Zelltod findet während der Entwicklung eines Organismuses statt. Der nekrotische Zelltod erfolgt hingegen nach abiotischem Stress und wird begleitet von schnellem Zerreißen der Plasmamembran, der Schrumpfung des Protoplasts, der Störung mitochondrieller Funktion und der Akkumulation von aktiven Sauerstoffen. Darüber hinaus gibt es programmierten Zelltod in Pflanzen als Reaktion auf eine Pathogeninfektion, die HR (hypersensitive response)-Antwort. Sie weist Anzeichen für nektrotischen als auch vakuolären Zelltod auf. Pflanzen besitzen im Gegensatz zu Tieren kein Immunsystem, das Pathogene und infizierte Zellen abwehren könnte. Pflanzen induzieren deshalb den Suizid infizierter und umgebender Zellen. Auf diese Weise wird die Reproduktion des Pathogens verhindert und eine Hindernis aus sterbenden Zellen aufgebaut, wodurch Pathogene wie Pseudomonas syringae vom gesunden Gewebe abgetrennt werden, da sie nur in lebenden Zellen überleben können (Dangl und Jones 2001, Lam et al. 2001).
9.1 Das Mycotoxin Fumonisin B1
Nekrotrophe phytopathogene Pilze synthetisieren ein breites Spektrum an phytotoxischen Komponenten wie u.a. spinghaninanaloge Mycotoxine (SAM), die produziert werden von zwei Gruppen von Pilzen, Alternaria and Fusarium spp. (Stone et al. 2000). Diese phytotoxischen Komponenten lösen den programmierten Zelltod einer Wirtszelle aus, indem ein Pathogen- Angriff simuliert wird. Die abgestorbenen pflanzlichen Zellen dienen anschließend der Ernährung der nekrotrophen Pilze. Fumonisin B1 (FB1) ist ein solches Mycotoxin von Fusarium moniliforme, welches den programmierten Zelltod in Pflanzen stimuliert und dazu führt, dass eine HR-Antwort auf einen Angriff durch Pathogene simuliert wird (Stone et al.
2000). Es kommt vermutlich zur kompetitiven Inhibierung der Sphinganin N-acetyltransferase (Ceramidsynthase), einem Schlüsselenzym in der Sphingolipid-Biosynthese (Wang et al. 1990, Abbas et al. 1994, Gilchrist et al. 1995). Ceramide sind wichtig für die Aktivierung von Stress- aktivierten Proteinkinasen und Phosphatasen bei der tierischen Stressantwort (Nickels und Broach 1996, Zhang et al. 1997). Das Signal für den Zelltod induziert durch SAMs wird vermutlich durch ein Ceramid-gekoppeltes System vermittelt (Merrill et al. 1993, Gilchrist et al.
Einleitung
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1995). Die Läsionen in A. thaliana als Antwort auf FB1 sind ähnlich wie die HR-Antwort auf avirulente Pathogene d.h. es kommt zur Akkumulierung von ROS, zur Ablagerung von phenolischen Verbindungen, zur Produktion von Phytoalexinen und zur Induktion der Expression von Genen, die an der Abwehr beteiligt sind (Stone et al. 2000).
10. Modellorganismus: Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana gehört zur Familie der Kreuzblütler (Brassicaceae) und wird aufgrund von zahlreichen Gründen als Modelorganismus in der Pflanzengenetik verwendet. Sie ist weltweit in den gemäßigten Klimazonen zu finden, kommt dabei aber durchaus in klimatisch sehr verschiedenen Habitaten vor (Meyerowitz 1987, Meinke et al. 1998). Es stehen verschiedene Ökotypen, die von verschiedenen Populationen gesammelt wurden, zur Verfügung. Columbia und Landsberg sind die beiden Ökotypen, die hauptsächlich für genetische und molekulare Studien verwendet werden (Meinke et al. 1998). Physiologisch zeichnet sich die Pflanze durch ihre geringe Größe und eine kurze Generationszeit aus, was für die Anzucht im Gewächshaus von Vorteil ist. Der Lebenszyklus beginnend mit der Keimung der Samen, über die Ausbildung der Rosette und des Haupttriebs bis zum Blühen und schließlich der Reifung der ersten Samen dauert ungefähr sechs Wochen, wobei die Anzahl der gebildeten Samen pro Pflanze groß ist.
Die Samen können dann für lange Zeit gelagert werden (Meinke et al. 1998). A. thaliana vermehrt sich durch Selbstbestäubung und kann im Labor kreuzbestäubt werden (Meyerowitz 1987). Ein weiterer Vorteil ist, dass das Genom von A. thaliana, das aus fünf Chromosomen besteht, mit 157 Mbp zu den kleinsten pflanzlichen Genomen gehört und als erstes Genom einer Pflanze bis zum Jahr 2000 fast vollständig sequenziert wurde (Meinke et al. 1998, AGI 2000, Bennett et al. 2003). Der größte Nachteil von A. thaliana besteht darin, dass zur Untersuchung der Funktion eines Genes das Gen nicht durch homologe Rekombination gezielt deletiert oder modifiziert werden kann (Ostergaard und Yanofsky 2004). Mutanten werden durch zufällig erfolgende Insertion von T-DNA (transferred DNA) im Genom, vermittelt durch Agrobacterium tumefaciens, generiert. Der mutierte Lokus wird anschließend mittels PCR-basierten Verfahren bestimmt (Ostergaard und Yanofsky 2004). Eine Komplikation der Mutagenese vermittelt durch A. tumefaciens ist, dass im Durchschnitt 1,8 Kopien der T-DNA ins Genom inseriert werden (Weigel und Glazebrook 2002), d.h. dass in einer Insertionslinie nicht nur ein spezifisches Gen eine T-DNA enthält, sondern meist auch ein weiteres unbekanntes Gen. Für phänotypische Analysen müssen die Insertionslinien deshalb rückgekreuzt werden, um sicherzustellen, dass ausschließlich in dem untersuchten Gen eine T-DNA inseriert ist. Um die Funktionen der Gene zu enträtseln wurden deshalb großangelegte Projekte gestartet um cDNA-Klon-Kollektionen und T-DNA Insertionsmutanten-Kollektionen herzustellen, die die Mehrzahl an Protein- kodierenden Genen enthalten (Seki et al. 2002, Sessions et al. 2002, Alonso et al. 2003, Rosso et al. 2003). Die cDNA-Klone und T-DNA Insertionslinien wurden gesammelt, überprüft und in Zentren wie ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, Ohio, USA) oder NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Center) aufgelistet und stehen dort zur Verfügung. Des Weiteren gibt es über A. thaliana auf dem „eFP browser“ Daten über die Expression aller Gene in verschiedenen Geweben und Organen, während verschiedenen Entwicklungsstadien und nach Induktion von abiotischem und biotischem Stress (Schmid et al. 2005, Wellmer et al. 2006).
Insgesamt wird die Menge an Daten verwaltet und organisiert von TAIR (The Arabidopsis
